Name: Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Scopri il monitoraggio in tempo reale dell'auto-assemblaggio di nanocomplessi DNA combinando QD-FRET e microfluidica. Questo metodo integra nanofotonica e microfluidica per studiare polielettroliti utili alla terapia genica.

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A. biotinilazione del DNA DNA plasmidico sono state covalentemente biotinilato con guanina-specifiche etichette biotina, come descritto dal produttore (Mirus Bio, Madison, WI), ma in scala di avere ~ 1-2 etichette biotina al DNA. DNA plasmidico (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) è stato etichettato in questo protocollo. <ol><li> Sciogliere quantità desiderata di PDNA in TE buffer di DNasi e senza RNasi-free (biologia molecolare-grado di qualità) di acqua per ottenere una soluzione 1μg/μL DNA. </li><li> Condurre la reazione di marcatura usando le miscele di reazione seguente. Aggiungere l&#39;etichetta IT reagente scorso. </li></ol> Per reazione il DNA 100μg: <table border="1"><tbody><tr><td> DNasi RNasi-free e senza acqua </td><td> 75 microlitri </td></tr><tr><td> Etichettatura Buffer 10X A </td><td> 20 l </td></tr><tr><td> 1μg/μL DNA </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Etichetta IT reagente </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 200 l </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Incubare la reazione a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Purificare il campione etichettato da etanolo o isopropanolo precipitazione seguenti protocolli standard. </li></ol> Nota: le colonne di filtrazione gel a base può portare ad assorbimento UV ad alta o fluorescenza di fondo, che possono influenzare la quantificazione del DNA o la caratterizzazione fluorescenza. Nota: Il livello di biotinilazione può essere determinata da HABA a base di test. B. Etichettatura dei Cy5-polimeri cationici Chitosano (390 kDa, 83,5% deacetilata, Vanson, Redmond, WA) è stato utilizzato come modello di un polimero cationico in questo studio. Le ammine primarie libero sulla dorsale chitosano polimero sono stati etichettati con Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). <ol><li> Per facilitare la coniugazione completa di Cy5 colorante, calcolare in modo tale che il rapporto molare tra Cy5 la quantità richiesta di Cy5-SSN: ammine primarie è di 1: 200. </li><li> Regolare il pH della soluzione di chitosano (in tampone acetato 25mM) per ~ 6,5 con l&#39;aggiunta di NaOH. Si noti che la reazione NHS è più efficiente a pH basico, ma la solubilità del chitosano qui limita l&#39;intervallo di pH di lavoro. </li><li> Sotto agitazione, aggiungere lentamente la quantità calcolata di Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) alla soluzione chitosano in una goccia a goccia modo. </li><li> Agitare la miscela al buio a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Per purificare, Dializzare con 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) per 2 ore contro tampone acetato 1% a temperatura ambiente al buio. </li><li> Sostituire il tampone e Dializzare altre 2 ore a temperatura ambiente al buio. </li><li> Sostituire il tampone e Dializzare notte a 4 ° C al buio. </li><li> Conservare purificato etichettati polimero a -20 ° C. </li></ol> Nota: In questo studio, una curva standard è costruito misurando l&#39;intensità di emissione di Cy5-NHS estere a 670 nm. Caratterizzano la densità etichettatura misurando l&#39;emissione ottenuti a 670 nm da Cy5 marcato chitosano nella curva standard. Assorbanza può anche essere usato per determinare l&#39;efficienza etichettatura, ma non è stato eseguito qui. Preparazione C. QD marcato DNA e Cy5-Polymer Il rapporto molare di PDNA di QD è stato mantenuto in eccesso (PDNA: QD ≈ 1: 2) per garantire la coniugazione completa di QD di PDNA. Il numero di QD etichetta su ogni PDNA può essere stimata attraverso immagini TEM o altre strutture equivalenti. Nel nostro studio, il numero di QD per PDNA è stimato in ~ 1-3 da TEM e spettroscopia di singola molecola. 1 Utilizzare Millipore Milli-Q acqua pendenza (&gt; 18,0 MW, 0.2um filtrata) durante la preparazione. <ol><li> Calcolare la quantità di chitosano per 10μg PDNA secondo desiderato N / P, il rapporto teorico di ammine protonate nella soluzione di chitosano per i fosfati negativo nella soluzione del DNA. </li><li> Aggiungi streptavidina-funzionalizzati 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) nella soluzione biotinilato PDNA. </li><li> Incubare la soluzione a temperatura ambiente al buio per 15 min. </li><li> Aggiungere il QD marcato DNA in 50 mM soluzione di solfato di sodio per rendere il volume finale 200μL. </li><li> Diluire Cy5-chitosano, secondo desiderato N / P, con acqua Milli-Q per rendere il volume finale 200μL. </li></ol> Nota: Tenere la reazione di scuro per impedire alla photobleaching possibile. Importante: Siate cauti di utilizzare il Qdot 605 ITK ™ streptavidina coniugato (la serie ITK), come Punti quantici in questo catalogo sono progettati per lo scopo di FRET. La serie Qdot regolari sono coniugati con uno strato PEG per evitare legame non specifico, in particolare per l&#39;etichettatura cellulare. Tuttavia, questa ulteriore rivestimento allarga il donatore-accettore distanza, con conseguente reduced trasferimento di efficienza energetica. D. Realizzazione della SU-8 Masters Utilizzando Fotolitografia standard <ol><li> Wafer di silicio è piranha pulito e cotto a 200 ° C per 5 min. </li><li> Per lo spessore di 25 micron padrone designato, cappotto girare il photoresist negativo (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) su wafer di silicio a 2000 rpm per 30 sec. </li><li> Morbido cuocere la cialda su una piastra con una rampa di 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Esporre ai raggi UV (365nm) per 250mJ/cm 2 a un film maschera (CAD / Servizi Arte, Bandon, OR) contenente la progettazione di microcanali. </li><li> Post-esposizione cuocere la cialda su una piastra con una rampa di 65 ° C / hr a 95 ° C. </li><li> Sviluppare il wafer utilizzando SU-8 sviluppatore photoresist. </li><li> Il wafer fantasia è duro cotta su una piastra con una rampa di 65 ° C / hr a 200 ° C. Mantenere il wafer a 200 ° C per almeno 5 ore, poi gradualmente raffreddare la cialda a temperatura ambiente. </li></ol> Importante: rampa graduale durante il SU-8 processo di cottura master è necessario, altrimenti il SU-8, la struttura può staccato dal wafer di silicio o crepe sulla struttura di SU-8 può essere indotta da stress-release. E. Stampaggio Replica del PDMS dai maestri e l&#39;adesione al vetro di copertura <ol><li> Il SU-8 master è posto in una barca di pesatura. </li><li> Mix di silicone elastomero e catalizzatore (Poly (dimetilsiloxano), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) in un 10: 1 rapporto. </li><li> Versare il composto PDMS sul SU-8 master e lasciare la barca pesa in un essiccatore a vuoto per rimuovere le bolle. </li><li> Curare il PDMS a 65 ° C per 1-2 ore. </li><li> Sbucciare la striscia PDMS dallo stampo maestro Si. </li><li> Punch insenature canale e uscite del dispositivo fluidica. </li><li> Pulire la striscia di PDMS e vetro di copertura con etanolo e poi asciugare all&#39;aria. </li><li> Trattare la pulizia PDMS striscia di vetro e coprire con plasma di ossigeno (20 W per 1 minuto). </li><li> Immediatamente la striscia PDMS legame con il vetro di copertura. </li><li> Lascia il chip incollato microfluidica in forno a 95 ° C per una notte. </li></ol> Importante: il trattamento al plasma e da forno durante la notte sono essenziali per la forza di legame maggiore. F. Monitorare la formazione di DNA Nanocomplexes Nel dispositivo a microfluidi <ol><li> Riempire il canale microfluidica con acqua (per assicurarsi che ci sia assenza di bolle all&#39;interno del canale microfluidica), prima di caricare i reagenti per assicurare un flusso regolare durante l&#39;esperimento. </li><li> Caricare il DNA QD-etichettati e marcati con Cy5 soluzioni di chitosano in due siringhe di vetro singolo, attraverso il tubo descritto nel video. </li><li> Collegare il tubo con le due insenature di dispositivi microfluidici. Essere cauti a non introdurre aria durante il processo. Impostare la velocità di flusso a 20nL/min (PHD-2000 pompa a siringa, Holliston, MA), in condizioni di flusso laminare. </li><li> Controllare la microcanali sotto il microscopio. </li><li> Quando il flusso è stabile (~ 15 a 20 minuti), QD-mediata FRET devono essere osservate al centro del canale. </li><li> Scatta foto di fluorescenza (CCD raffreddata, Qimaging, BC, Canada) in luoghi diversi lungo il canale. </li><li> Analizzare le immagini a fluorescenza con ImageJ e OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. QD-FRET fornisce un&#39;indicazione sensibile l&#39;insorgenza di Nanocomplexes DNA auto-assemblaggio <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Quantum dot-mediato trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (QD-FRET) in grado di fornire una indicazione quantitativa e altamente sensibile di stabilità Polyplex sia in ambienti extra o intra-cellulari, permettendo per la rilevazione inequivocabile l&#39;inizio delle interazioni tra il DNA e il vettore genico. Il FRET coppia, 605QD e Cy5, è stato scelto sulla base di massimizzare sovrapposizione spettrale tra il donatore e accettore e riducendo al minimo il potenziale cross-talk. Per questa coppia, la distanza di Förster è 69.4Å 3. </li><li> Auto-assemblaggio del QD-FRET nanocomplexes DNA. Anionici DNA plasmidico (PDNA) e il vettore gene cationici sono stati etichettati con QD (donatore di energia) e Cy5 (energia accettore), rispettivamente. QD-FRET nanocomplexes si sono formati attraverso elettrostatiche coacervazione complessi. Al momento di eccitazione a 488 nm, QD-FRET-mediata Cy5 emissione indicati formazione di un nanocomplex compatta e intatta. Il tempo di permanenza (t R) può essere calcolato in base alla distanza (x) che misura, da dove i due flussi si incontrano per la posizione di reazione sotto inchiesta, e la velocità di flusso medio (v). A causa della natura del flusso laminare, la miscelazione avviene esclusivamente a livello di interfaccia (centro di ogni immagine), che consente il calcolo preciso di trasporto di massa in funzione di t R. Risoluzione temporale può essere regolata variando la applied portate. (Interno) FRET-mediata segnale è stato osservato immediatamente a livello di interfaccia, quando i due corsi d&#39;acqua ha incontrato, a indicare che il legame è stato rapido, che si verificano in pochi millisecondi in base ai tassi di flusso applicati. Scala Bar: 100μm. </li></ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

<ul><li> Significato del nostro lavoro: <ol><li> Questo è il primo tentativo di monitorare polimerici DNA nanocomplex auto-assemblaggio cinetica in tempo reale (millisecondi risoluzione) attraverso QD-FRET risposte all&#39;interno di un chip semplice microfluidica. </li><li> QD-mediata FRET fornisce un&#39;indicazione molto sensibile e quantitativa l&#39;insorgenza di interazioni molecolari e in tutto il processo di self-assembly, mentre microfluidica offre una ben controllata microambiente per analizzare spazialmente il processo durante la sintesi del DNA nanocomplex. </li><li> L&#39;integrazione di microfluidica e nanofotonica suggerisce un approccio nuovo e interessante per indagare su qualunque tipo di reazioni di complessazione. </li><li> La risultante QD-FRET nanocomplexes DNA polimerici potrebbe essere facilmente applicato per stabilire relazioni struttura-funzione. 1,2 </li></ol></li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide DNA</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4,9 kb, PM = 3,3 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT Biotin Labeling Kit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>Il protocollo standard fornisce un'efficienza di marcatura di circa un marcatore ogni 20-60 paia di basi di DNA a doppio filamento; la densità di marcatura è stata regolata in questo studio.</td></tr><tr><td>Streptavidina 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; Streptavidin Conjugate</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-NHS Ester</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>Chitosano</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>Deacetilato all'83,5%</td></tr><tr><td>Vetro Coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>No. 1; Dimensioni: 40 x 22 mm</td></tr><tr><td>Siringa in Vetro Ermetica</td><td>Hamilton Co</td><td>Serie TLL</td><td>50&amp;#x03BC;L a 500&amp;#x03BC;L a seconda del volume del campione</td></tr><tr><td>Tubazione Tygon</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0,02 ID, 100 ft</td><td>Tubi Tygon Microbore, 0,02 ID, 100 ft</td></tr><tr><td>Connettore</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>Personalizzato nella lunghezza di 0,750&quot;</td></tr><tr><td>Pompa per Siringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Intensified Retiga Cooled</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>Lampada a arco al mercurio da 100 W</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Versione Studente</td><td></td></tr><tr><td>Set di Filtri per Microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>Filtro di eccitazione in entrambi i canali</td></tr><tr><td>Set di Filtri per Microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>Filtro di emissione nel canale 605QD</td></tr><tr><td>Set di Filtri per Microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>Filtro di emissione nel canale QD-FRET</td></tr><tr><td>Set di Filtri per Microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>Dicroico passa-alto nel canale 605QD</td></tr><tr><td>Set di Filtri per Microscopio</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>Dicroico passa-alto nel canale QD-FRET</td></tr></tbody></table>

combinando qd-fret e microfluidica per il monitoraggio nanocomplex dna di auto-assemblaggio in tempo reale

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

I progressi nella genomica continuano ad alimentare lo sviluppo di terapie che possono bersaglio patogenesi a livello cellulare e molecolare. Tipicamente funzionale all&#39;interno della cellula, acidi nucleici terapie a base richiedono un efficiente sistema di distribuzione intracellulare. Un metodo ampiamente adottato è quello del DNA complesso con un vettore gene per formare nanocomplexes tramite auto-assemblaggio elettrostatico, facilitando l&#39;assorbimento cellulare di DNA, mentre la protezione contro la degradazione. La sfida consiste nella progettazione razionale dei vettori gene efficiente, dal momento prematuro dissociazione o eccessivamente vincolante stabile sarebbe dannoso per la captazione cellulare e l&#39;efficacia terapeutica. Nanocomplexes sintetizzato mescolando di massa ha mostrato una vasta gamma di comportamenti intracellulari disimballaggio e il traffico, che è stata attribuita alla eterogeneità di dimensioni e la stabilità del nanocomplexes. Tale eterogeneità ostacola la corretta valutazione del self-assembly cinetica e aggiunge alla difficoltà di correlare le loro proprietà fisiche di efficienza di trasfezione o bioactivities. Vi presentiamo una convergenza romanzo di nanofotonica (cioè QD-FRET) e microfluidica per caratterizzare in tempo reale cinetica del nanocomplex self-assembly sotto flusso laminare. QD-FRET fornisce un&#39;indicazione molto sensibile della insorgenza di interazioni molecolari e misura quantitativa per tutto il processo di sintesi, mentre microfluidica offre una ben controllata microambiente per analizzare spazialmente il processo con alta risoluzione temporale (~ millisecondi). Per il sistema modello di nanocomplexes polimerici, due fasi distinte nel processo di auto-assemblaggio sono stati catturati da questa piattaforma analitica. L&#39;aspetto cinetico del processo di auto-assemblaggio presso la microscala sarebbe particolarmente utile per microreattore basato reazioni che sono rilevanti per molte applicazioni micro-e nano-scala. Inoltre, nanocomplexes può essere personalizzato attraverso la corretta progettazione di dispositivi microfludic, e la conseguente QD-FRET nanocomplexes DNA polimerici può essere facilmente applicato per stabilire relazioni struttura-funzione.

Vi presentiamo un nuovo e potente integrazione di nanofotonica (QD-FRET) e microfluidica per studiare la formazione di polyplexes polielettrolita, che si prevede di fornire un migliore controllo e la sintesi di polyplexes uniforme e personalizzabili per i futuri nucleici terapie a base di acido.

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

I progressi nella genomica continuano ad alimentare lo sviluppo di terapie in grado di colpire la patogenesi a livello cellulare e molecolare. Tipicamente...

Questa procedura inizia con l'etichettatura del DNA e del polimero per generare un plasma di perle di DNA QD (punti quantici) in cui il DNA è coniugato con punti quantici, il donatore di energia, e il polimero ionico è etichettato con un colorante organico Flora Four Sci Five, l'accettore di energia.Mescolando QD fret, si formano complessi nano grazie all'autoassemblaggio elettrostatico e il segnale FRET mediato da QD può quindi essere monitorato durante lo svolgimento dell'interazione. Questo sistema QD fret viene introdotto in un canale microfluidico in cui i componenti interagiranno soltanto per diffusione all'interfaccia di miscelazione. L'autoassemblaggio del complesso nano di DNA può quindi essere monitorato combinando QD fret e microfluidica.Ciao, sono Megan Ho del laboratorio di Bios e dinamica di singole molecole del Dipartimento di Ingegneria Meccanica della Johns Hopkins University. Oggi vi mostreremo un procedimento per combinare la minaccia quantistica e la microfluidica al fine di monitorare in tempo reale l'autoassemblaggio del chiodo di DNA. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questo procedimento per studiare complessi DNNL per la localizzazione della terapia genica.Iniziamo. Un kit di etichettatura con biotina di MIRIs bio viene utilizzato per etichettare covalentemente il DNA plasmatico con marcatori di biotina specifici per la guanina, ma dosato in modo da avere circa uno o due marcatori di biotina per ogni molecola di DNA. Per iniziare, sciogliere la quantità desiderata di DNA plasmatico in tampone TE per ottenere una soluzione di DNA da un microgrammo per microlitro.Impostare la reazione di marcatura mescolando il plasma D-N-A-D-N-A libero e acqua libera da RNA, buffer di marcatura 10x A e il reagente label it. Il reagente label it viene aggiunto per ultimo. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora.Dopo l'incubazione di un'ora, purificare il campione marcato mediante precipitazione con etanolo. Seguendo protocolli standard. Conservare il DNA marcato a meno 20 gradi Celsius fino all'uso.Il passo successivo consiste nell'etichettare il polimero ionico. In questa dimostrazione, utilizzeremo la chitosana come polimero ionico modello ed etichetteremo le ammine primarie libere sullo scheletro del polimero di chitosana con sci-fi NHS. Calcolare innanzitutto la quantità richiesta di scifi NHS in modo che il rapporto molare tra scifi e ammine primarie sia di 1 a 200. Ciò faciliterà la completa coniugazione del colorante scifi.Aggiungere idrossido di sodio alla soluzione di chitosano in tampone acetato 25 millimolare per regolare il pH a circa 6,5, mescolando lentamente; aggiungere quindi la quantità calcolata di sci-fi NHS alla soluzione di chitosano, goccia a goccia. Coprire il vial con della pellicola di alluminio per mantenere la miscela al buio e agitare a temperatura ambiente per tutta la notte. Il giorno successivo, purificare la miscela mediante dialisi utilizzando una membrana da 10 K-M-W-C-O di pierce contro tampone acetato 1%, effettuando la dialisi per due ore a temperatura ambiente al buio.Dopo due ore, sostituire il tampone acetato all'1% e dializzare per altre due ore. A temperatura ambiente e al buio, sostituire nuovamente il tampone e dializzare tutta la notte a quattro gradi Celsius al buio. Il giorno successivo, rimuovere il polimero marcato purificato dalla cassetta di dialisi.Il chitosano marcato SCI viene quindi raccolto in una provetta da microcentrifuga e conservato a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere i punti quantici 605 funzionalizzati con streptavidina alla soluzione di DNA plasmidico biotinilato. Assicurarsi di utilizzare la serie ITK di punti quantici rivestiti appositamente coniugati, anziché la serie standard di punti quantici, poiché i punti quantici della serie ITK sono progettati per l'uso in esperimenti di FRET.Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti. Mantenere la reazione di marcatura con punti quantici al buio per prevenire un eventuale sbiancamento fotoindotto. Dopo 15 minuti, aggiungere il DNA marcato con punti quantici a una soluzione di solfato di sodio 50 millimolare per ottenere un volume finale di 200 microlitri.Per preparare il polimero sci-fi, calcolare la quantità richiesta di chitosano per 10 microgrammi di DNA plasmidico in base al rapporto NP desiderato, ovvero il rapporto teorico tra gli ioni protonati nel soluzione di chitosano e i gruppi fosfato negativi nella soluzione di DNA. Diluire il chitosano sci-fi secondo il rapporto NP desiderato con acqua Milli Q per ottenere un volume finale di 200 microlitri. Le soluzioni di DNA marcato con QD e di chitosano sci-fi sono ora pronte per essere caricate nel dispositivo microfluidico, come verrà dimostrato nella sezione sei. La wafer di silicio è stata preparata in precedenza mediante pulizia con piranha e asciugatura in forno per rimuovere l'umidità sulla superficie, per uno spessore master designato di 25 micrometri. Applicare il fotoresist negativo sulla wafer di silicio mediante spin-coating a 2000 giri al minuto per 30 secondi.Effettuare una cottura leggera della wafer su una piastra riscaldante con un incremento di temperatura di 65 gradi Celsius all'ora fino a 95 gradi Celsius. Questo processo farà evaporare il solvente nel fotoresist SU eight e lo solidificherà prima dell'esposizione alla luce UV.Dopo la cottura soft, applicare un film maschera contenente il disegno dei microcanali sul wafer di silicio esposto alla luce UV a 365 nanometri per 250 millijoule per centimetro quadrato dopo l'esposizione. Cuocere il wafer su una piastra riscaldata con un incremento di 65 gradi Celsius all'ora fino a 95 gradi Celsius. Sviluppare il wafer utilizzando il riveler SU eight Photoresist per verificare uno sviluppo completo.Immergere la wafer nell'alcol isopropilico. L'alcol isopropilico non deve diventare opaco. Infine, per rafforzare la struttura SU-8, effettuare una cottura di indurimento della wafer stampata su una piastra riscaldante con un gradiente di 65 gradi Celsius all'ora fino a 200 gradi Celsius.Mantenere la wafer a 200 gradi Celsius per almeno cinque ore. Successivamente, raffreddare gradualmente la wafer fino alla temperatura ambiente. Posizionare il master SU otto in un contenitore per pesata.Mescolare l'elastomero di silicone e l'agente indurente poli dimetil silossano o PDMS in un rapporto di 10 a 1. Versare la miscela di PDMS sul master SU-8 e lasciare il contenitore su una bilancia in un essiccatore sotto vuoto per rimuovere le bolle d'aria. Indurire il PDMS a 65 gradi Celsius per uno o due ore.Dopo la polimerizzazione del PDMS, staccare la striscia di PDMS dallo stampo master in silicone utilizzando un punch circolare, con due ingressi di canale e un'uscita di canale per il dispositivo fluidico. Pulire la striscia di PDMS e il vetrino con etanolo e quindi farli asciugare all'aria. Trattare la striscia di PDMS e il vetrino puliti con plasma di ossigeno a 20 watt.Per prima cosa, incollare immediatamente la striscia di PDMS al vetrino. Lasciare il chip microfluidico incollato in forno a 95 gradi Celsius per tutta la notte. Il trattamento al plasma e la cottura notturna sono essenziali per migliorare la resistenza dell'incollaggio.Prima di caricare i reagenti, riempire il canale microfluidico con acqua per assicurarsi che non vi siano bolle al suo interno. Questo garantirà un flusso regolare. Durante l'esperimento, caricare le soluzioni di QD precedentemente preparati, DNA marcato e chitosano marcato sci-fi in due siringhe di vetro singole attraverso il tubo.Collegare il tubo ai due ingressi del dispositivo microfluidico. Prestare attenzione a non introdurre aria durante l'operazione. Impostare la portata a 20 nanolitri al minuto in condizioni di flusso laminare.Controllare i microcanali al microscopio quando il flusso è stabile, dopo circa 15-20 minuti. Il trasferimento di risonanza energetica mediato da punti quantici (QD) dovrebbe essere osservato al centro del canale. Acquisire immagini fluorescenti in diverse posizioni lungo il canale mediante una telecamera CCD raffreddata.Analizzare queste immagini con ImageJ e OriginLab. Il segnale mediato da FRET viene monitorato a diverse posizioni assiali lungo il canale. Il tempo di permanenza viene calcolato in base alla portata applicata utilizzando questa formula, in cui TISA bar è il tempo di permanenza.Il tempo X è la distanza tra il punto in cui i due flussi si incontrano e la posizione della reazione oggetto di studio. E V è la velocità media del flusso. I profili di intensità trasversali dei segnali sci-fi mediati da fret possono quindi essere analizzati nel nostro sistema.I profili misurati sperimentalmente mostrano una distribuzione gaussiana. Vi abbiamo appena mostrato come monitorare i complessi di DNA nail attraverso un filamento mediato quantisticamente in un semplice canale microfluidico. Quando si eseguono queste procedure, è importante ricordare di progettare un marcatore sul proprio canale microfluidico in modo che il tempo di residenza possa essere determinato direttamente sulla base della portata applicata e della geometria del canale.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l'integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Questo video descrive un metodo per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su molecole di DNA in loci specifici utilizzando l'imaging a singola molecola. Questi condensati si formano a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, che consentono il reclutamento della RNA polimerasi II e una migliore trascrizione genica.

Imaging di una singola molecola per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su tende di DNA

Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

Vi presentiamo un biochip elettrochimico basato microfluidica-per la rilevazione ibridazione DNA. A seguito di ssDNA sonda funzionalizzazione, la specificità, sensibilità, e il limite di rilevazione sono studiati con obiettivi ssDNA complementari e non complementari. I risultati illustrano l'influenza degli eventi di ibridazione DNA sul sistema elettrochimico, con un limite di rilevazione di 3,8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Proponiamo una semplice tecnica di auto-assemblaggio di nanoparticelle colloidali di silice per creare una giunzione nanofluidica tra due microcanali in polidimetilsilossano (PDMS). Utilizzando questa tecnica, una membrana a microsfere nanoporose con una dimensione dei pori fino a ~ 45 nm è stata costruita all'interno di un microcanale e applicata alla preconcentrazione elettrocinetica di campioni di DNA.

Creazione di Sub-50 Nm nanofluidic giunzioni in PDMS Microfluidic Chip tramite processo di auto-assemblaggio di particelle colloidale

Cella singola sequenza rivela eterogeneità genotipica nei sistemi biologici, ma le attuali tecnologie mancano la velocità effettiva necessaria per la profonda analisi della funzione e della composizione della Comunità. Qui, descriviamo un workflow di microfluidica per sequenziamento &gt; 50.000 unicellulare genomi da diverse popolazioni cellulari.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Utilizzando il DNA marcato con punti quantici e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale, possiamo studiare il meccanismo di reazione delle endonucleasi di restrizione utilizzando proteine non marcate. Questa tecnica a singola molecola consente l'osservazione massicciamente multiplexata delle singole interazioni proteina-DNA e i dati possono essere raggruppati per generare distribuzioni del tempo di permanenza ben popolate.

Analisi del tempo di permanenza di una singola molecola della scissione del DNA mediata da endonucleasi di restrizione

Qui, descriviamo l'uso del metodo di imaging a singola molecola, DNA Curtains, per studiare il meccanismo biofisico dell'assemblaggio dei condensati EWS-FLI1 sul DNA.

Imaging a singola molecola dell'assemblaggio di condensati EWS-FLI1 sul DNA

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Scopri il monitoraggio in tempo reale dell'auto-assemblaggio di nanocomplessi DNA combinando QD-FRET e microfluidica. Questo metodo integra nanofotonica e microfluidica per studiare polielettroliti utili alla terapia genica.

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

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