Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

Questa procedura inizia con un cDNA sintetizzato a partire da un modello di RNA di alta qualità. Il cDNA viene innanzitutto marcato con il colorante fluorescente SI three. Al termine della reazione di marcatura, il cDNA marcato viene purificato, isolato e la qualità della reazione di marcatura viene valutata.

Il cDNA marcato viene quindi ibridato su un microarray. Dopo l'ibridazione, gli array vengono analizzati per determinare i livelli relativi di espressione genica nei campioni. Salve, mi chiamo Sam Peterson del laboratorio della dottoressa Jennifer Freeman della Scuola di Scienze della Salute della Purdue University.

In precedenza, ti abbiamo mostrato come estrarre l'RNA da embrioni di zebrafish e convertire tale RNA in CDNA. Oggi ti illustreremo la procedura per etichettare e ibridare tale CDNA su una piattaforma di microarray a oligonucleotidi di zebrafish, al fine di studiare i profili di espressione genica globale. Tipicamente, utilizziamo questa procedura per studiare l'espressione genica differenziale in risposta all'esposizione a una tossina.

Cominciamo. L'esperimento con microarray richiede un ambiente luminoso minimo per prevenire la degradazione fotochimica del colorante fluorescente SI three utilizzato nell'etichettatura. Per iniziare l'etichettatura del CD NA con sci three haw, utilizzare i seguenti componenti del sistema di etichettatura genomica bio prime array CGH: tampone di primer casuale 2,5 x, mix 10 X-D-C-T-P e acqua libera da nucleasi. Inoltre, scongelare il stock da un millimolare del DCTP marcatore SI three. Dopo lo scongelamento, centrifugare brevemente i reagenti in un tubo con pareti spesse da 0,6 millilitri e unire.

500 nanogrammi di cDNA, 40 microlitri, 2,5 x tampone con primer casuale e acqua libera da nucleasi per ottenere un volume totale di 86 microlitri. Mescolare bene e centrifugare brevemente, quindi incubare la reazione a cento gradi Celsius in un termociclatore per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire immediatamente la reazione in una miscela ghiacciata per 10 minuti.

Successivamente, prelevare l'eso DNA polimerasi dal congelatore e posizionarla sul ghiaccio. Aggiungere quindi nel tubo della reazione 10 microlitri della miscela 10 X-D-C-T-P, 2 microlitri del SI 3D CTP 1 millimolare e 2 microlitri della XO cleanout DNA polimerasi, mescolare bene ed eseguire una breve centrifugazione. Infine, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 16 ore in un termociclatore quando l'etichettatura sarà terminata.

Procedere alla purificazione e precipitazione del cDNA marcato. Per iniziare la purificazione del cDNA marcato, inserire una colonna MicroCon in una provetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 300 microlitri di 0,1 XSSC sulla colonna e quindi aggiungere la reazione di marcatura. Centrifugare la colonna a 16.100 ×g per 10 minuti a quattro gradi SIUs. Si noti che il flusso in uscita potrebbe essere leggermente rosa.

Scartare il flusso iniziale e aggiungere altri 300 microlitri di 0,1 XSSE nella colonna. Quindi ripetere la centrifugazione a 16.100 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Nuovamente, scartare il flusso iniziale e aggiungere ulteriori 300 microlitri di 0,1 XSSC nella colonna; ora centrifugare a 16.100 ×g per 12 minuti a quattro gradi Celsius dopo questo ultimo lavaggio.

Il flusso in uscita dovrebbe essere limpido e il cDNA etichettato in rosa è visibile sulla colonna. Nuovamente, scartare il flusso in uscita da questo ultimo lavaggio per evitare il cDNA etichettato. Aggiungere 100 microlitri di acqua priva di nucleasi alla colonna. Rimuovere la colonna dal microtubo e capovolgerla in un nuovo tubo.

Quindi centrifugare la colonna capovolta a 2.300 ×g per due minuti a quattro gradi Celsius. Il cDNA marcato è disciolto in acqua nella parte inferiore del tubo. Verificare il cDNA ottenuto mediante uno spettrofotometro NanoDrop ND 1000 seguendo le istruzioni del produttore.

Calcolare la concentrazione del DNA e valutare l'incorporazione del colorante come descritto nel protocollo scritto allegato. Se il cDNA è sufficientemente marcato, aggiungere sei microgrammi in un nuovo tubo per precipitare la miscela di cDNA marcato con 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M a pH 5,2 e un volume di isopropanolo, incubando al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.

Tenendo presente che tutti i passaggi fino a questo punto sono stati eseguiti in un ambiente con luce minima. Quindi centrifugare il campione a 16.100 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, scartare con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet di DNA, che è di colore rosa.

Infine, lavaggio aggiungendo 500 microlitri di etanolo al 70% e mescolando con inversione delicata, centrifugare a 16.100 ×g per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il soprannatante, capovolgere il tubo e lasciare asciugare il pellet per cinque minuti. Il cDNA marcato è pronto per l'ibridazione.

Prima di iniziare l'ibridazione, accendere il sistema di ibridazione nimble gen e lasciarlo equilibrare a 42 gradi Celsius. Iniziare sciogliendo il pellet di CD NA marcato in cinque microlitri di acqua priva di nucleasi. Aggiungere i componenti di ibridazione dal kit di ibridazione Roche Nimble Gen, ovvero buffer di ibridazione, ibridazione A e oligo di allineamento, fino a un volume totale di 18 microlitri, come indicato nel protocollo scritto allegato.

Mescolare bene e centrifugare brevemente il tubo per raccogliere il contenuto sul fondo. Successivamente, denaturare il cDNA marcato ponendo il tubo a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire immediatamente il tubo al sistema di ibridazione nimble gen fino a quando le matrici non sono pronte.

Si noti che le microarray richiedono una manipolazione e una conservazione attente. Le array Roche NimbleGen vanno conservate al buio, in presenza di disidratante, a temperatura ambiente. Inserire l'array nello strumento di allineamento del mescolatore di precisione.

Caricare il mix di PMA T nell'apparecchio X nel PMA T e rimuovere la striscia adesiva con pinzette. Con l'apparecchio e il mix inseriti, chiudere accuratamente il PMA T. Successivamente, separare l'apparecchio e il mix dal PMA T esercitando pressione sul mix attraverso il foro nel PMA t.

Infine, utilizzare un rullo per applicare pressione lungo il bordo esterno del miscelatore al fine di garantire che l'array sia sigillato e per rimuovere eventuali bolle d'aria. Successivamente, posizionare il complesso formato dall'array e dal miscelatore sul sistema di ibridazione per riscaldarlo e caricare il campione di cDNA sull'array. Utilizzare il dispositivo di spostamento in modo lento e con pressione costante.

Aggiungere 15 microlitri del campione marcato nel foro di riempimento al centro del mescolatore. Rimuovere eventuali eccessi di campione dai fori e sigillarli con strisce adesive. Quindi chiudere la levetta di chiusura.

Ora iniziare a miscelare la soluzione di ibridazione utilizzando il programma B sul sistema di ibridazione nimble gen. Lasciare che l'ibridazione dell'array avvenga per 16-20 ore. Dopo l'ibridazione, l'array verrà lavato e scansionato quando l'ibridazione sarà quasi completata. Prepararsi alla scansione accendendo lo scanner per array gene picks 4,000 B e lasciarlo riscaldare per circa 15 minuti.

Successivamente, preparare i tamponi di lavaggio uno A, uno B due e tre come indicato nel protocollo scritto allegato. Riscaldare preventivamente il tampone di lavaggio uno A a 42 gradi Celsius, ma mantenere gli altri tamponi a temperatura ambiente. Quando il tampone di lavaggio uno A si è riscaldato, versarlo in una piastra.

Immergere un portaoggetti nel buffer di lavaggio uno B. Ora rimuovere il complesso array mixer dal sistema di ibridazione nimble gen e inserirlo nel dispositivo di supporto. Iniziare il lavaggio immergendo l'insieme nel buffer di lavaggio preriscaldato uno A e rimuovere con attenzione il mixer staccandolo delicatamente dal vetrino. Successivamente, rimuovere l'array dal dispositivo di supporto e agitare per 15 secondi nel buffer di lavaggio uno A. Trasferire rapidamente l'array in un portaoggetti immerso nel buffer di lavaggio uno B e agitare vigorosamente il portaoggetti per due minuti.

Trasferire quindi il portaoggetti nel secondo buffer di lavaggio e agitare per un minuto. Infine, trasferire il portaoggetti nel terzo buffer di lavaggio e agitare per 15 secondi. Completare il lavaggio trasferendo l'array nella centrifuga per l'essiccazione dei vetrini e centrifugare per due minuti.

Scansionare immediatamente l'array poiché il D è sensibile alla luce e all'ozono; avviare la scansione posizionando il codice a barre dell'array verso il basso nello scanner per array gene picks 4,000 B. Nella finestra di dialogo delle impostazioni hardware, impostare il laser a 532 nanometri con un valore PMT di 500, la potenza al 100%, la dimensione del pixel a cinque micron, il numero di linee da mediare a uno e la posizione del fuoco a zero micron. Al termine dell'installazione, visualizzare in anteprima l'array.

Scegliere un'area da scansionare e quindi scansionarla. Al termine della scansione, verificare l'istogramma dell'immagine. Idealmente, un conteggio normalizzato di uno E meno cinque dovrebbe trovarsi al limite di saturazione di 65.000, il che significa che circa dall'1 al 2% delle caratteristiche è saturo.

Se i conteggi normalizzati sono inferiori a uno E meno cinque, aumentare il guadagno del PMT e rieseguire la scansione del vetrino. Se i conteggi normalizzati sono superiori a uno E meno cinque, ridurre il guadagno del PMT, rieseguire la scansione del vetrino, salvare l'immagine e utilizzare un programma di analisi dati per la normalizzazione dei dati e il calcolo dei valori di intensità. La reazione di marcatura produce regolarmente almeno 10 microgrammi di cDNA marcato.

L'incorporazione del colorante può essere calcolata utilizzando un semplice rapporto di base del colorante in cui il rapporto tra nucleotide e SI tre equivale al rapporto tra A 260 e A 550 moltiplicato per 23,15. Una reazione soddisfacente produrrà un valore compreso tra 50 e 80. Un'ibridazione accettabile avrà dall'1 al 2% delle caratteristiche saturate.

Un conteggio normalizzato di 1 × 10⁻⁵ al limite di saturazione di 65.000. Con il valore PMT impostato, la qualità dell'ibridazione può essere valutata anche qualitativamente osservando l'immagine scannerizzata del microarray e valutando l'intensità degli oligonucleotidi allineati rispetto ad altre caratteristiche dell'array. L'immagine scannerizzata deve inoltre essere esaminata alla ricerca di macchie particolari o di polvere all'interno dell'area dell'array.

Nell'analisi successiva, un diagramma a dispersione può essere utilizzato per rappresentare visivamente i dati analizzati al fine di determinare i livelli relativi di espressione genica nei campioni e identificare i geni espressi in modo differenziale. I geni espressi in modo differenziale si discosteranno in modo significativo dalla linea di migliore adattamento in un procedimento complementare. Abbiamo illustrato come estrarre l'RNA da embrioni di zebrafish per sintetizzare cDNA. Qui abbiamo mostrato come etichettare e ibridare il cDNA su una piattaforma di micromatrici oligonucleotidiche per studiare i profili di espressione genica globale.

Quando si esegue questa procedura, ricordare sempre di utilizzare CD NA di alta qualità ed evitare di esporre il colorante site three alla luce diretta. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.