Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l'analisi di espressione genica
August 7th, 2009
L'isolamento di alta qualità, intatto RNA è un passo essenziale in molti protocolli di laboratorio. In questo studio dimostriamo estrazione di RNA da embrioni di zebrafish tutto e sintesi del DNA per la successiva applicazione in diverse procedure sperimentali inclusa l'analisi microarray di espressione genica.
Per iniziare l'isolamento dell'RNA e ottenere rese sufficienti, 50 embrioni di zebrafish vengono inseriti in un tubo microfuso di mortaio. L'RNA viene prima estratto utilizzando triolo, reagente e cloroformio dopo essere stato accuratamente omogeneizzato. L'RNA viene quindi pulito e purificato utilizzando il minikit Qiagen RNEZ per produrre RNA totale non degradato di alta qualità per applicazioni future e conservazione a lungo termine.
L'RNA viene sintetizzato nel prodotto CD NA più stabile. Il cDNA viene purificato per rimuovere il filamento modello di RNA originale. Ciao, mi chiamo Sam Peterson del laboratorio della dottoressa Jennifer Freeman nel Dipartimento di Scienze della Salute della Purdue University.
Oggi vi mostreremo come estrarre RNA di alta qualità da embrioni interi di zebrafish e trasformarlo nel prodotto CDNA. In genere, utilizziamo questa procedura per studiare i profili di espressione genica. Quindi iniziamo.
Quando si lavora con l'RNA, è molto importante lavorare in un ambiente privo di RNA. Utilizzare semplici precauzioni come avere animali domestici da tubo riservati per l'uso solo con le procedure di RNA e spruzzare l'area di lavoro con gli RNA prima di iniziare l'estrazione dell'RNA totale Per iniziare il lavoro di estrazione nella cappa aspirante e tirare 50 embrioni di pesce zebra in un tubo di microfuge mort da 1,5 millilitri. Rimuovere quanta più acqua possibile e aggiungere immediatamente 250 microlitri di reagente triolo, che contiene fenolo.
Usa un pestello a pellet per sdraiare e omogeneizzare gli embrioni per circa 20 colpi fino a quando il tessuto non è sufficientemente distrutto. Quindi aggiungere 750 microlitri di reagente triazolico e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire la completa dissociazione dei complessi proteici nucleari. Trascorsi i cinque minuti, aggiungere N 0,2 millilitri di cloroformio mescolato facendo oscillare la provetta per 15 secondi e incubare il campione per due minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 12.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
La miscela si separerà in una fase inferiore di cloroformio di fenolo rosso, un'interfase e una fase acquosa superiore incolore. Lo strato superiore è di circa 0,6 millimetri e contiene l'RNA che trasferisce l'intero strato acquoso superiore, circa 0,6 millimetri in un nuovo tubo micro FUZE. Facendo attenzione a non trasferire nessuno dello strato di interfase accanto a precipitare l'RNA, aggiungere 0,5 millilitri di miscela di isopropanolo.
E sediamoci a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifughiamo il campione a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. L'RNA dovrebbe formare una pallina gelatinosa. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e lavare aggiungendo un millilitro di etanolo al 75% miscelato con centrifuga a inversione delicata a 7, 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, rimuovere l'etanolo e capovolgere la provetta per asciugarla per 10 minuti. Risospendere il pellet aggiungendo 100 microlitri di RNA di acqua libera e incubando a 55 gradi Celsius per 10 minuti. Vortice delle dita frequentemente per favorire la reidratazione dell'RNA.
Ora che l'RNA è stato estratto dagli embrioni, procedere alla pulizia dell'RNA e al trattamento di Da. Per pulire l'RNA, inizia con un mini kit Rogen RN easy. Al primo utilizzo, aggiungere quattro volumi di etanolo al 100% a un volume di RPE tampone che lavora nella cappa aspirante.
Aggiungere 10 microlitri di beta me capto etanolo per ogni millilitro di tampone RLT. Quindi aggiungere 350 microlitri di tampone RLT e 250 microlitri di etanolo al 100% al campione, miscelato pipettando su e giù più volte, e trasferire l'intero campione su una colonna R e facile che viene caricata in una provetta di raccolta da due millilitri. Centrifugare a 8.000 G per un minuto a temperatura ambiente dopo la centrifugazione, scartare il flusso e aggiungere 700 microlitri di tampone RW one alla colonna di centrifuga.
Centrifugare nuovamente a 8.000 G per un minuto ed eliminare il flusso per rimuovere la DA dal campione. Proseguire con il trattamento del DNA utilizzando il kit DNA free RNA. Dopo aver ricevuto il kit, aggiungere 550 microlitri di acqua priva di nucleasi ai DNA e mescolare delicatamente capovolgendo per conservare la soluzione madre divisa in 10 microlitri, aliquote e congelare a meno 20 gradi Celsius.
Aggiungere 70 microlitri di tampone RDD a 10 microlitri di una soluzione madre di DNA, miscelata brevemente con una centrifuga a inversione delicata, e aggiungere direttamente alla colonna R e easy spin A.Incubare il trattamento del DNA per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 350 microlitri di tampone RW one alla centrifuga a colonna rotante a 8.000 G per un minuto a temperatura ambiente, scartare il flusso e aggiungere 500 microlitri di tampone RPE alla colonna di centrifuga. Incubare il campione per cinque minuti a temperatura ambiente.
Centrifugare nuovamente a 8.000 G per un minuto a temperatura ambiente, scartare il flusso e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% alla colonna di centrifuga. Ripetere la centrifugazione a 8.000 G, ma per due minuti a temperatura ambiente dopo la centrifugazione, scartare il flusso e lasciare asciugare immediatamente la colonna per cinque minuti. Centrifugare a 8.000 G per cinque minuti a temperatura ambiente per rimuovere eventuali residui di etanolo.
Ora trasferisci la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungi 10 microlitri di acqua priva di nucleasi, incuba per un minuto per eluire la centrifuga di RNA a 10.000 G per un minuto. A temperatura ambiente, l'RNA sarà nel flusso attraverso. Ripetere l'eluizione con altri 10 microlitri di acqua.
Controllare la quantità e la qualità dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ND 1000 seguendo le istruzioni del produttore. Inoltre, eseguire un gel denaturante o utilizzare un bioanalizzatore Agilent 2100 per verificare l'integrità dell'RNA. Se la qualità e la quantità dell'RNA sono soddisfacenti, passare alla sintesi del CDNA.
Infine, conservare l'RNA a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è possibile eseguire la sintesi di CD NA. Avviare la sintesi di CD NA mescolando e centrando brevemente ogni componente del primer di RNA. Mescolare l'RNA DN NTP e l'oligo dt.
Aggiungere ogni componente a un tubo microfuso sterile da 0,5 millilitri per un totale di 10 microlitri. Per volumi specifici, vedere il protocollo scritto allegato. Quindi incubare il campione a 65 gradi Celsius per cinque minuti.
Trasferire immediatamente il campione in una sospensione di ghiaccio per 10 minuti mentre il campione sta chiamando, preparare una miscela master tampone per un totale di nove microlitri come indicato nel protocollo scritto allegato. Dopo il raffreddamento, combinare la miscela master tampone con la miscela di primer RNA miscelata delicatamente e raccogliere mediante breve centrifugazione. Quindi, mettere il campione combinato a incubare nel termociclatore a 42 gradi Celsius per due minuti.
Per iniziare la trascrizione inversa, aggiungere un microlitro di apice due RT alla provetta e mescolare. Continuare a incubare a 42 gradi Celsius per un'ora. Terminare la reazione a 70 gradi Celsius per 15 minuti.
Quindi raffreddare il campione a quattro gradi Celsius e trasferirlo in un bagno di ghiaccio su ghiaccio. Aggiungere un microlitro di RNA H al campione e incubare per 20 minuti A 37 gradi Celsius, RNAs h degrada il modello di RNA lasciando solo il singolo filamento CD NA prodotto la sintesi del cDNA è ora completa, richiedendo solo un'ulteriore fase di pulizia e concentrazione. Per isolare il prodotto CD NA, preparare una provetta di gel ad aggancio di fase da 1,5 millilitri mediante centrifugazione a 12.000 G per due minuti.
Tutti i gel dovrebbero essere sul fondo del tubo. Aggiungere 81,5 microlitri di tris di fenolo saturo tamponato a pH otto virgola nulla, 81,5 microlitri di 24 a un cloroformio isol Amal alcool e il campione nella provetta di gel ad aggancio di fase, miscelato più volte mediante centrifuga a inversione delicata, il campione a 12.000 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, il CDNA dovrebbe essere nella fase acquosa superiore.
Trasferire la fase superiore, che dovrebbe essere di circa 20 microlitri, in una microprovetta pulita da 1,5 millilitri. Per precipitare il CDNA, aggiungere due microlitri di acetato di sodio a tre molari a pH 5,2 e mescolare delicatamente. Aggiungere sette microlitri di cinque milligrammi per millilitro di glicogeno e mescolare delicatamente.
Quindi aggiungere 30 microlitri di isopropanolo e mescolare delicatamente e lasciare incubare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi centrifugare a 12.000 G per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, sul fondo della provetta appare un piccolo pellet di CDNA.
Rimuovere con cautela il surnatante con un perpet. Lavare il pellet aggiungendo 500 microlitri di etanolo al 70% e miscelare per centrifuga ad inversione il campione a 12.000 G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il natante SUP con ape.
Ripetere il lavaggio, aggiungere la centrifuga di etanolo e rimuovere il natante SUP. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare brevemente il tubo per raccogliere il liquido rimanente. Rimuovere il liquido in eccesso e lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi aggiungere 20 microlitri di acqua priva di nucleasi per reidratare il pellet. Posizionare il campione a 55 gradi Celsius per cinque minuti. Per la reidratazione, il CD NA può essere conservato a meno 20 gradi Celsius.
Infine, controllare la quantità e la qualità del prodotto CD NA utilizzando uno spettrofotometro nano drop ND 1000 seguendo le istruzioni del produttore, l'estrazione e la purificazione dell'RNA da 50 embrioni di zebrafish produce abitualmente circa 15 microgrammi di RNA totale di alta qualità come valutato utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ND 1000, il rapporto di assorbanza tra due 60 e due 80 è di circa 1,9 a due punti zero. L'integrità dell'RNA estratto viene valutata utilizzando un gel di RNA denaturante. L'RNA appare come uno striscio con due bande luminose corrispondenti all'RNA ribosomiale 18 s e 28 s.
La banda 28 s dovrebbe essere circa il doppio più intensa della banda 18 S. In alternativa, l'integrità dell'RNA viene valutata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100. Sono visibili due picchi acuti corrispondenti all'RNA ribosomiale 18 s e 28 s.
Il picco di 28 s dovrebbe essere più grande del picco di 18 s. La trascrizione inversa di cinque microgrammi di RNA totale produce abitualmente da uno a due microgrammi di CD NA come valutato utilizzando un NanoDrop ND 1000. Il rapporto di assorbanza due 60 a 2 80 del CDNA è di circa 1,8.
Vi abbiamo appena mostrato come isolare l'RNA totale da embrioni interi di zebrafish e convertire quell'RNA nel prodotto CD NA. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere un ambiente privo di RN ais. Quindi questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo dimostra l'estrazione di RNA di alta qualità da embrioni di zebrafish interi, un passaggio cruciale per vari protocolli di laboratorio. Il processo include la sintesi di cDNA per applicazioni come l'analisi dei microarray di espressione genica.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia
- Biologia molecolare
Sfondo
- L'isolamento dell'RNA è essenziale per molte procedure sperimentali.
- L'RNA di alta qualità è necessario per un'analisi accurata dell'espressione genica.
- Gli embrioni di zebrafish servono come organismo modello per studi sullo sviluppo.
- La sintesi di cDNA permette un'analisi stabile dell'espressione genica.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per l'estrazione di RNA da embrioni di zebrafish.
- Fornire un protocollo per la sintesi di cDNA per applicazioni future.
- Facilitare l'analisi dell'espressione genica attraverso tecniche di microarray.
Metodi utilizzati
- Omogenizzazione degli embrioni di zebrafish in un tubo micro fuso in mortaio.
- Estrazione di RNA utilizzando il reagente triol e cloroformio.
- Purificazione dell'RNA con il minikit Qiagen RNEZ.
- Sintesi di cDNA dall'RNA estratto.
Principali risultati
- È stato estratto con successo RNA totale di alta qualità, non degradato.
- Il cDNA è stato sintetizzato e purificato, rimuovendo il modello di RNA originale.
- Il metodo permette la conservazione a lungo termine dell'RNA per esperimenti futuri.
- Aplicabilità dimostrata per l'analisi dell'espressione genica tramite microarray.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'estrazione di RNA da embrioni di zebrafish.
- L'RNA e il cDNA di alta qualità sono essenziali per studi accurati sull'espressione genica.
- Questo metodo può essere adattato per varie applicazioni sperimentali in biologia molecolare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-quality RNA isolation and cDNA synthesis from zebrafish embryos enable reliable gene expression profiling, a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for early discovery programs. This protocol supports reproducible quantitative outputs that inform lead identification and portfolio prioritization in preclinical research. The method provides a disease-relevant system for assessing transcriptional responses to pharmacological perturbations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative gene expression analysis in a vertebrate model system.
- Operational Value: Provides standardized RNA extraction and cDNA synthesis workflows with built-in quality control checks to ensure sample integrity.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by generating reproducible transcriptional readouts for pathway clarification and target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity cDNA suitable for downstream applications such as RT-PCR and microarray analysis, enabling reliable compound screening.
- Operational Value: Delivers consistent RNA yield and quality metrics (e.g., NanoDrop ratios, gel electrophoresis) that support assay standardization across experiments.
- Scalability: Uses commercially available kits and standardized reagents, facilitating adaptation to higher-throughput workflows in discovery biology.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Generates cDNA from zebrafish embryos, a disease-relevant system, enabling mechanistic studies that bridge discovery and preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative gene expression data that inform go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target pathways.
- Biomarker Alignment: Supports identification of transcriptional biomarkers that can be tracked across developmental stages and treatment conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in zebrafish models before progressing to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through quantitative gene expression analysis in a vertebrate system.
- Screening: Produces standardized cDNA outputs suitable for reliable compound evaluation in gene expression assays.
- Analytics: Delivers quantifiable RNA and cDNA yields with quality metrics (e.g., 260/280 ratios, ribosomal RNA bands) that allow comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical work by providing disease-relevant transcriptional data from zebrafish embryos.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNA isolation and cDNA synthesis platform applicable across multiple targets and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing RNA degradation risk and ensuring sample integrity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through QC checkpoints and commercially validated kits.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through reliable gene expression data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative transcriptional data for target comparison.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and RNase-free technique to prevent sample degradation.
- Depends on access to centrifugation equipment, spectrophotometers (e.g., NanoDrop), and optional bioanalyzers for QC.
- Necessitates standardized workflows across teams to ensure consistent RNA yield and quality metrics.
- Must account for model-specific adaptations when applying the protocol to different developmental stages or zebrafish strains.
- Practical limitation: RNA instability necessitates rapid processing and cold storage to maintain sample integrity for downstream applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Extraction of Total RNA using TRIzol Reagent
0:41
Introduction
7:57
cDNA Synthesis using the Invitrogen SuperScript First-Strand System
3:55
RNA Cleanup using the Qiagen RNEasy Mini Kit
10:28
cDNA Isolation and Precipitation
14:57
Conclusion
13:50
Representative Results/Outcome
