Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

I vetrini coprioggetti utilizzati in questo saggio sono funzionalizzati con destrina e poi incorporati in celle a flusso microfluidico. Successivamente, ogni cella a flusso viene incubata con una sospensione di liposomi, che si fondono per formare un doppio strato lipidico sopra la destrina idratata. Al microscopio a fluorescenza, vengono aggiunti il virus marcato con fluoro quattro e la streptavidina marcata con fluoresceina e il virus viene lasciato agganciare al doppio strato.

Un afflusso di tampone acido avvia la fusione virale con il doppio strato e una fotocamera digitale registra le variazioni di fluorescenza durante il test. Ciao, sono Daniel Floyd e sono nel laboratorio di Anine Vanian nel Dipartimento di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare dell'Università di Harvard. Oggi vi mostrerò un metodo per visualizzare la cinetica di fusione virale a livello di singola particella.

Usiamo questa procedura in laboratorio per studiare il modo in cui il virus arriva alle cellule ospiti. Quindi iniziamo. Inizia questo protocollo preparando i vetrini funzionalizzati con destrina.

Il primo passo consiste nel sonicare i vetrini coprioggetto in soluzioni di detergente al 10%, acetone idrossido di potassio molare e sonicato di etanolo al 100% per 30 minuti per soluzione. E risciacquare con acqua deionizzata tra una zione e l'altra. Dopo l'ultima sonicazione, sciacquare i vetrini di copertura in acqua, quindi asciugarli nell'incubatrice a 80 gradi Celsius.

Quindi, metti i vetrini coprioggetti in uno stripper al plasma di ossigeno per tre minuti. Questo passaggio ossida la superficie dei vetrini, rendendo il vetro uniformemente idrofilo e reattivo nelle successive fasi di siloizzazione. Successivamente, immergere i vetrini coprioggetti in una soluzione fresca di 0,2% gly oxy propyl trimeth oxypro trim metoxy in isopropanolo e incubare per cinque minuti.

Quindi sciacquare più volte i vetrini coprioggetto con isopropanolo. Posizionare i vetrini coprioggetto rivestiti Slan a 80 gradi Celsius per un'ora. Per polimerizzare questo passaggio consente alla lama di legarsi in modo covalente al vetro.

Dopo l'indurimento, disporre i vetrini copricoperchio all'interno di una scatola di plastica per congelatore. Coprire la superficie superiore di ogni vetrino coprioggetti con circa un millilitro di una soluzione di destrina. 30%peso per volume in acqua.

Chiudere la scatola del congelatore e lasciare i vetrini coprioggetto in un luogo tranquillo per 24-36 ore. Il giorno successivo versare la destrina in eccesso, afferrando i vetrini coprioggetti con una pinza di plastica e rimetterli nella griglia di ceramica. Sciacquateli più volte con acqua e lasciateli in ammollo in acqua per 48 ore.

Il contenitore può essere agitato delicatamente su un rotatore da tavolo, asciugare il coperchio in un forno impostato a 80 gradi Celsius e conservare in un essiccante sottovuoto fino a quando non si è pronti per il passaggio successivo. Rivestire i vetrini coprioggetto con una miscela di liposomi per formare un doppio strato piallante. Il passo successivo consiste nel preparare i liposomi per formare il doppio strato lipidico nella cappa, combinare tutti i lipidi disciolti nel cloroformio in una provetta di vetro.

La formulazione liposomica include il lato dei gangli del dia, che lega le particelle virali e un lipide biotinilato, che lega l'indicatore di pH coniugato con streptavidina fluoresceina. Quindi, far evaporare il solvente sotto un flusso di argon o azoto gassoso. E rimuovere il solvente rimanente lasciando la provetta in un essiccatore sottovuoto per due ore.

Risospendere il film lipidico essiccato in un tampone HNE da 400 microlitri. Quindi trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga di plastica. Congelare la sospensione in un bagno di azoto liquido e scongelarla in un bagno di acqua tiepida.

Ripetere questo ciclo di congelamento e scongelamento quattro volte dopo i cicli di congelamento e scongelamento. Utilizzare un estrusore lipidico dotato di un filtro a membrana da 100 nanometri per estrudere la sospensione lipidica. 25 volte dopo l'estrusione, la sospensione dovrebbe apparire più trasparente.

Conservare i liposomi a temperatura ambiente e utilizzare il giorno della preparazione. Ora che i lipidi sono pronti per l'uso, preparare la cella a flusso microfluidico. Per prima cosa, prendi un vetrino di quarzo da 20 x 20 x tre millimetri e usa una fresa diamantata per praticare due fori da un millimetro sui lati opposti.

Tagliate un quadrato di 20 millimetri da un foglio di nastro biadesivo e usando una lametta. Ritaglia una sezione di 15 per due millimetri dal centro. Staccare un lato del supporto del nastro e far aderire il nastro al vetrino del campo.

Far aderire l'altro lato ad un vetrino coprioggetto funzionalizzato, ora tagliato a 20 centimetri di lunghezza, di tubo di polietilene e inserirli nei fori del vetrino in quarzo. Infine, sigillare la cella di flusso con colla epossidica per cinque minuti. Stendere la colla sui lati del vetrino di quarzo per legarlo al vetrino coprioggetti.

Utilizzare altre due gocce di colla per sigillare il collegamento tra il tubo e il vetrino di quarzo. Quando la colla si è indurita, adescare la cella di flusso e il tubo con il tampone HNE. Successivamente, per creare il doppio strato lipidico supportato, prendere la sospensione liposomica estrusa e aspirare circa 80 microlitri nei canali il giorno prima dell'esperimento di fusione.

Inizia a etichettare le particelle virali per etichettare l'interno virale in rosso. Combinare 20 microlitri di rumina di zolfo o SRB appena preparati con 10 microlitri di sospensione virale e lasciare a temperatura ambiente per 20 ore. Il giorno successivo, rimuovere il colorante in eccesso facendo passare la sospensione virale attraverso una colonna di desalinizzazione PD 10 e diluendo con 800 microlitri di tampone HNE.

La colonna dovrebbe avere una banda colorata evidente, che contiene il virus etichettato. Raccogli questa frazione durante la fase elluciana successiva, etichetta la busta virale in verde aggiungendo 13 microlitri di decalcomania Octa, RUMINE one 10 o RH one 10 C 18 alla sospensione virale marcata SRB. Mescolare la sospensione collegando il tubo a un rotatore da laboratorio e lasciare agire per tre ore.

Quindi, rimuovere l'umidità relativa in eccesso 10 C 18 utilizzando una colonna di desalinizzazione PD 10. Come in precedenza, ora il virus è pronto per il test di fusione. Eseguire il saggio della cinetica di fusione utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a immersione in olio ad alta apertura numerica.

Un laser Argonne krypton eccita i quattro fluoro nella membrana virale e all'interno. Uno specchio dicroico divide quindi le emissioni di fluorescenza rossa e verde e focalizza indipendentemente le immagini su metà separate di un CCD a moltiplicazione di elettroni o di una fotocamera per dispositivi ad accoppiamento di carica. Montare il vetrino coprioggetto sul tavolino del microscopio e collegare il tubo di uscita a una pompa a siringa impostata per un flusso di 100 microlitri al minuto.

Libera i canali di flusso dai liposomi in eccesso versando 300 microlitri di HNE. Metti a fuoco il microscopio e regola la potenza del laser per illuminare la superficie con 350 watt per centimetro quadrato di luce a 488 nanometri per eccitare la flora rossa, quattro e 70 watt per centimetro quadrato di luce a 568 nanometri per eccitare la flora verde. Quattro. Ora che il microscopio è pronto, il virus marcato con la pompa lo diluisce da uno a cento nella cella di flusso.

Quando il virus si diffonde sulla superficie inferiore del canale di flusso, le particelle iniziano ad attraccare. Aderente al lato dei gangli DIA, incorporato nei vetrini coprioggetto, doppio strato planare. Quando la densità delle particelle agganciate raggiunge circa diverse centinaia di particelle per campo visivo, iniziano a fluire in una soluzione di due microgrammi per millilitro.

Streptavidina marcata con fluoresceina, un fluoroforo sensibile al pH poiché la streptavidina marcata si lega alle molecole lipidiche accoppiate alla biotina nel doppio strato. Appare di nuovo uno sfondo verde scuro, lavare il canale di flusso con 300 microlitri di HNE. Ora che i virus si sono agganciati e la superficie del doppio strato è rivestita di fluoresceina, è il momento di iniziare il test.

Scegli un'area di imaging, metti a fuoco il microscopio e prepara la telecamera CCD per l'acquisizione di immagini in time-lapse. Imposta il tempo di esposizione su 100 millisecondi e raccogli fotogrammi a una velocità di 10 hertz. Avviare la fusione della membrana virale facendo scorrere un tampone acido di citrato di sodio.

Quando il pH scende, la fluorescenza della fluoresceina si attenua, individuando il momento dell'acidificazione. La telecamera CCD registra i dati durante il saggio, che è possibile utilizzare per determinare il tempo di emifusione e la scarsa formazione come documentato dalla telecamera CCD. Dopo il calo del pH, ci sono esplosioni di fluorescenza verde quando le membrane virali e pialla si fondono, i lipidi si mescolano e il colorante verde nell'involucro virale viene diluito nella membrana planare.

Al contrario, c'è un decadimento della fluorescenza rossa dopo il calo del pH poiché le membrane virali e lipidiche formano pori che consentono al colorante rosso dall'interno virale di fuoriuscire nello spazio acquoso sotto il doppio strato planare e fuori dalla vista, queste tendenze possono anche essere visualizzate da istantanee fluorescenti prima e durante la fusione. Rappresenta anche graficamente le traiettorie di intensità della fluorescenza per ciascuna particella come mostrato in questo esempio, la fusione Hemi è definita come il punto in cui la pendenza dell'intensità della fluorescenza verde è alla sua formazione di pori più ripida come il punto in cui si verifica il decadimento della fluorescenza rossa. Dati combinati da più esperimenti per generare istogrammi dei tempi di ritardo della fusione emi e della formazione dei pori come mostrato qui, utilizzando il tempo della caduta del pH come t uguale a zero per sincronizzare i dati di diversi esperimenti.

Vi ho appena mostrato un modo per misurare la cinetica di fusione virale a livello di singola particella. Quando si esegue questa procedura. Assicurati di utilizzare vetrini coprioggetto puliti in modo da avere un doppio strato omogeneo e fluido.

Inoltre, cerca di ridurre al minimo la quantità di luce utilizzata durante l'imaging a fluorescenza in modo da ridurre al minimo i danni alle foto. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna per i tuoi esperimenti.