L'ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

Descriviamo un processo che utilizza laser-capture microdissezione per isolare ed estrarre l'RNA da una popolazione omogenea di cellule, neuroni piramidali, nello strato III del giro temporale superiore nel cervello umano post-mortem. Successivamente abbiamo linearmente amplificare (T7-based) mRNA, e ibridare il campione umano X3P microarray Affymetrix.

Questa procedura inizia con il sezionamento di blocchi di tessuto congelati a vapore di azoto liquido da otto micrometri su un criostato impostato a meno 17 gradi Celsius su vetrini semplici non caricati. Successivamente, le sezioni vengono colorate con il kit di colorazione istogenetica. Dopo aver identificato i neuroni piramidali, le circa 500 cellule vengono catturate al laser sul cappuccio di cattura HS.

Il tappo con le celle viene posto in una provetta da microcentrifuga contenente 50 microlitri di tampone di estrazione capovolta e posta in una provetta Falcon precedentemente posizionata in Iraq, posta in un bagno d'acqua impostato a 42 gradi Celsius. Dopo una breve fase di centrifugazione, il tappo viene rimosso. La soluzione rimanente è quindi pronta per l'isolamento dell'RNA.

Ciao, sono Charmaine Peterson del laboratorio di Wilson Wu nel Dipartimento di Neuroscienze Strutturali e Molecolari del McLean Hospital. Oggi vi mostreremo una procedura per la cattura laser di neuroni parametallici dal tessuto cerebrale umano post-mortem. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'espressione genica differenziale nei superiori e nei poveri giri dei soggetti schizofrenici utilizzando la tecnologia dei microarray.

Quindi iniziamo. I tessuti cerebrali sono stati ottenuti dall'Harvard Brain Tissue Resource Center come blocchi congelati in vapori di azoto liquido prima del sezionamento dei tessuti. È importante ridurre la contaminazione da RNA Tutte le superfici, compresa l'area di lavoro, la lama di sezionamento e i vetrini, vengono trattate con una soluzione di decontaminazione dell'RNA, come l'RNA SAP e pulite con etanolo al 100%.

Questa procedura inizia con il sezionamento di blocchi di tessuto congelati in vapori di azoto liquido su un criostato impostato a meno 17 gradi Celsius su vetrini semplici e non carichi. Le sezioni di tessuto sono ora pronte per l'identificazione dei neuroni piramidali utilizzando il kit di colorazione rapida istogenico. Preparare la serie di disidratazione dell'etanolo, aliquotando 25 millilitri delle concentrazioni di etanolo appropriate e acqua priva di RNA, nei barattoli di colorazione forniti con il kit istogenetico.

Metti tutti i barattoli in un secchiello per il ghiaccio tranne un barattolo di etanolo al 75%. Metti quel 75% di etanolo nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, preparare la soluzione colorante aggiungendo un microlitro di inibitore degli RNA per 100 microlitri di soluzione colorante.

Poiché coloreremo quattro sezioni di tessuto su due vetrini, quattro microlitri di inibitore di RNA vengono aggiunti a 400 microlitri di soluzione colorante in una provetta da microcentrifuga. Conservare la soluzione colorante sul ghiaccio. Sotto una cappa aspirante.

Aggiungi setacci molecolari nel barattolo di xilene per rimuovere l'acqua in eccesso, che potrebbe compromettere il sollevamento dei tessuti. Accendere il bagnomaria con la temperatura impostata a 42 gradi Celsius e posizionare un tubo Falcon da 50 millilitri supportato da una griglia nel bagnomaria. Rimuovi due vetrini dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelali su una salvietta Kim.

Per circa 30 secondi o solo fino a quando gli angoli dei vetrini iniziano a scongelarsi, fissare brevemente il fazzoletto nell'etanolo al 75% per 30 secondi nel congelatore a meno 20 gradi Celsius. Quindi, utilizzando una pinza priva di RNA, trasferire i vetrini in acqua priva di nucleasi per un 32° lavaggio Dopo che i vetrini sono stati lavati, delineare le sezioni con una penna barriera PAP per concentrare la soluzione colorante sulla sezione, colorare le quattro sezioni con la soluzione di colorazione istogenetica per 20 secondi. Con 97 microlitri di inibitore di RNA per sezione, disidratare le sezioni nell'etanolo precedentemente preparato su ghiaccio per 30 secondi per passaggio.

La fase finale di etanolo al 100% deve essere estesa a tre minuti per ottenere una disidratazione sufficiente per un adeguato sollevamento dei tessuti. Infine, immergere i vetrini in xilene per cinque minuti, lasciando asciugare completamente i vetrini all'aria prima di procedere alla microdissezione a cattura laser, i neuroni piramidali devono essere immediatamente rimossi dopo aver colorato la procedura per la cattura laser a singola cellula. La MICRODISSEZIONE o LCM richiede un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius contenente un tubo Falcon da 50 millilitri supportato da un, che è stato impostato in precedenza.

La LCM a cella singola viene realizzata con il sistema di acquisizione laser e il software ARCTURUS XT. Per iniziare questa procedura, caricare i vetrini e i cappucci sull'apparecchio arcturus XT. Utilizzare i tappi HS di acquisizione, ma mantenere l'impostazione del programma su macro.

Fare clic sulla casella di caricamento con panoramica per ottenere una foto panoramica di ogni diapositiva. Regolare la messa a fuoco della luminosità con un ingrandimento di due volte per determinare la sezione ottimale per l'acquisizione laser. Evita le sezioni di tessuto con pieghe eccessive, ma scegli sezioni intatte, lisce e macchiate.

Posiziona un tappo sopra l'area generale in cui catturerai, assicurandoti di includere l'area da catturare nel nostro caso. Strato tre della corteccia. Assicurarsi che le guide del cappuccio non poggino su pieghe in quanto ciò inclinerà il cappuccio con conseguente variazione delle dimensioni dello spot.

Quindi, confermare manualmente la posizione del punto laser IR con l'ingrandimento di 40x. La croce blu deve essere centrata all'interno del punto laser IR. In caso contrario, regolare la sua posizione facendo clic con il pulsante destro del mouse sul punto e selezionando il punto IR localizzato.

A 40 x di ingrandimento, identificare i neuroni piramidali secondo i seguenti criteri, uno che le cellule la nostra forma piramidale e due, la porzione prossimale dei dendriti apicali e/o basali sono identificabili. Salva la posizione del tappo facendo clic sul segno più in corrispondenza della funzione di posizione. In questo modo, se il tappo viene spostato, tornerà sempre esattamente nello stesso punto per il quale hai regolato la dimensione dello spot.

Inserire questi valori nella casella di controllo: 70 in potenza e 16 in durata. Poiché questi parametri sono specifici per i nostri tessuti, si consiglia di testare e regolare queste variabili in base al campione di tessuto specifico prima di iniziare. Con l'acquisizione laser di singole celle, deseleziona l'opzione di spostamento automatico della fase e assicurati che il simbolo della dimensione corretta sia correlato al simbolo sul pannello a destra.

Seleziona l'opzione cerchio in basso a destra per selezionare un neurone che desideri testare l'acquisizione. E dopo aver allineato la croce blu con il cerchio, attiva il laser facendo clic sul punto IR di prova. Il punto creato dal laser dovrebbe innanzitutto avere un anello scuro nitido attorno all'oggetto catturato.

Assicurati che l'anello sia abbastanza grande da racchiudere la cellula, ma abbastanza piccolo da non includere tessuti indesiderati o altre cellule. Se questo anello è troppo leggero, la cella non è stata catturata. Se c'è una macchia scura al centro dell'anello scuro, la durata del taglio della forza del laser è troppo grande.

Ripetere questo processo su diverse parti del tessuto all'interno dello strato che si desidera catturare. Per verificare che la dimensione del punto non differisca a seconda della posizione, regolare di conseguenza. Identificare i neuroni piramidali per catturare circa 500 cellule.

Premere il pulsante di acquisizione laser per acquisire le cellule. Spostare il tappo sulla stazione QC. Assicurati che almeno il 90% dei neuroni sia stato rimosso.

In caso contrario, catturare più cellule nell'area in cui è stata catturata la maggior parte delle cellule. Mettere il tappo in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri contenente 50 microlitri di tampone di estrazione. Il tappo è stato progettato per adattarsi perfettamente per evitare perdite dal tampone.

Capovolgere il gruppo, assicurandosi che il tampone di estrazione copra tutto il tappo e posizionarlo sul fondo del tubo Falcon da 50 millilitri nel bagnomaria impostato a 42 gradi Celsius. Incubare i neuroni per 30 minuti per rimuovere il tessuto dal cappuccio dopo la centrifuga di incubazione, il gruppo provetta e tappo per due minuti a 800 g. Dopo la centrifugazione, togliere il tappo.

Se l'isolamento dell'RNA verrà eseguito solo in un secondo momento. Conservare l'estratto cellulare rimanente a meno 80 gradi Celsius. In caso contrario, procedere con l'isolamento dell'RNA dall'estratto cellulare come mostrato nella sezione successiva, l'isolamento dell'RNA viene eseguito utilizzando il kit di isolamento puro PICO, progettato per isolare un piccolo numero di cellule da campioni LCM e per mantenere l'mRNA a bassa abbondanza.

Per iniziare questa procedura, aggiungere all'estratto cellulare il 70% di etanolo fornito con il kit e centrifugare su una colonna di purificazione precondizionata. Per legare l'RNA al filtro della colonna dopo il lavaggio, trattare l'RNA con D Ns per eliminare il rischio di interferenza del DNA. Questo passaggio è particolarmente importante nelle applicazioni a valle come la R-T-P-C-R in tempo reale.

Dopo la digestione del DNA, aggiungere 40 microlitri di tampone di lavaggio uno e centrifugare la colonna di purificazione per 15 secondi a 8.000 Gs.Successivamente, procedere con i lavaggi secondo il protocollo fornito con il kit, ma estendere la fase di lavaggio finale con il tampone di lavaggio due da due a due minuti e mezzo per assicurarsi che non rimanga alcun tampone di lavaggio nella colonna, che può ridurre la resa dell'RNA. Trasferire la colonna in un'altra provetta per microcentrifuga. Aggiungere il tampone eluciano e incubare sul filtro nella colonna per un minuto, centrifugare la colonna per eluire l'RNA.

Infine, controlla la qualità dell'RNA estratto eseguendo un chip da laboratorio Experian High Sense, che fornisce un gel virtuale e una pipetta per elettroferogramma da 1,3 microlitri del campione in una provetta da 0,5 millilitri. Per il test di controllo qualità, congelare il resto del campione a meno 80 gradi Celsius. Una volta verificata la qualità dell'RNA, può essere amplificato, etichettato e ibridato.

Per l'analisi del profilo di espressione genica, verranno eseguiti due cicli di amplificazione lineare con il kit ribo amp HS plus, che dovrebbero risultare in circa 50 microgrammi di RNA amplificato sufficienti per l'esecuzione di esperimenti sia di microarray che di Q-R-T-P-C-R. Il kit di etichettatura della biotina turbo e l'etichettatura dei dispositivi molecolari vengono utilizzati per etichettare l'RNA amplificato. Infine, verrà eseguito il profilo di espressione genica utilizzando il pro beret del chip genico X tre P umano di atrix.

Il sezionamento dei tessuti dovrebbe risultare in due vetrini con due sezioni per vetrino, quattro sezioni in totale per caso. Ogni sezione dovrebbe essere liscia con strappi, screpolature o pieghe minime. I neuroni piramidali dovrebbero essere colorati in modo scuro di circa 20-25 micrometri di dimensione con una forma piramidale e dendriti apicali visibili.

Durante la LCM, dopo che il laser ha pulsato attraverso la pellicola termoplastica, le cellule aderiscono al cappuccio e quindi non sono più sul vetrino lasciando il tessuto circostante. Dietro circa l'85-100% dei neuroni dovrebbe aderire al cappuccio con i cappucci HS di cattura con impostazioni macro e corretta regolazione della potenza e della forza del laser. Per ogni sezione, si dovrebbero ottenere circa 500-700 cellule per sezione, con un risultato di almeno 500 picogrammi di RNA totale per caso.

Dopo l'isolamento totale dell'RNA, la qualità dell'RNA viene valutata mediante un elettroferogramma e un gel virtuale tramite BioRad Experian. Nell'elettroferogramma, dovresti vedere due picchi distinti corrispondenti alle unità di RNA ribosomiale 18 s e 20 a s con tessuto post mortem. Tuttavia, questo non è sempre il caso in quanto il tessuto può essere degradato a causa di fattori precedenti al sezionamento.

Normalmente vedrai una grande protuberanza che indica un degrado con un grande picco intorno ai 18 s e un picco più piccolo di 28 s come indicato dalle frecce rosse. Al contrario, l'RNA di cattiva qualità con troppa degradazione sarà indicato da un elettroferogramma con un'ampia area sotto la sua curva. Oltre a un downshift nella posizione della diffusione per testare la qualità dell'mRNA dopo due cicli di amplificazione lineare, utilizziamo sia il chip da laboratorio Sense standard BioRad Experian che lo spettrofotometro NanoDrop.

La tradizionale tecnologia Atrics microarray richiede che la diffusione del trascritto dell'mRNA sia lunga almeno 600 nucleotidi per essere rilevata con questo protocollo. La diffusione dell'mRNA ha raggiunto l'intervallo dei 1000 nucleotidi come indicato dall'elettroferogramma con grandi picchi che scendono lentamente in funzione del tempo. Questo risultato è confermato anche dal gel virtuale.

Se le lunghezze dei trascritti sono inferiori a 600 nucleotidi, il campione non deve essere incluso Per l'ibridazione, le letture di NanoDrop hanno indicato una media di due 60 su un rapporto di due 80 o una purezza di 2,5 tra i campioni. La concentrazione media è stata di 1,7 microgrammi per microlitro, risultando in circa 50 microgrammi di mRNA per campione, sufficienti sia per l'analisi dei microarray che per la successiva validazione, che richiede tra i 15 e i 20 microgrammi di mRNA e la successiva validazione dei risultati con QR TPCR. I nostri risultati indicano che con questo protocollo, sia la quantità che la qualità dell'RNA ottenuto sono abbastanza buone da studiare le differenze di espressione genica attraverso il chip X tre P umano atrix.

Dopo l'ibridazione con il chip Atrics Human X three P, abbiamo raggiunto una percentuale di chiamate media del 26,6%, indicando un'adeguata ibridazione e intensità della sonda. Vi abbiamo appena mostrato come catturare al laser i neuroni parametallici dal tessuto cerebrale umano post-mortem per utilizzare l'RNA ottenuto da queste cellule. Per gli studi di profilazione G di microarray, quando si esegue questa procedura, è importante eseguire tutti i passaggi in un ambiente privo di RNA e completare i passaggi in modo tempestivo al fine di preservare l'integrità dell'RNA.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.