L'ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

Questa procedura inizia sezionando blocchi di tessuto congelati con vapore di azoto liquido da otto micrometri su un criostato impostato a meno 17 gradi Celsius, depositandoli su vetrini di vetro semplici e non caricati. Successivamente, i preparati sono colorati con il kit di colorazione istogenetica. Dopo aver identificato i neuroni piramidali, circa 500 cellule vengono catturate mediante laser sul tappo di cattura HS.

Il tappo con le cellule viene posizionato in una provetta da microcentrifuga contenente 50 microlitri di tampone di estrazione, capovolto e inserito in una provetta Falcon precedentemente posizionata in Iraq, immersa in un bagno termico regolato a 42 gradi Celsius. Dopo una breve centrifugazione, il tappo viene rimosso. La soluzione rimanente è quindi pronta per l'isolamento dell'RNA.

Ciao, sono Charmaine Peterson del laboratorio di Wilson Wu del Dipartimento di Neuroscienze Strutturali e Molecolari presso l'ospedale McLean. Oggi vi mostreremo un procedimento per il recupero laser-guidato di neuroni parametali da tessuto cerebrale post-mortem umano. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'espressione genica differenziale nei giri superiore e povero di soggetti affetti da schizofrenia, mediante tecnologia a microarray.

Iniziamo. I tessuti cerebrali sono stati ottenuti dal Harvard Brain Tissue Resource Center sotto forma di blocchi congelati in vapore di azoto liquido, prima della sezione del tessuto. È importante ridurre al minimo la contaminazione da RNA: tutte le superfici, compresa l'area di lavoro, la lama per la sezione e i vetrini, vengono trattate con una soluzione decontaminante per RNA, come RNA SAP, e asciugate con etanolo al 100%.

Questa procedura inizia sezionando blocchi di tessuto congelati mediante vapore di azoto liquido su un criostato impostato a meno 17 gradi Celsius, depositandoli su vetrini in vetro semplici e non caricati. Le sezioni di tessuto sono ora pronte per l'identificazione dei neuroni piramidali mediante il kit di colorazione rapida histo gene. Preparare la serie di disidratazione con etanolo, aliquotando 25 millilitri delle appropriate concentrazioni di etanolo e acqua libera da RNA nei barattoli di colorazione forniti con il kit histo gene.

Posizionare tutti i barattoli in un secchio di ghiaccio, tranne un barattolo contenente etanolo al 75%. Collocare quest'ultimo barattolo con etanolo al 75% nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, preparare la soluzione di colorazione aggiungendo un microlitro di inibitore di RNA ogni 100 microlitri di soluzione di colorazione.

Dato che verranno colorate quattro sezioni di tessuto su due vetrini, quattro microlitri di inibitore di RNA vengono aggiunti a 400 microlitri della soluzione di colorazione in un tubo da microcentrifuga. Mantenere la soluzione di colorazione sul ghiaccio. Sotto cappa.

Aggiungere setacci molecolari nel barattolo di xilene per rimuovere l'eccesso di acqua, che potrebbe compromettere il distacco del tessuto. Accendere il bagnomaria impostando la temperatura a 42 gradi Celsius e posizionare un tubo Falcon da 50 millilitri, sostenuto da un supporto, nel bagnomaria. Prelevare due vetrini dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarli su un fazzoletto Kim.

Per circa 30 secondi o fino a quando gli angoli dei vetrini iniziano a scongelarsi, fissare brevemente il tessuto nel 75% di etanolo per 30 secondi nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, utilizzando pinzette libere da RNA, trasferire i vetrini in acqua libera da nucleasi per un lavaggio di 32 secondi. Dopo aver lavato i vetrini, delimitare le sezioni con una penna barriera PAP per concentrare la soluzione di colorazione sulla sezione; colorare le quattro sezioni con la soluzione di colorazione histo gene per 20 secondi. Con 97 microlitri di colorante/Inibitore di RNAsi per sezione, disidratare le sezioni nell'etanolo precedentemente preparato su ghiaccio per 30 secondi per ogni passaggio.

Il passaggio finale con etanolo al 100% dovrebbe essere prolungato a tre minuti per ottenere una disidratazione sufficiente e consentire un adeguato sollevamento del tessuto. Infine, immergere i vetrini in xilene per cinque minuti, lasciandoli asciugare completamente all'aria prima di procedere alla microdissezione con laser. I neuroni piramidali devono essere rimossi immediatamente dopo la colorazione, secondo la procedura per la microdissezione laser a singola cellula. La MICRODISSEZIONE CON LASER o LCM richiede un bagno termoregolato a 42 gradi Celsius contenente un tubo Falcon da 50 millilitri sorretto da un supporto, preparato in precedenza.

Il microdissezione laser a singola cellula viene eseguita con il sistema e il software di cattura ARCTURUS XT. Per iniziare questa procedura, caricare le slide e i cappucci sull'apparecchio arcturus XT. Utilizzare i cappucci Capture HS, ma mantenere l'impostazione del programma su macro.

Fare clic sulla casella "load with overview" per ottenere una foto panoramica di ogni vetrino. Regolare la luminosità e il fuoco a due ingrandimenti per determinare la sezione ottimale per la cattura laser. Evitare sezioni di tessuto con pieghe eccessive, ma scegliere sezioni integre, lisce e colorate.

Posizionare un cappuccio sulla zona generale in cui si effettuerà il campionamento, assicurandosi di includere l'area da acquisire, nel nostro caso il terzo strato della corteccia. Verificare che i binari del cappuccio non poggino su pieghe, poiché ciò inclinerebbe il cappuccio causando dimensioni variabili dei punti.

Successivamente, confermare manualmente la posizione del punto del laser a infrarossi con un'ingrandimento di 40 x. La croce blu deve essere centrata all'interno del punto del laser a infrarossi. In caso contrario, regolarne la posizione facendo clic con il tasto destro sul punto e selezionando "punto IR localizzato".

Con un ingrandimento di 40 x, identificare i neuroni piramidali secondo i seguenti criteri: uno, le cellule devono avere forma piramidale; due, la porzione prossimale dei dendriti apicali e/o basali deve essere identificabile. Salvare la posizione del cappuccio facendo clic sul segno più nella funzione di posizionamento. In questo modo, se il cappuccio viene spostato, tornerà sempre esattamente nello stesso punto in cui è stata regolata la dimensione del spot.

Inserire questi valori nella casella di controllo: 70 per l'alimentazione e 16 per la durata. Poiché questi parametri sono specifici per il nostro tessuto, si raccomanda di testare e regolare tali variabili in base al proprio campione di tessuto prima di iniziare. Quando si catturano singole cellule con il laser, deselezionare l'opzione di movimento automatico del palco e assicurarsi che il simbolo di dimensione corretto corrisponda al simbolo sul pannello a destra.

Selezionare l'opzione cerchio in basso a destra per scegliere un neurone di cui si desidera testare l'acquisizione. Dopo aver allineato la croce blu con il cerchio, attivare il laser facendo clic su Test IR Spot. Il punto prodotto dal laser dovrebbe presentare innanzitutto un anello scuro ben definito intorno all'oggetto acquisito.

Assicurarsi che l'anello sia abbastanza grande da comprendere la cellula, ma sufficientemente piccolo da non includere tessuto indesiderato o altre cellule. Se questo anello è troppo chiaro, la cellula non è stata catturata. Se è presente una macchia scura al centro dell'anello scuro, allora l'intensità o la durata del laser è eccessiva.

Ripetere questo processo su diverse parti del tessuto all'interno del livello che si desidera acquisire. Per verificare che la dimensione del punto non vari in base alla posizione, regolare di conseguenza. Identificare i neuroni piramidali da acquisire, approssimativamente 500 cellule.

Premere il pulsante di cattura laser per acquisire le cellule. Spostare il cappuccio sulla stazione di controllo qualità (QC). Assicurarsi che almeno il 90% dei neuroni sia stato rimosso.

Se così non fosse, catturare ulteriori cellule nell'area in cui è stato catturato la maggior parte delle cellule. Inserire il tappo in una provetta microcentrifuga da 0,5 millilitri contenente 50 microlitri di tampone di estrazione. Il tappo è stato progettato per adattarsi perfettamente ed evitare che il tampone fuoriesca.

Rovesciare l'insieme, assicurandosi che il buffer di estrazione ricopra completamente il tappo, e posizionarlo sul fondo di una provetta Falcon da 50 millilitri nel bagnomaria impostato a 42 gradi Celsius. Incubare i neuroni per 30 minuti per rimuovere il tessuto dal tappo; dopo l'incubazione, centrifugare l'insieme provetta e tappo per due minuti a 800 gs. Al termine della centrifugazione, rimuovere il tappo.

Se l'isolamento dell'RNA verrà eseguito solo in un momento successivo, conservare l'estratto cellulare rimanente a meno 80 gradi Celsius. In caso contrario, procedere con l'isolamento dell'RNA dall'estratto cellulare come illustrato nella prossima sezione. L'isolamento dell'RNA viene effettuato utilizzando il kit di isolamento PICO pure, progettato per isolare piccoli numeri di cellule da campioni di LCM e per mantenere l'mRNA a bassa abbondanza.

Per iniziare questa procedura, aggiungere l'etanolo al 70% fornito con il kit all'estratto cellulare e centrifugare su una colonna di purificazione precondizionata. Per favorire il legame dell'RNA al filtro della colonna dopo il lavaggio, trattare l'RNA con DNs per eliminare il rischio di interferenze da DNA. Questo passaggio è particolarmente importante in applicazioni successive come la R-T-P-C-R in tempo reale.

Dopo la digestione del DNA, aggiungere 40 microlitri del buffer di lavaggio uno e centrifugare la colonna di purificazione per 15 secondi a 8.000 G. Successivamente, proseguire con i lavaggi seguendo il protocollo fornito con il kit, ma estendere l'ultimo passaggio di lavaggio con il buffer di lavaggio due da due a due minuti e mezzo per assicurarsi che nessun residuo di buffer rimanga nella colonna, il che potrebbe ridurre il rendimento di RNA. Trasferire la colonna in un altro tubo da microcentrifuga. Aggiungere il buffer di eluizione e incubare sul filtro all'interno della colonna per un minuto, quindi centrifugare la colonna per eluire l'RNA.

Infine, verificare la qualità dell'RNA estratto utilizzando un chip Experian High Sense, che fornisce un gel virtuale e un elettroferogramma: pipettare 1,3 microlitri del campione in una provetta da 0,5 millilitri. Per il controllo di qualità, congelare il resto del campione a meno 80 gradi Celsius. Una volta verificata la qualità dell'RNA, questo può essere amplificato, etichettato e ibridato.

Per l'analisi del profilo di espressione genica, verranno effettuati due cicli di amplificazione lineare con il kit ribo amp HS plus, che dovrebbe produrre circa 50 microgrammi di RNA amplificato, quantità sufficiente per eseguire sia esperimenti con microarray che con Q-R-T-P-C-R. Il kit di marcatura turbo biotin e la marcatura di molecular devices vengono utilizzati per etichettare l'RNA amplificato. Infine, verrà eseguito il profilo di espressione genica utilizzando il chip genico umano X three P pro beret di atrix.

Il sezionamento del tessuto dovrebbe produrre due vetrini con due sezioni per vetrino, per un totale di quattro sezioni per caso. Ogni sezione dovrebbe essere liscia, con strappi, crepe o pieghe minimi. I neuroni piramidali dovrebbero essere intensamente colorati, di dimensioni comprese tra 20 e 25 micrometri, con forma piramidale e dendriti apicali visibili.

Durante la LCM, dopo che il laser ha emesso un impulso attraverso il film termoplastico, le cellule aderiscono al cappuccio e quindi non si trovano più sul vetrino, lasciando il tessuto circostante. Dovrebbe verificarsi l'adesione al cappuccio di circa l'85-100% dei neuroni utilizzando i cappucci di cattura HS con impostazioni macro e un corretto regolaggio della potenza e intensità del laser. Per ogni sezione, si dovrebbero ottenere circa 500-700 cellule per sezione, con un rendimento di almeno 500 picogrammi di RNA totale per campione.

Dopo l'isolamento dell'RNA totale, la qualità dell'RNA viene valutata mediante un elettroferogramma e un gel virtuale tramite il BioRad Experian. Nell'elettroferogramma, si dovrebbero osservare due picchi distinti corrispondenti alle unità di RNA ribosomiale 18 s e 20 s, con tessuto post mortem. Tuttavia, ciò non si verifica sempre, poiché il tessuto potrebbe essere degradato a causa di fattori presenti prima della sezionatura.

Normalmente si osserva un grande picco indicativo di degradazione con un ampio massimo intorno a 18 s e un picco più piccolo a 28 s, come indicato dalle frecce rosse. Al contrario, un RNA di scarsa qualità con eccessiva degradazione sarà indicato da un elettroferogramma con una vasta area sotto la curva. Oltre allo spostamento verso il basso della posizione della distribuzione per verificare la qualità dell'mRNA dopo due cicli di amplificazione lineare, utilizziamo sia il chip standard BioRad Experian Sense lab sia lo spettrofotometro NanoDrop.

La tecnologia microarray Atrics tradizionale richiede che la lunghezza della trascrizione dell'mRNA sia di almeno 600 nucleotidi per essere rilevata con questo protocollo. La diffusione dell'mRNA ha raggiunto l'intervallo di 1000 nucleotidi, come indicato dall'elettroferogramma con picchi elevati che diminuiscono gradualmente in funzione del tempo. Questo risultato è confermato anche dal gel virtuale.

Se le lunghezze dei trascritti sono inferiori a 600 nucleotidi, il campione non dovrebbe essere incluso. Per l'ibridazione, le letture effettuate con NanoDrop hanno indicato un rapporto medio a 260 su 280 o purezza di 2,5 tra i campioni. La concentrazione media era di 1,7 microgrammi per microlitro, corrispondente a circa 50 microgrammi di mRNA per campione, quantità sufficiente sia per l'analisi con microarray sia per la successiva validazione, che richiede tra 15 e 20 microgrammi di mRNA e la conferma dei risultati mediante RT-PCR quantitativa. I nostri risultati indicano che con questo protocollo, sia la quantità sia la qualità dell'RNA ottenuta sono adeguate per indagare le differenze nell'espressione genica mediante il chip Atrix Human X Three P.

Dopo l'ibridazione con il chip Atrics Human X three P, abbiamo ottenuto percentuali di chiamata in media del 26,6%, indicando un'adeguata ibridazione e intensità delle sonde. Vi abbiamo appena mostrato come catturare mediante laser i neuroni parametali da tessuto cerebrale umano post mortem al fine di utilizzare l'RNA ottenuto da queste cellule. Per studi di profilazione mediante microarray G, quando si esegue questa procedura, è fondamentale eseguire tutti i passaggi in un ambiente privo di RNAsi e completare le fasi tempestivamente per preservare l'integrità dell'RNA.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.