Name: Denaturazione Urea elettroforesi su gel poliacrilammide (PAG Urea) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Impara l'elettroforesi su gel di poliacrilammide con urea per separare DNA o RNA a singolo filamento. Questa tecnica essenziale in biologia molecolare consente l'analisi di oligonucleotidi sintetizzati.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal accademico Singapore Research Council (ARC) [codice di autorizzazione del 90/07]. Ringraziamo radiodurans per il sostegno.

Il protocollo testo completo e dettagliato per questa procedura sperimentale è disponibile nei protocolli di corrente in Biologia Molecolare. Dettagliate passo-passo le istruzioni per il montaggio del panino gel e gel per apparecchi possono essere trovati sul sito web BioRad 3. Attrezzatura richiesta: Lastre di vetro (interno ed esterno) 10 celle cm: 10,1 x 7,3 cm (disco interno), 10,1 x 8,2 cm (piastra esterna), BioRad 20 celle cm: 20 x 20 cm (lastra interna), 20 x 22,3 centimetri (piastra esterna), BioRad 0,5-1,5 pettine gel mm e distanziali Gel fusione stare Apparato gel con coperchio e cavi Alimentatore ad alta tensione Riscaldamento blocco o bagnomaria Pipette sierologiche e aiuto pipetta Pipette e puntali Gel essiccatore o uno scanner Reagenti e soluzioni: Urea (ultrapuro) Poliacrilammide soluzione al 40% (29:1) 10 x soluzione di TBE (Tris-borato, EDTA buffer) Deionizzata, acqua distillata TEMED 30% (w / v) di soluzione di persolfato di ammonio 0,5 x TBE soluzione Formammide EDTA Cyanol Xilene Blu di bromofenolo Metanolo Etanolo <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Volume </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 ml </td></tr><tr><td> Concentrazione di acrilamide </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td></tr><tr><td> g UREA </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td></tr><tr><td> ml 40% Acryl (29:1) </td><td> 12,5 </td><td> 15,625 </td><td> 18,75 </td><td> 15 </td><td> 18,75 </td><td> 22,5 </td><td> 2,5 </td><td> 3,125 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> ul APS 30% </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ul TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 x TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> Riempire il volume con acqua deionizzata, acqua distillata </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Reagenti e soluzioni necessarie per le concentrazioni di acrilamide e vari volumi per la risoluzione di oligonucleotidi singolo filamento Gel di assemblaggio sandwich e gel di preparazione <ol><li> Montare il gel secondo la descrizione di produttori e fissare il gel in gel-casting da camera 3. Utilizzare distanziatori 0,5-1,5 mm di spessore. </li><li> Preparare la soluzione appropriata poliacrilamide in base alle attuali protocolli di biologia molecolare o come indicato nella Tabella 1. Per un gel di acrilammide denaturante di 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml di soluzione di gel e per un 10,1 x 8,2 centimetri x 1 mm gel 5 ml di soluzione di gel è sufficiente. Grandi gel sono usati quando i prodotti attesi / bande sono all&#39;interno della gamma di alcune basi, poi un gel più risolverà bande con una differenza di un singolo nucleotide. Se le bande atteso differiscono in più di 10 nucleotidi, piccoli gel sarà adatto a risolvere i frammenti. Scegli la percentuale di poliacrilammide che si adatta alle vostre esigenze di separazione, una più alta concentrazione di poliacrilamide risolverà inferiore frammenti di peso molecolare. Usa urea ultrapura e mescolare con la quantità desiderata di acrilamide. Aggiungi tampone TBE alla miscela di gel per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1 x TBE e riempire il volume con acqua deionizzata, acqua distillata. Riscaldare la soluzione per 20 secondi nel microonde e mescolare delicatamente. Per i volumi gel più ripetere questo passaggio fino a quando la soluzione è la mano calda. </li><li> Versare il gel immediatamente con una pipetta sierologica e un aiuto pipetta automatica tra le due lastre di vetro. Evitare di introdurre bolle d&#39;aria. Inserire il pettine e lasciare polimerizzare il gel per 30-60 minuti. </li></ol> Sistemare il dispositivo di elettroforesi e prerun il gel <ol><li> Smontare il gel dalla camera di fusione e di montaggio per l&#39;apparato gel in base alle istruzioni produce 3. </li><li> Riempire la camera bassa del buffer buffer di ingegno in esecuzione (0.5-1 x TBE) che le lastre di vetro saranno subfuse 2-3 cm con tampone. Riempire la camera alta del buffer fino alla parte superiore del gel con la gestione del buffer. </li><li> Rimuovere con attenzione il pettine e lavare i pozzetti con tampone di corsa, utilizzando una pipetta e gel punte di carico. </li><li> Fissare il coperchio del sistema gel e collegare i cavi ad una alimentazione ad alta tensione. Prima di poter caricare i campioni è necessario prerun il gel per almeno 30 minuti per scaldare il gel e per rimuovere l&#39;urea rimanenti dal gel. La temperatura ottimale dovrebbe essere tra 45-55 ° C. Evitare temperature superiori a 60 ° C come bande potrebbe striscio o le lastre di vetro potrebbe rompersi. Scegli watt costante per il prerun (15-25 W per gel). </li></ol> Preparazione del campione <ol><li> Nel frattempo preparare i campioni. Quindi, aggiungere la quantità appropriata di 2 mix di caricamento del gel x per il campione. Il mix di caricamento di solito contiene il 90% formammide, 0,5% EDTA, cyanol 0,1% xilene e 0,1% blu di bromofenolo. </li><li> Prima che i campioni possono essere caricati sul gel, i campioni devono essere denaturato calore riscaldando i campioni tra i 70-90 ° C per qualche minuto. </li></ol> Caricare ed eseguire il gel <ol><li> Quando il prerun è terminata, togliere il coperchio e lavare accuratamente le tasche, come descritto prima che l&#39;urea ha colato nei pozzetti. </li><li> Applicare i campioni con attenzione dal fondo della tasca. Evitare di introdurre bolle d&#39;aria. Caricamento del buffer deve essere applicata a tasche vuote per mantenere la parità di condizioni durante la corsa. </li><li> Montare il coperchio ed eseguire il gel a watt costante per mantenere una temperatura gel di 55 ° C simile al prerun. Osservare la migrazione dei coloranti marcatore fino a quando il fronte del colorante raggiunge l&#39;estremità inferiore del gel. La durata di esecuzione dipende dalla percentuale di acrilammide utilizzati, forza ionica del tampone e lo spessore del gel. Una corsa può durare da 2-4 ore. Controllare la temperatura del gel. Un termometro gel può aiutare a controllare la giusta temperatura durante la corsa. </li></ol> Processo il gel <ol><li> Quando il fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel messo il gel dalla camera bassa del buffer. Rimuovere il gel dalla camera e allentare i morsetti. Tirare fuori i distanziali e con attenzione dissimulare le lastre di vetro. Se necessario tagliare la parte superiore pozzetto contenente gel. </li><li> Con attenzione trasferire il gel in un piatto con una soluzione di gel di fissazione (stessa concentrazione di metanolo TBE più 5-10% ed etanolo). Lascia il gel nella soluzione per 5-10 minuti e cambia il buffer due volte. </li><li> Il gel è pronto per l&#39;ulteriore elaborazione con essiccatore gel vuoto o la scansione diretta del gel. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

<ol><li> La nitidezza banda dipende da diversi fattori. Il volume di campione caricato per bande forte deve essere il più piccolo possibile, cioè idealmente tra 1-5 microlitri. Tuttavia, fino a 15 microlitri può essere caricato che assicura ancora la risoluzione accettabile. Meno volume risultati dei campioni in più nitide bande. </li><li> La qualità di banda dipende anche dallo spessore del gel. Diluente gel, come ad esempio 0,75 millimetri mostrano risultati migliori gel a 1,5 mm di spessore. </li><li> La forma delle bande può anche essere in...

denaturazione urea elettroforesi su gel poliacrilammide (pag urea)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

PAGINA urea o denaturazione poliacrilammide gel elettroforesi urea impiega 6-8 M urea, che denatura il DNA o le strutture secondarie dell&#39;RNA e viene utilizzato per la loro separazione in una matrice di gel di poliacrilammide in base al peso molecolare. Frammenti da 2 a 500 basi, con differenze di lunghezza piccolo come un singolo nucleotide, possono essere separati con questo metodo 1. La migrazione del campione dipende dalla concentrazione di acrilamide scelto. Una percentuale più alta di poliacrilammide risolve frammenti di peso molecolare inferiore. La combinazione di urea e temperature di 45-55 ° C durante la corsa del gel consente la separazione del DNA non strutturati o di molecole di RNA. In generale, questo metodo è necessario per analizzare o purificare DNA a singolo filamento o di frammenti di RNA, come oligonucleotidi sintetizzati o etichettati o prodotti da reazioni enzimatiche scissione. In questo articolo mostriamo il video come preparare ed eseguire il gel di poliacrilammide denaturante di urea. Consigli tecnici sono inclusi, oltre ai 1,2 protocollo originale.

Denaturazione poliacrilammide gel elettroforesi urea viene utilizzato per separare singolo filamento di DNA o RNA fino ad un limite di 500 nucleotidi. Urea in combinazione con i campioni di calore denatura e non strutturati singoli filamenti migrano all&#39;interno della matrice gel in base al loro peso molecolare.

Denaturazione Urea elettroforesi su gel poliacrilammide (PAG Urea)

L'elettroforesi su gel di poliacrilammide in urea (Urea PAGE) o l'elettroforesi denaturante su gel di poliacrilammide in urea utilizza urea 6-8 M, che denatura le strutture secondarie del DNA o dell'RNA ed è impiegata per la loro...

In generale, questo tipo di gel è necessario per separare frammenti di DNA o RNA a singolo filamento, come oligonucleotidi sintetizzati o marcati oppure prodotti derivanti da reazioni di scissione enzimatica. L'intervallo di separazione dipende dalla concentrazione di poliacrilamide, dalla presenza di urea e dall'applicazione di calore per la denaturazione del campione; le molecole a singolo filamento migrano all'interno della matrice del gel in base al loro peso molecolare. Questo video illustra la preparazione, l'esecuzione e l'elaborazione di un gel tipico.Ciao, mi chiamo Haki. Sono dell'Università Tecnologica di Nang. In questa dimostrazione, vi mostrerò come eseguire un'elettroforesi su gel poliacrilammide denaturante.Utilizzare piastre di vetro pulite e assemblare il sandwich per gel seguendo le istruzioni del produttore. Fissare il gel nella camera standard per la colatura dei gel. Izzare le piastre di vetro dei gel grandi se il gel tende ad aderire alle piastre di vetro.Scegliere la dimensione e lo spessore del gel in base ai requisiti di separazione. Preparare la soluzione del gel. Secondo i protocolli attuali in biologia molecolare.Scegliere una concentrazione di poliacrilamide adatta ai requisiti di separazione. Percentuali più elevate di acrilamide consentono una migliore risoluzione di frammenti con peso molecolare più basso. Utilizzare Alta pure UIA e mescolare con la quantità desiderata di poliacrilamide in un becher o in una bottiglia.Aggiungere 10 XTBE buffer alla soluzione e portare al volume richiesto con acqua. Riscaldare la soluzione per 20 secondi al microonde e mescolare delicatamente fino a quando tutto l'UIA si è sciolto. Se necessario, la soluzione può essere conservata per volumi maggiori di gel.Ripetere il passaggio al microonde fino a quando la soluzione non diventa tiepida al tatto. Evitare di riscaldare eccessivamente la soluzione. Non surriscaldare perché l'urea inizia a degradarsi dopo i 60 gradi.Il centigrado può essere rilevato dall'odore di ammoniaca. Quando la soluzione è chiara e si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere PS e tamid alla soluzione del gel e mescolare delicatamente. Se la soluzione del gel è troppo calda, il gel polimerizzerà all'interno della pipetta.Versare il gel utilizzando una pipetta serologica e poi un ausilio per pipetta tra le due piastre di vetro. Evitare di introdurre bolle d'aria. Inserire con attenzione il tecom.Cercare di non intrappolare bolle d'aria e lasciare polimerizzare il gel per 30-60 minuti. Rimuovere il gel dalla piastra di colata e assemblarlo nella camera superiore del tampone. Inserire il gel nella camera inferiore del tampone seguendo il protocollo del produttore e riempire il serbatoio inferiore con il tampone di corsa per gel, normalmente 0,5-1X TBE.Con la stessa concentrazione utilizzata per il gel, riempire la camera superiore del tampone con tampone di corsa per gel fino al bordo della lastra di vetro. Prima di caricare i campioni, è necessario far pre-correre il gel per almeno 30 minuti per riscaldarlo e rimuovere l'urea residua dal gel. La temperatura ottimale deve essere compresa tra 45 e 55 gradi centigradi, come per la corsa effettiva del gel.Evitare temperature superiori a 60 gradi poiché le bande potrebbero sfumare o le lastre di vetro potrebbero incrinarsi con attenzione. Rimuovere il tampone senza disturbare i bordi e risciacquare i pozzetti attraverso di esso per rimuovere l'urea che è fuoriuscita in essi. Utilizzare punte per il caricamento dei gel e pipettare su e giù diverse volte.Per ciascuno, fissare il coperchio del sistema per gel e collegare i cavi a un alimentatore ad alta tensione. Scegliere watt costanti per la pre-correnza, circa 15-20 watt per gel. Quando l'alimentatore viene acceso, la formazione di bolle d'aria indica una buona conducibilità.Nel frattempo, preparare i campioni, aggiungendo quindi la quantità appropriata di due x tampone di caricamento al campione. Al termine della precorsa, rimuovere il coperchio e lavare accuratamente la tasca come descritto in precedenza; è molto importante risciacquare con cura le tasche del gel per rimuovere i residui di urea, poiché l'urea formerà uno strato denso che ostacola l'ingresso del campione nel gel.Proprio davanti a te. Applica il riscaldamento del campione, incubandolo ad almeno 70 gradi centigradi per alcuni minuti. Applica i campioni con attenzione partendo dal fondo della tasca.Per alcune applicazioni, il colorante interferisce con il campione e può causare bande diffuse, oppure il colorante mostra un segnale fluorescente. In tal caso è utile rimuovere un colorante o tutti i coloranti e caricare il tampone contenente il colorante standard. In un pozzetto vuoto, lo standard di dimensione, la quantità di campione che si dovrebbe caricare per ottenere bande nitide è idealmente compresa tra uno e cinque microlitri, ma è possibile caricare anche volumi più elevati fino a 15 microlitri.Un volume minore di campione produce bande più nitide. Evitare di introdurre bolle d'aria e lasciare che il campione affondi lentamente nella tasca in modo da formare uno strato uniforme. Se si utilizza una marcatura fluorescente, avvolgere il sistema elettroforetico in alluminio per proteggerlo dalla luce, che potrebbe causare il fotobiancamento del campione.Assemblare il coperchio e accendere l'alimentazione elettrica. Far correre il gel fino a quando il fronte del DIA ha raggiunto l'estremità inferiore del gel. La durata dell'elettroforesi dipende dalla percentuale di acrilamide.Si sceglie la forza ionica, lo spessore e la lunghezza del gel tampone. Una corsa può durare da una a diverse ore. Osservare la migrazione dei marcatori per determinare la durata dell'elettroforesi.Utilizzare watt costanti e controllare la temperatura del gel. Un termometro per gel può aiutare a monitorare la temperatura corretta durante la corsa oppure consultare il manuale dell'apparecchio per gel quando il dron ha raggiunto la fine. Spegnere l'alimentazione e rimuovere il coperchio dell'apparecchio per gel.Successivamente, rimuovere il panino gel dalla camera inferiore del tampone. Versare via il tampone dalla camera superiore. Riempire una vaschetta con soluzione di fissaggio del gel.Questa soluzione dovrebbe avere la stessa concentrazione di TB e tra il 5% e il 10% di metanolo e acido acetico. Rimuovere il panino di gel dall'apparecchio e allentare le pinze. Allontanare le distanziali e smontare con cura le piastre di vetro utilizzando una spatola. Se necessario, tagliare via un po' di gel da un pozzetto contenente la parte di gel o dalla parte inferiore vuota del gel e scartare i frammenti inutili di gel, come le corsie contenenti il colorante.Per campioni fluorescenti, staccare con attenzione il gel dalla lastra di vetro e trasferirlo in una vaschetta riempita con soluzione di fissaggio del gel. Lasciare il gel nella soluzione per cinque-dieci minuti e cambiare il tampone due volte. Agitare delicatamente la vaschetta per eliminare l'urea dal gel oppure mettere il gel nella soluzione di colorazione, a seconda dell'applicazione.La qualità del gel dipende anche dallo spessore del gel. I gel più sottili, come quelli di 0,75 millimetri, mostrano risultati migliori rispetto ai gel spessi 1,5 millimetri, ma sono più difficili da manipolare. La nitidezza delle bande dipende da diversi fattori.Una bassa tensione all'inizio della corsa può contribuire a ottenere bande più nitide, poiché il campione entra uniformemente nel fronte del gel, evitando il collasso delle pozzette del gel dovuto a un'elevata tensione. Un gel di raccolta (stacking gel) di breve durata e con una bassa percentuale di acrilamide può avere lo stesso effetto di affinamento delle bande; l'aggiunta di Glicerolo al 10% aiuta inoltre durante il caricamento del gel, facendo sì che il campione affondi correttamente nel pozzetto. Applicare più facilmente il buffer di caricamento nelle pozzette vuote per mantenere condizioni uniformi durante la corsa.Quando il tuo gel è in soluzione di fissazione, puoi essiccare il gel utilizzando un essiccatore per gel a vuoto per un'ulteriore analisi oppure scansionare direttamente il gel, a seconda dell'etichetta o della colorazione che stai utilizzando. Questa pagina U è utile per analizzare o isolare campioni di DNA o RNA a singolo filamento. I gel possono essere conservati a temperatura ambiente.Pertanto, avvolgere il gel in un tovagliolo di carta e inzupparlo con acqua o tampone in circolazione. Inserire il gel avvolto e bagnato in un sacchetto di plastica ermetico e utilizzarlo entro 48 ore. Un problema spesso osservato è il fenomeno del "gel smiling".Ciò è dovuto a una distribuzione irregolare del calore attraverso il gel. Se il gel non è circondato da tampone, l'aggiunta di una piastra metallica può migliorare la qualità del gel. Ciao, sono Hi Kasam.Sono della N Yang Technological University. Vi ho mostrato come eseguire una polimerasi in condizioni denaturanti. Alla prossima.

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