Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l'analisi di espressione genica
7 agosto 2009
L'isolamento di alta qualità, intatto RNA è un passo essenziale in molti protocolli di laboratorio. In questo studio dimostriamo estrazione di RNA da embrioni di zebrafish tutto e sintesi del DNA per la successiva applicazione in diverse procedure sperimentali inclusa l'analisi microarray di espressione genica.
Per iniziare l'isolamento dell'RNA e ottenere rese sufficienti, 50 embrioni di pesce zebra vengono aspirati in un tubo microfuso da mortaio. L'RNA viene estratto inizialmente utilizzando triolo, reagente e cloroformio dopo un'accurata omogeneizzazione. Successivamente, l'RNA viene purificato e ripulito mediante il kit Qiagen RNEZ mini per ottenere RNA totale di alta qualità, non degradato, idoneo per applicazioni future e per la conservazione a lungo termine.
L'RNA viene sintetizzato nel prodotto cDNA più stabile. Il cDNA viene purificato per rimuovere il filamento modello di RNA originale. Ciao, mi chiamo Sam Peterson del laboratorio della dottoressa Jennifer Freeman del Dipartimento di Scienze della Salute della Purdue University.
Oggi vi mostreremo come estrarre RNA di alta qualità da embrioni interi di zebrafish e trasformarlo nel prodotto CDNA. Tipicamente, utilizziamo questa procedura per studiare i profili di espressione genica. Cominciamo dunque.
Quando si lavora con l'RNA, è molto importante operare in un ambiente privo di RNasi. Adottare semplici precauzioni, come utilizzare pipette riservate esclusivamente alle procedure con l'RNA e spruzzare l'area di lavoro con soluzioni anti-RNasi prima di iniziare l'estrazione dell'RNA totale. Iniziare l'estrazione all'interno della cappa aspirante, prelevando 50 embrioni di pesce zebra in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Rimuovere quanta più acqua possibile e aggiungere immediatamente 250 microlitri di reagente triol, che contiene fenolo.
Utilizzare un pestello per pellet per triturare e omogeneizzare gli embrioni con circa 20 movimenti fino a quando il tessuto non è sufficientemente disgregato. Aggiungere quindi 750 microlitri di reagente triazolo e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per permettere la completa dissociazione dei complessi proteici nucleari. Trascorsi i cinque minuti, aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio, mescolare agitando il tubo per 15 secondi e incubare il campione per due minuti a temperatura ambiente; quindi centrifugare a 12.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
La miscela si separerà in una fase inferiore rossa di fenolo-cloroformio, una fase intermedia e una fase acquosa superiore incolore. Lo strato superiore è di circa 0,6 millimetri e contiene l'RNA; trasferire l'intero strato acquoso superiore, pari a circa 0,6 millimetri, in un nuovo tubo micro FUZE, avendo cura di non trasferire alcuna parte dello strato intermedio. Per precipitare l'RNA, aggiungere 0,5 millilitri di isopropanolo e mescolare.
E lasciamo in posa a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifughiamo il campione a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. L'RNA dovrebbe formare un pellet di consistenza gelatinosa. Rimuoviamo il soprannatante senza disturbare il pellet e laviamo aggiungendo un millilitro di etanolo al 75%, mescolando mediante inversione delicata e centrifugando a 7.500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, rimuovere l'etanolo e capovolgere il tubo per farlo asciugare per 10 minuti. Risospendere il pellet aggiungendo 100 microlitri di acqua priva di RNA e incubando a 55 gradi Celsius per 10 minuti. Vortexare delicatamente più volte con le dita per favorire la reidratazione dell'RNA.
Ora che l'RNA è stato estratto dagli embrioni, procedere alla purificazione dell'RNA e al trattamento con DNasi. Per purificare l'RNA, utilizzare un kit Rogen RN easy mini. Alla prima utilizzazione, aggiungere quattro volumi di etanolo al 100% a un volume del buffer RPE, operando nella cappa a flusso laminare.
Aggiungere 10 microlitri di beta-mercaptoetanolo per ogni millilitro di buffer RLT. Quindi aggiungere 350 microlitri di buffer RLT e 250 microlitri di etanolo al 100% al campione, mescolando mediante pipettaggio ripetuto su e giù per diverse volte, e trasferire l'intero campione su una colonna RNeasy posizionata in una provetta di raccolta da due millilitri. Centrifugare a 8.000 ×g per un minuto a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, scartare il flusso passante e aggiungere 700 microlitri di buffer RW1 sulla colonna da centrifuga.
Centrifugare nuovamente a 8.000 G per un minuto e scartare il flusso in eccesso per rimuovere il DA dal campione. Procedere quindi con il trattamento del DNA utilizzando il kit per DNA privo di RNA. Dopo aver ricevuto il kit, aggiungere 550 microlitri di acqua priva di nucleasi ai DNA e mescolare delicatamente capovolgendo il contenitore, quindi conservare la soluzione madre suddivisa in aliquote da 10 microlitri e congelare a meno 20 gradi Celsius.
Aggiungere 70 microlitri di tampone RDD a 10 microlitri della soluzione madre di DNA, mescolare mediante inversione delicata, centrifugare brevemente e aggiungere direttamente sulla colonna R e sulla colonna spin A. Incubare il trattamento del DNA per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 350 microlitri di tampone RW1 alla colonna spin, centrifugare a 8.000 ×g per un minuto a temperatura ambiente, scartare il flusso passante e aggiungere 500 microlitri di tampone RPE alla colonna spin. Incubare il campione per cinque minuti a temperatura ambiente.
Centrifugare nuovamente a 8.000 G per un minuto a temperatura ambiente, scartare il flusso passante e aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75% alla colonna da centrifuga. Ripetere la centrifugazione a 8.000 G, ma per due minuti a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, scartare il flusso passante e lasciare asciugare la colonna per cinque minuti immediatamente. Centrifugare a 8.000 G per cinque minuti a temperatura ambiente per rimuovere eventuali tracce residue di etanolo.
Trasferire ora la colonna di centrifugazione in una nuova provetta di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere 10 microlitri di acqua priva di nucleasi; incubare per un minuto per eluire l'RNA, quindi centrifugare a 10.000 ×g per un minuto. A temperatura ambiente, l'RNA si troverà nel flusso passante. Ripetere l'eluzione con altri 10 microlitri di acqua.
Verificare la quantità e la qualità dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ND 1000 seguendo le istruzioni del produttore. Inoltre, eseguire un gel denaturante oppure utilizzare un bioanalizzatore Agilent 2100 per verificare l'integrità dell'RNA. Se la qualità e la quantità dell'RNA sono soddisfacenti, procedere con la sintesi del CDNA.
Infine, conservare l'RNA a meno 80 gradi Celsius fino a quando non si potrà effettuare la sintesi del CD NA. Iniziare la sintesi del CD NA mescolando e centrifugando brevemente ogni componente del primer di RNA. Mescolare i DN NTPs di RNA e l'oligo dt.
Aggiungere ogni componente in una provetta microfusa sterile da 0,5 millilitri per un volume totale di 10 microlitri. Per i volumi specifici, consultare il protocollo scritto allegato. Quindi incubare il campione a 65 gradi Celsius per cinque minuti.
Trasferire immediatamente il campione in una miscela di ghiaccio per 10 minuti; mentre il campione si raffredda, preparare una miscela madre di tampone fino a un volume totale di nove microlitri, come indicato nel protocollo scritto allegato. Dopo il raffreddamento, unire la miscela madre di tampone alla miscela di primer RNA mescolando delicatamente e raccogliere mediante una breve centrifugazione. Successivamente, incubare il campione combinato nel termociclatore a 42 gradi Celsius per due minuti.
Per avviare la trascrizione inversa, aggiungere un microlitro di superscript two RT al tubo e mescolare. Proseguire l'incubazione a 42 gradi Celsius per un'ora. Terminare la reazione a 70 gradi Celsius per 15 minuti.
Quindi raffreddare il campione a quattro gradi Celsius e trasferirlo in un bagno di ghiaccio. Aggiungere un microlitro di RNasi H al campione e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius; la RNasi H degrada il templato di RNA lasciando solo il prodotto di DNA complementare a singolo filamento. La sintesi del cDNA è ora completa e richiede soltanto un ulteriore passaggio di purificazione e concentrazione. Per isolare il prodotto di DNA complementare, preparare una provetta da 1,5 millilitri con gel phase lock mediante centrifugazione a 12.000 ×g per due minuti.
Tutti i gel dovrebbero trovarsi nella parte inferiore del tubo. Aggiungere 81,5 µL di fenolo saturo con tris tamponato a pH 8,0, 81,5 µL di cloroformo 24:1 con alcol isoamilo e il campione nel tubo con gel di blocco della fase; mescolare più volte mediante inversione delicata e centrifugare il campione a 12.000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. L'acido desossiribonucleico complementare (cDNA) dovrebbe trovarsi nella fase acquosa superiore.
Trasferire la fase superiore, che dovrebbe essere di circa 20 microlitri, in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Per precipitare il CDNA, aggiungere due microlitri di acetato di sodio tre molare a pH 5,2 e mescolare delicatamente. Aggiungere sette microlitri di glicogeno alla concentrazione di cinque milligrammi per millilitro e mescolare delicatamente.
Quindi aggiungere 30 microlitri di isopropanolo e mescolare delicatamente, lasciando il campione incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, centrifugare a 12.000 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, un piccolo pellet di cDNA appare sul fondo del tubo.
Rimuovere con attenzione il sopranatante utilizzando un perpet. Lavare il pellet aggiungendo 500 microlitri di etanolo al 70% e mescolare per inversione; centrifugare il campione a 12.000 ×g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il sopranatante con un ape.
Ripetere il lavaggio, aggiungere etanolo, centrifugare e rimuovere il sopranatante. Dopo il secondo lavaggio, centrifugare brevemente il tubo per raccogliere qualsiasi liquido residuo. Rimuovere tutto il liquido in eccesso e lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi aggiungere 20 microlitri di acqua priva di nucleasi per reidratare il pellet. Incubare il campione a 55 gradi Celsius per cinque minuti. Per la reidratazione, il CD NA può essere conservato a meno 20 gradi Celsius.
Infine, verificare la quantità e la qualità del prodotto di CD NA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ND-1000 seguendo le istruzioni del produttore; l'estrazione e la purificazione di RNA da 50 embrioni di pesce zebra fornisce abitualmente circa 15 microgrammi di RNA totale di alta qualità, come valutato mediante spettrofotometro NanoDrop ND-1000; il rapporto di assorbanza tra 60 e 80 è di circa 1,9 a 2,0. L'integrità dell'RNA estratto viene valutata mediante elettroforesi su gel di RNA denaturante. L'RNA appare come una striscia con due bande intense corrispondenti all'RNA ribosomiale 18S e 28S.
La banda 28 s dovrebbe avere un'intensità di circa due volte superiore rispetto alla banda 18 s. In alternativa, l'integrità dell'RNA viene valutata utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100. Sono visibili due picchi ben definiti corrispondenti all'RNA ribosomiale 18 s e 28 s.
Il picco di 28 s dovrebbe essere più grande del picco di 18 s. La trascrizione inversa di cinque microgrammi di RNA totale produce regolarmente da uno a due microgrammi di DNAc, come valutato mediante NanoDrop ND 1000. Il rapporto di assorbanza tra 60 e 80 del DNAc è di circa 1,8.
Abbiamo appena mostrato come isolare l'RNA totale da embrioni interi di zebrafish e convertire tale RNA in prodotto di DNA cDNA. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere un ambiente privo di RNasi. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene illustrata l'estrazione di RNA di alta qualità da embrioni interi di pesce zebra, un passaggio fondamentale per diverse procedure di laboratorio. Il processo include la sintesi di cDNA per applicazioni come l'analisi con microarray dell'espressione genica.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia
- Biologia Molecolare
Sfondo
- L'isolamento dell'RNA è essenziale per molte procedure sperimentali.
- Un RNA di alta qualità è necessario per un'analisi accurata dell'espressione genica.
- Gli embrioni di pesce zebra costituiscono un organismo modello per studi sullo sviluppo.
- La sintesi del cDNA consente un'analisi stabile dell'espressione genica.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per l'estrazione di RNA da embrioni di zebrafish.
- Fornire un protocollo per la sintesi di cDNA per applicazioni future.
- Facilitare l'analisi dell'espressione genica mediante tecniche di microarray.
Metodi Utilizzati
- Omogeneizzazione di embrioni di pesce zebra in un tubo microfuso con mortaio.
- Estrazione dell'RNA utilizzando il reagente triolo e cloroformio.
- Purificazione dell'RNA con il minikit Qiagen RNEZ.
- Sintesi del cDNA dall'RNA estratto.
Risultati principali
- È stato estratto con successo RNA totale di alta qualità e non degradato.
- È stato sintetizzato e purificato il cDNA, rimuovendo il modello di RNA originale.
- Il metodo consente lo stoccaggio a lungo termine dell'RNA per esperimenti futuri.
- Applicabilità dimostrata per l'analisi mediante microarray dell'espressione genica.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'estrazione di RNA da embrioni di pesce zebra.
- RNA e cDNA di alta qualità sono essenziali per studi accurati sull'espressione genica.
- Questo metodo può essere adattato per diverse applicazioni sperimentali in biologia molecolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di RNA di alta qualità e la sintesi di cDNA da embrioni di pesce zebra permettono un profilo affidabile dell'espressione genica, un passaggio fondamentale per la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistica nei programmi di scoperta precoce. Questo protocollo supporta output quantitativi riproducibili che guidano l'identificazione dei composti promettenti e la priorizzazione del portafoglio nella ricerca preclinica. Il metodo fornisce un sistema rilevante per la malattia per valutare le risposte trascrizionali a perturbazioni farmacologiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'analisi quantitativa dell'espressione genica in un sistema modello vertebrale.
- Valore operativo: Fornisce protocolli standardizzati per l'estrazione di RNA e la sintesi di cDNA, con controlli di qualità integrati per garantire l'integrità del campione.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico generando letture trascrizionali riproducibili per la chiarificazione dei percorsi biologici e la valutazione della fiducia sui bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce cDNA ad alta purezza adatto ad applicazioni successive come RT-PCR e analisi con microarray, consentendo uno screening affidabile di composti.
- Valore operativo: Fornisce rese e parametri qualitativi costanti dell'RNA (ad esempio, rapporti NanoDrop, elettroforesi su gel) che supportano la standardizzazione dei saggi tra esperimenti diversi.
- Scalabilità: Utilizza kit disponibili in commercio e reagenti standardizzati, facilitando l'adattamento a flussi di lavoro ad alto rendimento in ambito di biologia della scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Genera cDNA da embrioni di zebrafish, un sistema rilevante per le malattie, consentendo studi meccanicistici che collegano la scoperta alla validazione preclinica.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Fornisce dati quantitativi sull'espressione genica che informano decisioni di avanzamento o interruzione riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi bersaglio.
- Allineamento dei Biomarcatori: Favorisce l'identificazione di biomarcatori trascrizionali che possono essere monitorati attraverso stadi di sviluppo e condizioni di trattamento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, sostenendo la verifica delle ipotesi nei modelli di zebrafish prima di passare alle fasi di identificazione del capostipite e di validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi attraverso l'analisi quantitativa dell'espressione genica in un sistema vertebrale.
- Screening: Produce risultati standardizzati di cDNA adatti a una valutazione affidabile di composti in saggi di espressione genica.
- Analisi: Fornisce rese quantificabili di RNA e cDNA con parametri qualitativi (ad esempio, rapporti 260/280, bande di RNA ribosomiale) che consentono il confronto tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dalla scoperta al lavoro preclinico fornendo dati trascrizionali rilevanti per le malattie ottenuti da embrioni di zebrafish.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'isolamento di RNA e la sintesi di cDNA applicabile a molteplici bersagli e paradigmi sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo il rischio di degradazione dell'RNA e garantendo l'integrità del campione.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie a punti di controllo della qualità e kit commerciali validati.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi mediante dati affidabili sull'espressione genica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio fornendo dati trascrizionali quantitativi per il confronto tra obiettivi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA e nell'uso di tecniche prive di RNasi per prevenire il degrado del campione.
- Presuppone l'accesso a strumenti di centrifugazione, spettrofotometri (ad esempio, NanoDrop) e, in via opzionale, bioanalizzatori per il controllo di qualità.
- Necessita di flussi di lavoro standardizzati tra i diversi gruppi per garantire metriche di resa e qualità dell'RNA costanti.
- È necessario prevedere adattamenti specifici del modello quando si applica il protocollo a diverse fasi di sviluppo o ceppi di pesce zebra.
- Limitazione pratica: l'instabilità dell'RNA richiede una lavorazione rapida e il mantenimento in freddo per preservare l'integrità del campione nelle applicazioni successive.
Domande frequenti di biotecnologie farmaceutiche
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Extraction of Total RNA using TRIzol Reagent
0:41
Introduction
7:57
cDNA Synthesis using the Invitrogen SuperScript First-Strand System
3:55
RNA Cleanup using the Qiagen RNEasy Mini Kit
10:28
cDNA Isolation and Precipitation
14:57
Conclusion
13:50
Representative Results/Outcome
