Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

Questa procedura inizia con il CDNA che è stato sintetizzato da un modello di RNA di alta qualità. Il CDNA viene prima etichettato con il colorante fluorescente SI three. Al termine della reazione di marcatura, il CDNA marcato viene purificato, isolato e viene valutata la qualità della reazione di marcatura.

Il CDNA marcato viene quindi ibridato su un microarray. Dopo l'ibridazione, gli array vengono analizzati per determinare i livelli relativi di espressione genica nei campioni. Ciao, mi chiamo Sam Peterson del laboratorio della dottoressa Jennifer Freeman presso la School of Health Sciences della Purdue University.

In precedenza, vi abbiamo mostrato come estrarre l'RNA dagli embrioni di zebrafish e trasformare quell'RNA in CDNA. Oggi vi mostreremo la procedura per la marcatura e l'ibridazione di quel CDNA su una piattaforma di microarray di oligonucleotidi zebrafish per studiare i profili di espressione genica globale. Tipicamente, utilizziamo questa procedura per studiare l'espressione genica differenziale in risposta a un'esposizione a una tossina.

Quindi iniziamo. L'esperimento del microarray richiede un ambiente di luce minimo per prevenire la fotodegradazione del colorante fluorescente SI tre utilizzato nell'etichettatura per iniziare a marcare il CD NA con sci tre haw i seguenti componenti del sistema di etichettatura genomica CGH bio prime array 2,5 x tampone primer casuale, miscela 10 X-D-C-T-P e acqua priva di nucleasi. Inoltre, scongelare il ceppo millimolare del DCTP marcato SI three dopo lo scongelamento, centrifugare brevemente o reagenti in un tubo a parete spessa 0,6 millilitri combinato.

500 nanogrammi di CDNA 40 microlitri, 2,5 tampone primer casuale e acqua priva di nucleasi per ottenere un volume totale di 86 microlitri. Mescolare bene e centrifugare brevemente, quindi incubare la reazione a cento gradi Celsius in un termociclatore per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire immediatamente la reazione in un bagno di ghiaccio per 10 minuti.

Quindi, togli l'eso-DNA polimerasi dal congelatore e mettila sul ghiaccio. Quindi aggiungere alla provetta di reazione, 10 microlitri di 10 X-D-C-T-P Mescolare due microlitri di SI 3D CTP millimolare e due microlitri di DNA polimerasi di pulizia XO mescolati bene e centrifugare brevemente. Infine, incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 16 ore e un termociclatore al termine dell'etichettatura.

Procedere alla pulizia e alla precipitazione del CDNA etichettato. Per iniziare a pulire il CDNA etichettato. Posizionare una colonna MicroCon in una provetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 300 microlitri nought 0.1 XSSC alla colonna e quindi aggiungere la reazione di etichettatura. Centrifugare la colonna a 16,100 G per 10 minuti a quattro gradi SIU. Si noti che il flusso attraverso potrebbe essere rosa chiaro.

Scartare il flusso e aggiungere altri 300 microlitri di zero 0,1 XSSE alla colonna. Ripetere quindi la centrifugazione a 16, 100 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Ancora una volta, scartare il flusso e aggiungere altri 300 microlitri di T 0,1 XSSC alla colonna ora centrifugare a 16, 100 G per 12 minuti a quattro gradi Celsius dopo quest'ultimo lavaggio.

Il flusso deve essere limpido e il CDNA etichettato in rosa deve essere visibile sulla colonna. Ancora una volta, scartare il flusso di questo lavaggio finale per eludere il CD NA etichettato. Aggiungere 100 microlitri di acqua priva di nucleasi alla colonna. Estrarre la colonna dalla provetta della microcentrifuga e capovolgerla in una nuova provetta.

Quindi centrifugare la colonna invertita a 2, 300 G per due minuti a quattro gradi Celsius. Il CDNA marcato viene disciolto nell'acqua sul fondo del tubo. Controllare il CDNA alluso utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop ND 1000 secondo le istruzioni del produttore.

Calcolare la concentrazione di DNA e valutare l'incorporazione del colorante come descritto nel protocollo scritto allegato. Se il CDNA è sufficientemente marcato, mettere sei microgrammi in una nuova provetta per precipitare la miscela di CD NA marcata in naut 0,1 x volume di acetato di sodio a tre molari a pH 5,2 e uno x volume. Isopropanolo in incubazione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.

Tenendo presente che tutti i passaggi fino a questo punto sono stati eseguiti in un ambiente con luce minima. Quindi centrifugare il campione a 16, 100 G per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, scartare con cura il natante SUP senza disturbare il pellet di DNA, che è rosa.

Infine lavato con l'aggiunta di 500 microlitri, etanolo al 70% e miscelato con centrifuga a inversione delicata a 16, 100 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il supinato, capovolgere il tubo e lasciare asciugare il pellet per cinque minuti. Il CDNA marcato è pronto per l'ibridazione.

Prima di iniziare l'ibridazione, accendere il sistema di ibridazione agile e lasciarlo equilibrare a 42 gradi Celsius. Inizia sciogliendo il pellet CD NA etichettato in cinque microlitri di acqua priva di nucleasi nel pellet disciolto. Aggiungere i componenti di ibridazione del kit di ibridazione Roche Nimble Gen, il tampone di ibridazione ibrido A e l'oligo di allineamento per un volume totale di 18 microlitri, come indicato nel protocollo scritto allegato.

Mescolare bene e girare brevemente il tubo per raccogliere il contenuto sul fondo. Successivamente, denaturare, il CDNA etichettato posizionando il tubo a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire immediatamente la provetta al sistema di ibridazione agile fino a quando gli array non sono pronti.

Si noti che i microarray richiedono un'attenta manipolazione e conservazione. Gli array Roche nimble gen sono conservati al buio con essiccante a temperatura ambiente. Caricare l'array nello strumento di allineamento del mixer di precisione.

Il PMA T carica in X un miscelatore sul PMA T e rimuove la striscia adesiva con una pinza. Con l'array e il mixer caricati, chiudere saldamente il PMA T. Quindi, sganciare l'array e il miscelatore dal PMA T applicando pressione al miscelatore attraverso il foro nel PMA t.

Infine, utilizzare un brayer per applicare pressione intorno all'esterno del mixer per assicurarsi che l'array sia sigillato e per rimuovere eventuali bolle. Quindi posizionare il complesso mixer dell'array sul sistema di ibridazione per riscaldarlo, per caricare il campione di CDNA sull'array. Utilizzare il dispositivo di spostamento lentamente e con una pressione costante.

Aggiungere 15 microlitri del campione etichettato nella porta di riempimento al centro del miscelatore. Rimuovere il campione in eccesso dai fori delle porte e sigillarli con strisce adesive. Quindi chiudere il fermo.

Ora inizia a mescolare la soluzione di ibridazione utilizzando il programma B sul sistema di ibridazione agile gen. Lasciare ibridare il microarray per 16-20 ore Dopo l'ibridazione, il microarray verrà lavato e scansionato quando l'ibridazione è in fase di completamento. Preparati per la scansione accendendo lo scanner dell'array di prelevatori genetici 4.000 B e lascialo riscaldare per circa 15 minuti.

Quindi, preparare i tamponi di lavaggio uno, A, uno B, due e tre come indicato nel protocollo scritto allegato. Il tampone di lavaggio prebellico uno A a 42 gradi Celsius, ma lascia gli altri tamponi a temperatura ambiente. Quando il tampone di lavaggio uno A si è riscaldato, versarlo in un piatto.

Immergere un rack per vetrini nel buffer di lavaggio uno B.Ora rimuovere il complesso del miscelatore array dal sistema di ibridazione agile e farlo scorrere nella maschera. Iniziare il lavaggio immergendo il gruppo nel tampone di lavaggio preriscaldato uno A e rimuovere con cautela il miscelatore staccandolo dalla guida. Quindi rimuovere l'array dalla maschera e agitare per 15 secondi nel buffer di lavaggio uno A.Trasferire rapidamente l'array in un rack per vetrini immerso nel buffer di lavaggio uno B e agitare energicamente il rack per vetrini per due minuti.

Quindi trasferire la griglia per vetrini nel tampone di lavaggio due e agitare per un minuto. Infine, trasferire la griglia per vetrini nel tampone di lavaggio tre e agitare per 15 secondi. Terminare le rondelle trasferendo l'array nella centrifuga di asciugatura a vetrino e centrifugare per due minuti dopo la centrifugazione.

Scansiona immediatamente l'array poiché il D è sensibile alla luce e all'ozono, avvia la scansione caricando il codice a barre dell'array nell'array di campioni genetici da 4, 000 B dello scanner. Nel set di finestre di dialogo per le impostazioni hardware, il laser a 532 nanometri ha un valore PMT impostato su 500, imposta la potenza al 100% della dimensione dei pixel a cinque micron, le linee alla media a uno e la posizione di messa a fuoco a zero micron. Al termine della configurazione, visualizzare l'anteprima dell'array.

Scegli un'area da scansionare e quindi scansionala. Una volta completata la scansione, controllare l'istogramma dell'immagine. Idealmente, un E meno cinque conteggi normalizzati dovrebbe essere al limite di 65.000 saturazione, il che significa che circa l'uno o il 2% delle caratteristiche sono sature.

Se i conteggi normalizzati sono inferiori a un E meno cinque, aumentare il guadagno PMT ed eseguire nuovamente la scansione del vetrino. Se i conteggi normalizzati sono maggiori di un E meno cinque, diminuire il guadagno PMT e ripetere la scansione del vetrino, salvare l'immagine e utilizzare un programma di analisi dei dati per la normalizzazione dei dati e il calcolo dei valori di intensità. La reazione di marcatura produce abitualmente almeno 10 microgrammi di CDNA marcato.

L'incorporazione del colorante può essere calcolata utilizzando un semplice rapporto del colorante di base in cui il rapporto nucleotide / SI tre è uguale al rapporto A due 60 a cinque 50 moltiplicato per 23 virgola 15. Una buona reazione si tradurrà in un valore compreso tra 50 e 80. Un'ibridazione accettabile avrà una resa dall'uno al 2% delle caratteristiche sature.

Un E meno cinque conteggi normalizzati al limite di saturazione di 65.000. Con il valore PMT impostato, la qualità dell'ibridazione vicina a 500 può anche essere valutata qualitativamente visualizzando l'immagine scansionata del microarray e valutando l'intensità degli oligo allineati ad altre caratteristiche dell'array. L'immagine scansionata deve anche essere valutata per eventuali macchie particolari o di polvere all'interno dell'area dell'array.

Nell'analisi successiva, un grafico a dispersione può essere utilizzato per visualizzare i dati analizzati per determinare i livelli relativi di espressione genica nei campioni e per identificare i geni espressi in modo differenziale. I geni espressi in modo differenziale si discosteranno in modo significativo dalla linea di adattamento migliore in una procedura complementare. Ti abbiamo mostrato come estrarre l'RNA dagli embrioni di pesce zebra nella sintesi c CD NA. Qui vi abbiamo appena mostrato come marcare e ibridare CD NA su una piattaforma di microraggi oligonucleotidici per studiare i profili di espressione genica globale.

Quando si esegue questa procedura, ricordarsi sempre di utilizzare CD NA di alta qualità ed evitare di esporre il colorante del sito tre all'illuminazione diretta. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.