Name: Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Scopri come utilizzare un array fluidico parallelo per il targeting virale di circuiti cerebrali intatti in 3D. Questo metodo consente la manipolazione ottica di circuiti neurali specifici nei topi, migliorando l'efficienza della ricerca in neuroscienza.

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ESB riconosce finanziamento da Innovator Award nuovo direttore NIH (DP2 OD002002-01), NIH sovvenzione sfida 1RC1MH088182-01, NIH Grande opportunità di Grant 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0.835.878 e 0.848.804), il McGovern Institute Award Program Neurotechnology , il Dipartimento della Difesa, NARSAD, l&#39;Alfred P. Sloan Foundation, Jerry e Marge Burnett, il Premio per l&#39;Innovazione SFN Ricerca in Neuroscienze, il MIT Media Lab, la Fondazione Benesse, e il Wallace H. Coulter Foundation.

1. Costruire Morsetto Stereotassica <ol><li> Il morsetto stereotassica viene utilizzato per collegare l&#39;array iniettore al stereotax, in modo che gli iniettori sono parallele al braccio stereotassica. </li><li> Ogni laboratorio ha bisogno di un solo morsetto, a meno che non si prevede che più di un intervento chirurgico può avvenire contemporaneamente. In questo caso, fanno lo stesso numero il numero massimo previsto di interventi simultanei. Potrebbe anche essere consigliabile fare un ulteriore, in caso di danni al primo. </li><li> Per rendere il morsetto stereotassica, in primo luogo, un diametro 1,5 mm esterno (OD) in acciaio cannula viene tagliata a 2 cm di lunghezza, e una delle estremità è Dremeled verso il basso fino piatto. </li><li> Poi, un piccolo pezzo (circa 0,5 x 0,5 cm) è tagliato fuori PCB proto-board, da utilizzare come un distanziatore. </li><li> Utilizzando un cutter laser per garantire che eventuali riduzioni effettuate sono perpendicolari alla superficie del materiale, due rettangoli uguali (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) sono tagliati da 1 / 8 &quot;fogli di acrilico, ogni rettangolo con due fori circolari in angoli opposti del rettangolo. La prima buca ha un diametro 1,5 mm, ed è solo abbastanza grande da contenere la cannula metallica ermeticamente. Il secondo foro ha diametro 1 / 16 &quot;(Figura 1C). </li><li> La cannula in metallo è inserito nel foro 1,5 mm di un rettangolo, poi attraverso il foro di 1,5 mm di secondo. L&#39;estremità inferiore della cannula è allineato con la faccia inferiore del rettangolo in basso, formando la forma di un bastone da hockey. </li><li> Pur mantenendo il distanziatore saldamente tenuto tra i due rettangoli, questa struttura è cementata insieme utilizzando colla a caldo intorno ai fori cannula e 1,5 mm, facendo attenzione ad evitare di incollare le distanziatore per i rettangoli. Plastilina può essere utile a tenere insieme le cose durante questo processo. </li><li> Dopo che la colla si è asciugata, un 1-72 vite è inserito nel 1 / 16 buche dal lato superiore dei rettangoli. Poi un 1-72 dado esagonale che si avvita sulla fine della vite 1-72, e serrati. La vite e il dado servono a tenere insieme il morsetto. </li><li> Per collegare il dado esagonale per la faccia inferiore del rettangolo in basso, piccole quantità di 5 minuti a resina epossidica sono sceso intorno al bordo del dado esagonale, senza permettere la resina epossidica per ottenere nei filetti del dado esagonale o vite. Qualsiasi plastilina viene rimosso e si conferma che il distanziatore può essere tenuto saldamente stringendo la vite. </li></ol> 2. Preparazione del sistema per l&#39;array personalizzati iniettore: Hamilton pompa e stereotax <ol><li> Il sistema array iniettore può essere personalizzato per qualsiasi serie di coordinate nel cervello. </li><li> Il primo utente individua le coordinate dei siti di iniezione desiderato in un mouse (o altre specie) atlante del cervello, la conversione in coordinate appropriato utilizzato dal stereotax (qui, X, Y e Z-coordinate). Il numero di siti di iniezione (tre in Figure 1A e 1B) sarà d&#39;ora in poi essere chiamato k. </li><li> k numero di siringhe da 10 microlitri Hamilton si trovano in una iniezione / prelievo pompa a siringa come questo da apparecchi di Harvard. </li><li> Prossimo, 3-piede-lungo pezzi di tubo in polietilene sono saldamente collegato al l&#39;ago della siringa ogni Hamilton. </li><li> Per ogni pezzo di tubo in polietilene, un F-252 manicotto tubo dal Upchurch scientifico è scivolato sopra l&#39;estremità aperta e collegata ad un P-627 adattatore di tubi utilizzando il dado inclusa e puntale, anche da Upchurch scientifico. </li></ol> 3. Costruire la matrice su misura Injector <ol><li> Ogni array iniettore è personalizzato per l&#39;insieme di coordinate che l&#39;utente sceglie. Tuttavia, per i set di coordinate che differiscono solo per uno / o di traduzione e di rotazione, l&#39;array stesso iniettore può essere utilizzato. </li><li> Considerando solo le coordinate X e Y relativo dei siti di iniezione, fori k sono perforati in un PCB proto-board di spessore 1 / 32 &quot;, con la stessa spaziatura relativo. Questi fori sono realizzati utilizzando un mulino e un mini Modela 0,011&quot; Diametro punta da trapano da McMaster-Carr. Assicurarsi di utilizzare una bassa velocità di foratura (Z-velocità) per evitare di rompere o usura la punta del trapano. Prima di rimuovere la scheda dal mulino, un rettangolo è forato intorno i piccoli fori, con una punta più grande del diametro 1 / 32 &quot;, per evitare di indossare il più piccolo codice per il mulino mini possono essere generati facilmente utilizzando MATLAB;. Campione codice viene fornito nei seguenti file. <ol class="lroman"><li> generate.m - codice MATLAB per la generazione di codice Modela dalle coordinate desiderato </li><li> holes_ex.rml - codice Modela per suoneria foratura (otto buche) in Proto-board </li><li> outline_ex.rml - codice Modela per rettangolo intorno ai fori di trivellazione </li></ol></li><li> 245 micron OD/100 micron diametro interno (ID) tubi capillare di silice fusa, disponibile da Technologies Polymicro, è tagliato in numero k di 3 pezzi pollici. Questi comprendono gli iniettori singoli. Un pezzo di tubo capillare monouso è colpito conciascuno dei fori, per eliminare i detriti senza intasare gli iniettori reale. Gli iniettori sono poi inseriti a metà strada in ogni foro, in modo che si tengono strettamente e parallele l&#39;una all&#39;altra. Gli iniettori sono incollate alla tavola, che formano la struttura dell&#39;array iniettore. Tutto ciò che rimane è quella di tagliare gli iniettori alla lunghezza corretta. </li><li> L&#39;array iniettore è collegato al morsetto stereotassica mettendo un angolo del proto-board tra i rettangoli acrilico, e poi stringendo la vite del morsetto stereotassica. Successivamente, la cannula metallica del morsetto è collegato al stereotax, utilizzando il meccanismo di fissaggio del stereotax. </li><li> Tutti i seguenti è fatta sotto un microscopio. Per uno degli iniettori esterno (che è, uno che può essere affrontato dal lato con un regolo, senza sbattere contro nessuna delle altri iniettori), la punta si estende oltre la parte inferiore del proto-board è tagliato con le forbici. Per preparazioni iniettabili corticale, è opportuno avere l&#39;iniettore una estensione di circa 5 millimetri al di là della superficie del proto-board. Per i più iniezioni, questo numero può essere aumentato dal corrispondente aumento in profondità. La punta è appiattito con un utensile Dremel. Suggerimenti iniettore può essere anche terra in un angolo come ulteriore precauzione contro l&#39;intasamento, se la precisione in profondità è meno importante. </li><li> Poi, un punto di riferimento stabile viene scelto all&#39;interno del raggio del braccio stereotassica, e l&#39;array iniettore viene spostato in modo che la punta appiattita del iniettore esterno, è a questo punto di riferimento. </li><li> Un secondo iniettore è scelto, insieme con le sue coordinate corrispondenti. Considerato è la differenza relativa in altezza (direzione z) tra le coordinate primo e il secondo iniettore. L&#39;array iniettore è spostato lungo l&#39;asse Z da questa distanza relativa. L&#39;iniettore secondo è tagliato e Dremeled alla lunghezza corretta, in modo che la punta di un iniettore secondo è ora piatta e all&#39;altezza del punto di riferimento. L&#39;array iniettore può essere spostato in direzione X e Y per facilitare il confronto della punta iniettore con il punto di riferimento. </li><li> Questo processo di taglio viene ripetuto per gli iniettori rimanenti. </li></ol> 4. Assemblare l&#39;intero sistema <ol><li> Il morsetto stereotassica e personalizzati serie iniettore, entrambi già costruiti, sono necessari per questa parte. </li><li> Il back-end di ogni iniettore (alla fine che non è stato tagliato) viene inserito in un blu di F-240 manica tubi e, usando un dado P-235 e P-200 puntale da Upchurch scientifico, è collegato all&#39;adattatore filettato già collegato alla pompa Hamilton da tubi in polietilene. Le istruzioni del produttore è consultabile per i dettagli. </li><li> Usando una 27-gauge, olio di silicone viene iniettato nella parte posteriore delle siringhe Hamilton in modo che l&#39;intero sistema viene riempito dalla siringa Hamilton alla punta iniettore, senza bolle d&#39;aria a tutti. </li><li> Come le siringhe Hamilton sono ri-collocati in pompa di Hamilton, il volume massimo possibile di olio di silicone viene mantenuta in siringhe. </li><li> Se l&#39;esperimento richiede più siringhe che la pompa è progettata per (due in questo caso), le siringhe possono essere distanziati con piccoli pezzi di plastica (per esempio, tappi ago) per tenerli paralleli l&#39;uno all&#39;altro, e per garantire che tutti i pezzi sono spinto dalla pompa nella stessa misura. O, un multi-rack kit di aggiornamento possono essere acquistati presso Apparato Harvard per contenere fino a 10 siringhe in una volta. </li></ol> 5. Iniezioni / chirurgia <ol><li> Il processo di iniezione con un parallelo iniettore è molto simile a quella di iniettare con una pipetta singola. </li><li> E &#39;indispensabile l&#39;utilizzo di ricarica lenta / tassi di infondere in tutto questo processo, perché veloce pompaggio potrebbero stressare la giunzione tra tubi grandi e piccoli. Consigliato rate massimo: 2 microlitri / min per il caricamento del virus, e 0,1 microlitri / min per infusione di virus. </li><li> Un mouse anestetizzato si trova nel stereotax, e resta anestetizzato per tutto l&#39;esperimento. </li><li> Preparare il mouse, se necessario. Ad esempio, con un bisturi, un unico taglio è fatto lungo la linea mediana della pelle, da in mezzo agli occhi di tra le orecchie. La pelle è tirata indietro per esporre il cranio, e la fascia è rimosso. Una pipetta di vetro tirato è collegato al stereotax. Le posizioni delle barre dell&#39;orecchio sono regolati fino bregma e lambda sono allineati alla stessa altezza, e in modo che la linea che li collega è parallela l&#39;asse Y del stereotax. Gli assi del stereotax sono orientati secondo il sistema di coordinate in cui le coordinate di iniezione sono stati calcolati. Il stereotassica viene azzerato con la punta della pipetta di vetro a bregma, poi la punta è posizionata leggermente sopra il cranio al X e Y le coordinate di uno dei siti di iniezione. </li><li> Utilizzando un trapano dentistico, il teschio sotto la punta è attentamente confrontato via fino a quando rimane uno strato estremamente sottile di tessuto osseo. La pipetta di vetro può essere inferioreed e cresciuto a verificare che il foro è perforato è centrato nella posizione corretta. Usando un 30-gauge, un piccolo pezzo di livello è leggermente raccolti al largo, al corretto X e Y-coordinate, in modo che la dura madre è esposta. Questo buco dovrebbe essere solo grande abbastanza da contenere una delle iniettori (0,25 mm di larghezza). Vedi Figura 1D per diagramma. In questo modo, i piccoli, fori 0,25 millimetri sono fatte largo nel cranio, al X e Y coordinate corrispondenti a ciascun sito di iniezione. </li><li> La pipetta di vetro viene scartato in un apposito contenitore, e l&#39;array personalizzati iniettore è collegato al stereotax utilizzando il morsetto stereotassica. </li><li> Al fine di impostare correttamente l&#39;angolo del vettore iniettore, due iniettori esterni sono scelti per essere calibrato a un punto di riferimento, come segue. Dopo uno degli iniettori è abbinato con il punto di riferimento, si consideri la relativa X e Y distanze tra i siti di iniezione iniettore rispetto a questo e altro. Gli assi del stereotax sono regolate in modo che tutta la serie iniettore viene spostata nel X e Y direzioni da questi distanze relative. Se l&#39;iniettore seconda non è ora allineato con il punto di riferimento, la cannula metallica è allentato e ruotato. Questo processo viene ripetuto iterativamente fino a quando l&#39;array iniettore è angolato in modo corretto. </li><li> Prima di riempire gli iniettori con il virus, gli iniettori sono pieni di olio di silicone fino a quando le siringhe sono al punto 2 microlitri (o superiore). Ciò fornisce una zona cuscinetto, in modo che eventuali bolle d&#39;aria o di intasamento nella punta può essere facilmente rimosso spingendo in avanti con l&#39;olio della pompa di Hamilton, senza dover ricaricare l&#39;intero sistema con olio di silicone dal retro delle siringhe, come descritto in precedenza. </li><li> Un pezzo di Parafilm sterile è posto sul cranio, e gli iniettori sono leggermente abbassati sui Parafilm. Per le coordinate con profondità molto diverse, una custom-fresato parte (ad esempio un oggetto a forma di scala) potrebbe facilitare il caricamento. </li><li> Le parti che seguono presuppongono che 1 ml di virus per essere caricato in ogni sito (le seguenti quantità dovrebbe essere ridimensionato se piccole quantità sono desiderati). Al fine di garantire che&gt; 1 ml di virus viene iniettata in ogni sito, 1,5 ml di virus è pipettato sul Parafilm o scale in punta di ciascun iniettore. </li><li> Con il tasso di riempimento della pompa Hamilton set a 1 microlitri / min, 1,2 ml di virus è riempito in ogni iniettore. </li><li> La punta più lunga l&#39;iniettore è azzerato al bregma, e poi l&#39;array iniettore è spostata a X e Y coordinate di tale iniettore. Se l&#39;intasamento è un problema, dire se molti obiettivi in ​​profondità sono coinvolti: anche prima di inserire i suggerimenti iniettore nel cervello, a volte è consigliabile iniziare l&#39;infusione di pompa, fino a virus può essere visto emergere da tutte le iniettore punte. Ciò elimina le bolle d&#39;aria alle estremità iniettore, e inoltre assicura che non c&#39;è intasamento. Nel caso di intasamento, la pompa Hamilton è impostato per infondere un breve impulso ad una velocità superiore di 2 microlitri / min, per eliminare delicatamente intasamento. </li><li> L&#39;array iniettore è poi abbassato, attraverso i piccoli fori fatti con i 30-gauge aghi, per la corretta profondità Z. </li><li> 1 ml di virus viene iniettato attraverso ogni iniettore, a 0,1 microlitri / min. </li><li> Le iniezioni sono lasciati soli per 30 minuti. </li><li> Dopo l&#39;array iniettore sta lentamente estratte dal cervello, la pompa Hamilton è impostato per infondere allo stesso tasso di 0,1 microlitri / min, al fine di verificare la presenza di ostruzioni in ogni iniettore. </li><li> Allora gli iniettori sono puliti da ricarica e infondendo 1,5 ml di etanolo a 2 microlitri / min. </li><li> Infine, gli iniettori sono riempiti con olio di silicone per mantenere la zona 2 microlitri di buffer in ogni siringa Hamilton. </li><li> Tutte le attrezzature devono essere sterilizzati prima e dopo la procedura, in base alla biosicurezza del vostro istituto e protocolli di utilizzo. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati L&#39;array parallelo iniettore accelera un intervento chirurgico o meno di un fattore pari al numero di iniettori, senza contare l&#39;installazione e il tempo di recupero, anche se i tempi individuali dipenderà dalla capacità del praticante. Per una iniezione 1 microlitro, di solito visto l&#39;espressione lentivirus in una sfera di diametro di circa 1 mm (Fig. 1E). La precisione dell&#39;iniezione era tale che la variabilità nel posizionamento punta, da prova a prova, era di circa 45 micron (deviazione standard della distanza dalla posizione di punta nella posizione di punta previsto). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Progettazione, implementazione e utilizzo di un array parallelo virus iniettore. A, schematica del parallelo sistema array iniettore, che mostra una configurazione tripla iniettore, per tre iniezioni simultanee. B, la fotografia di una triplice serie parallela iniettore come diagramma in A . <strong&gt; C, morsetto stereotassica, mostrato a grandi linee dall&#39;alto D, illustrazione della tecnica per una efficiente, riducendo al minimo i danni-, apertura di fori nel cranio per iniettore inserimento nel cervello:. con un trapano dentistico, il cranio sottile spessore fino a circa 50 micron, quindi utilizzare la punta di un ago affilato per aprire una piccola craniotomia. E, immagine che mostra fluorescenza channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-etichettata cellule in tre regioni corticali del mouse, come bersaglio l&#39;array triplo iniettore mostrato in B.

<ol><li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).</li>
<li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li>
<li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li>
<li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li>
</ol>

Tutte le procedure erano in conformità con la Guida NIH per gli animali da laboratorio e approvato dal Animal Care MIT e Usa e Comitati biosicurezza.

Negli ultimi anni, un certo numero di sensibilizzatori ottici geneticamente codificato neuroni hanno permesso di essere attivato e messo a tacere in vivo in un preciso temporalmente-moda, in risposta a brevi impulsi di luce (ad esempio, 1,4,5,6,7,8 , 11). Un metodo chiave con cui i neuroni sono stati sensibilizzati alla luce nel cervello dei mammiferi, avviene tramite virus come lentivirus e virus adeno-associati (AAV), che può fornire geni che codificano per opsine al cervello di animali che vanno dai topi alle scimmie, in un modo sicuro e duraturo (ad esempio, 2,9,10). I virus permettono tempi di risposta più veloci di quanto non facciano transgenici, soprattutto per gli organismi che non sono organismi modello genetico, come ratti e scimmie, e per opsine può consentire alti livelli di espressione che non può essere possibile in scenari transgenici. Qui mostriamo una serie parallela iniettore in grado di creare, in tempi rapidi, &quot;a livello di circuito transgenici&quot;, consentendo l&#39;intero 3-dimensionale strutture cerebrali per essere virale mirati con un gene, in un unico passaggio chirurgico. L&#39;array iniettore comprende una o più pompe che ogni unità di una serie di siringhe, ognuna delle quali si inserisce in un poliammide / capillare in silice fusa mediante un alta pressione-tolerant connettore. I capillari sono dimensionati, e quindi inserito in, posizioni desiderate specificato da custom-fresatura una scheda stereotassica posizionamento, permettendo virus o altri reagenti da consegnare il set desiderato di regioni del cervello. Per usare il dispositivo, il chirurgo prima riempie il sottosistema fluidico interamente con olio, backfills i capillari con il virus, inserisce il dispositivo nel cervello, e infonde reagenti lentamente (&lt;0,1 microlitri / min). Questa tecnologia consentirà una vasta gamma di nuovi tipi di esperimenti, come millisecondo-temporale chiusura di strutture a forma complessa (come ad esempio l&#39;ippocampo) in momenti precisi durante il comportamento, l&#39;inattivazione temporalmente precisa di strutture bilaterali che possono agire in modo ridondante (come a sinistra ea destra amigdala), e la perturbazione di molteplici regioni cerebrali distinti (per esempio, guidare due regioni collegati fuori fase per studiare come cross-regione sincronia dipende attività all&#39;interno di ogni regione, o stimolanti input per una regione, mentre a tacere un sottoinsieme di gli obiettivi al fine di capire quale dei diversi obiettivi sono fondamentali per mediare gli effetti di tali ingressi). Al posto del cervello di grandi dimensioni come quelli del primate, in cui abbiamo recentemente dimostrato ottica delle cellule di tipo specifico di attivazione neurale 3, conturbante attività in una comportamentale rilevante per zona può richiedere l&#39;etichettatura virale di grandi strutture complesse. Prendiamo atto che gli array parallelo iniettore può essere utilizzato per iniettare praticamente qualsiasi carico utile - droga, neuromodulatori, neurotrasmettitori, o addirittura le cellule - in complesso i modelli 3-D nel cervello, in un preciso modo temporalmente. Infine, dal punto di vista traslazionale, è possibile che rapida, paziente personalizzati terapia genica o dispositivi di somministrazione dei farmaci può essere rapidamente appositamente progettati e realizzati per soddisfare geometrie cervello individuale, sostenendo i nuovi trattamenti per una serie di patologie, potenzialmente, mediante l&#39;uso di molecole di controllo ottico. Gli array iniettori sono progettati per essere precisi, sia spazialmente e volumetricamente. In X e Y direzioni, questo viene realizzato dalla perforazione fori molto accuratamente posizionati usando un economico mini-mill, con i fori appena grande abbastanza da contenere gli iniettori, in modo che iniettori sono paralleli l&#39;uno all&#39;altro, e in un preciso posizione. Nella direzione Z, gli iniettori sono tagliati utilizzando un apparato stereotassico, permettendo un livello di precisione equivalente a quello della chirurgia stereotassica stesso. La precisione volumetrica nasce dalla precisione della pompa Hamilton, così come il vicino allo zero volume morto connettori, adattato dal alta pressione cromatografia liquida (HPLC) campo. Gli iniettori sono in tubi capillare di silice fusa, che è forte e sufficientemente rigida che mantiene la forma precisa e la spaziatura sotto pressione, senza lo spessore della parete maggiore di alternative come cannule di acciaio. Piccole modifiche possono facilmente essere fatto per adattare l&#39;array parallelo iniettore ad una serie di esperimenti. Per esempio, se un minor volume di virus o di spaziatura più fine è richiesto, più piccolo tubo capillare può essere impiegato, insieme a un po &#39;più piccolo trapano corrispondente. Futuri dispositivi possono utilizzare canali microfluidica e pompe, per aumentare il numero di iniettori in parallelo, per minimizzare le dimensioni (forse consenta a tali dispositivi da montare sulla testa di muoversi liberamente gli animali).

<table><tbody><tr><td>Utensile Dremel</td><td>Strumento</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina laser</td><td>Strumento</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Pistola per colla a caldo</td><td>Strumento</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per iniezione/aspirazione (pompa Hamilton)</td><td>Strumento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Hamilton da 10 &amp;mu;l</td><td>Strumento</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>Necessaria una per ogni sito di iniezione</td></tr><tr><td>Stereotasso per topo</td><td>Strumento</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-fresatrice Modela</td><td>Strumento</td><td>Roland</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano da 0,011&quot; di diametro per mini-fresatrice</td><td>Strumento</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano da 1/32&quot; di diametro per mini-fresatrice</td><td>Strumento</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>Trapano dentale ad alta velocità</td><td>Strumento</td><td>Lynx</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>Accessori per trapano dentale</td><td>Strumento</td><td>Pearson Assessments</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Cannula in acciaio inossidabile con diametro esterno (OD) di 1,5 mm</td><td>Materiale</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>Vite a testa scanalata 1-72</td><td>Materiale</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>Controdado esagonale 1-72</td><td>Materiale</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>Scheda prototipo PCB, spessore 1/32&quot;</td><td>Materiale</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di acrilico, spessore 1/8&quot;</td><td>Materiale</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>Connettori HPLC</td><td>Materiale</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (alcuni di questi sono disponibili in confezioni da 10; aggiungere semplicemente una &amp;#8216;x&amp;rsquo; alla fine del numero di articolo)</td><td>Necessario uno per ogni iniezione per sito, tranne F-252, P-627 e P-235, che possono essere riutilizzati</td></tr><tr><td>Tubetto capillare in silice fusa, OD: 245 &amp;mu;m, ID: 100 &amp;mu;m</td><td>Materiale</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>Epossidico universale a presa rapida (5 minuti)</td><td>Materiale</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>Epossidico universale a presa rapida (5 minuti)</td></tr><tr><td>Tubetto in polietilene, 0,066 x 0,095 pollici</td><td>Materiale</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

gli array scalabile fluidico iniettore per viral targeting di intatto 3-d circuiti cerebrali

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

La nostra comprensione dei circuiti neurali - come mediare i calcoli che servono alla sensazione, pensiero, emozione e azione, e come essi sono danneggiati nei disordini neurologici e psichiatrici - sarebbe molto facilitata da una tecnologia di targeting dei geni a rapida complessa 3 - dimensionale circuiti neurali, permettendo la creazione veloce di &quot;livello di circuito transgenici&quot;. Abbiamo recentemente sviluppato metodi in cui la codifica dei virus sensibili alla luce per le proteine ​​possono sensibilizzare i tipi di cellule specifiche per millisecondo, tempi di attivazione e silenziamento nel cervello intatto. Noi qui presenti la progettazione e realizzazione di un array iniettore in grado di erogare virus (o altri fluidi) di decine di punti definiti all&#39;interno della struttura 3-dimensionale del cervello (<strong&gt; Figura. 1A, 1B</strong&gt;). L&#39;array iniettore comprende una o più pompe che ogni unità di una serie di siringhe, ognuna delle quali si inserisce in un poliammide / capillare in silice fusa mediante un alta pressione-tolerant connettore. I capillari sono dimensionati, e quindi inserito in, posizioni desiderate specificato da custom-fresatura una scheda stereotassica posizionamento, permettendo virus o altri reagenti da consegnare il set desiderato di regioni del cervello. Per usare il dispositivo, il chirurgo prima riempie il sottosistema fluidico interamente con olio, backfills i capillari con il virus, inserisce il dispositivo nel cervello, e infonde reagenti lentamente (&lt;0,1 microlitri / min). La natura parallelo dell&#39;array iniettore facilita l&#39;etichettatura rapida, precisa e robusta di interi circuiti neurali con carichi virali come sensibilizzatori ottici per permettere alla luce di attivazione e silenziamento dei circuiti cerebrali definite. Insieme con altre tecnologie, come array di fibre ottiche per la consegna della luce ai set desiderato di regioni del cervello, speriamo di creare una serie di strumenti che consente il sistematico sondaggio della causale funzioni neurali del cervello intatto. Questa tecnologia può non solo aprire tali approcci sistematici al circuito incentrato neuroscienze nei mammiferi, e facilitare l&#39;etichettatura delle regioni cerebrali in animali di grandi dimensioni come i primati non umani, ma può anche aprire un percorso clinico-traslazionale di cellule specifiche protesi controllo ottico , la cui precisione può consentire un migliore trattamento delle patologie cerebrali intrattabile. Infine, tali dispositivi come descritto qui può facilitare appunto tempestiva consegna fluidico di carichi altri, come le cellule staminali e agenti farmacologici, a 3 dimensioni delle strutture, in modo facilmente personalizzabile dall&#39;utente.

Controllare e analizzare i circuiti neurali<em&gt; In vivo</em&gt; Potrebbe essere facilitato da una tecnologia per la consegna di virus e altri reagenti di desiderata 3-dimensionale serie di regioni del cervello. Dimostriamo personalizzate fluidico fabbricazione serie iniettore, e la consegna di sensibilizzatori ottici virale codifica, permettendo la manipolazione ottica di circuiti cerebrali complesse.

Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

La nostra comprensione dei circuiti neurali — ovvero di come medino i calcoli che sottendono la sensazione, il pensiero, l'emozione e l'azione, e di come vengano alterati ...

Due pezzi rettangolari di acrilico vengono tagliati al laser e quindi assemblati per formare la pinza stereotassica, che serve a mantenere saldamente l'array di iniettori rispetto agli attacchi stereotassici. Una pompa per siringhe viene caricata con siringhe collegate a tubi di polietilene per un circuito cerebrale desiderato. Si utilizza una fresa per praticare fori attraverso i quali viene inserito un tubo di silice fusa, formando così gli iniettori.Gli iniettori sono montati in modo reversibile nella pinza e quindi regolati per colpire i circuiti cerebrali di interesse. Ogni iniettore è collegato a un singolo canale in polietilene. La preparazione del sistema per l'uso prevede il riempimento del sistema attraverso le siringhe con olio di silicone e successivamente il caricamento dei reagenti fluidici negli iniettori.L'iniettore parallelo viene quindi inserito nelle aree cerebrali bersaglio e i reagenti vengono somministrati. Ciao, sono Stephanie Chan del gruppo di Neurobiologia Sintetica del MIT. Fino ad ora, l'espressione genica in circuiti cerebrali spazialmente complessi ha richiesto o la lenta e costosa creazione di animali transgenici oppure il laborioso processo di iniezioni virali, che devono essere eseguite un lato alla volta.Oggi vi mostreremo come costruire e utilizzare un array di iniettori paralleli in grado di somministrare fluidi secondo schemi tridimensionali complessi nel cervello. Utilizziamo questo array per generare rapidamente topi transgenici specifici per circuiti, somministrando virus in parallelo attraverso l'insieme degli iniettori per colpire contemporaneamente tutti i bersagli. Il nostro iniettore può essere impiegato per consegnare qualsiasi reagente fluidico a una distribuzione complessa di siti cerebrali.Il nostro obiettivo oggi è quello di somministrare virus che codificano per proteine sensibili alla luce, in modo da poter attivare e disattivare in maniera temporalmente precisa specifici tipi cellulari all'interno di circuiti specifici. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa tecnologia in combinazione con array di fibre ottiche che forniscono luce in modo specifico per ciascun circuito. Cominciamo dunque.Costruiamo innanzitutto una pinza stereotassica che tiene in posizione l'array di iniezione e può essere montata sullo stereotassico. Per realizzare la pinza sono necessari i seguenti elementi: una cannula di acciaio da due pollici con un diametro esterno (OD) di 1,5 millimetri, con un'estremità appiattita; un piccolo pezzo di protoboard PCB di circa 0,5 per 0,5 centimetri; e due rettangoli identici.Un pezzo di dimensioni di un mezzo pollice per tre ottavi di pollice ricavato da una lastra di acrilico spessa un ottavo di pollice per ciascuno dei due rettangoli in acrilico. Praticare due fori circolari agli angoli opposti. Il primo foro deve avere un diametro di 1,5 millimetri ed essere appena sufficiente per alloggiare saldamente la cannula metallica.Il secondo foro deve avere un diametro di un sedicesimo di pollice. Inserire la cannula metallica nel foro di 1,5 millimetri di un rettangolo, quindi attraverso il foro di 1,5 millimetri del secondo rettangolo; allineare l'estremit&agrave; inferiore della cannula con la faccia inferiore del rettangolo inferiore per formare la forma di una mazza da hockey, quindi posizionare lo spaziatore tra i due rettangoli. L'argilla modellabile &egrave; utile per tenere insieme i componenti durante questo procedimento, mantenendo allo stesso tempo lo spaziatore saldamente fissato tra i due rettangoli.Fissare questa struttura utilizzando colla a caldo intorno alla cannula e ai fori di 1,5 millimetri. Fare attenzione a non incollare lo spaziatore ai rettangoli dopo che la colla si &egrave; asciugata al centro. Posizionare un dado esagonale 1/72 sul foro da 1/16 e quindi avvitare una vite 1/72 dal lato opposto dei rettangoli.Applicare piccole quantità di colla epossidica a presa rapida (5 minuti) lungo i bordi del dado per fissarlo al rettangolo. Avere cura di non far penetrare la colla nei filetti del dado o della vite. Una volta che la colla si è indurita, inserire una vite da 1 72 nel foro più vicino al bordo superiore del rettangolo (a un sedicesimo di pollice) e avvitarla nel dado.Rimuovere l'argilla modellabile e verificare che lo spaziatore possa essere mantenuto saldamente in posizione stringendo la vite. Il sistema di array di iniezione può essere personalizzato per praticamente qualsiasi insieme di coordinate nel cervello. Innanzitutto, individuare le coordinate dei siti di iniezione desiderati in un atlante cerebrale della specie di interesse e convertirle nelle coordinate appropriate utilizzate dagli stereotassi.In questa dimostrazione, utilizzeremo un topo e ci saranno tre siti di iniezione, e pertanto ci saranno tre tubi per gli iniettori. Le coordinate X, y e Z corrisponderanno alle coordinate mediale, anteriore, posteriore e/o ventrale di un atlante del cervello del topo. Successivamente, posizionare tre siringhe Hamilton da 10 microlitri in una pompa per siringhe di iniezione e prelievo, come questa prodotta da Harvard Apparatus, e fissare saldamente tre pezzi di tubo in polietilene lunghi un piede all'ago di ciascuna siringa Hamilton per ogni pezzo di tubo in polietilene.Fare scivolare un manicotto per tubo F 2 52 sull'estremità aperta e collegarlo a un adattatore per tubo P 6 27 utilizzando il dado P 2 35 e il P 200 fal. Per costruire l'array di iniettori personalizzato, utilizzare una fresatrice modela mini e una punta da trapano di diametro 0,011 pollici per praticare tre fori in uno spazio di protoboard PCB spesso un trentaduesimo di pollice. I tre fori in base alle coordinate relative X e Y dei siti di iniezione; prima di rimuovere la scheda dalla fresatrice, praticare un rettangolo attorno ai fori più piccoli utilizzando una punta da trapano di diametro pari a un trentaduesimo di pollice.Successivamente, i singoli iniettori vengono inseriti a metà in ciascun foro in modo che siano tenuti saldamente e in posizione parallela l'uno rispetto all'altro. Fissarli alla basetta con resina epossidica per formare la matrice di iniettori. Per fissare la matrice di iniettori alla pinza stereotassica.Posizionare un angolo della basetta tra i rettangoli in acrilico e serrare la vite della pinza stereotassica. Successivamente, fissare la cannula metallica della pinza allo stereotassico utilizzando il meccanismo di aggancio degli stereotipi. Questi passaggi successivi vengono eseguiti al microscopio per uno degli iniettori esterni che può essere avvicinato lateralmente con un bordo dritto senza urtare nessuno degli altri iniettori.Tagliare la punta che si estende al di sotto della base della protoboard. Appiattire la punta con un utensile Dremel. Successivamente, scegliere un punto di riferimento stabile all'interno del range del braccio stereotassico e spostare l'array di iniezione in modo che la punta appiattita dell'iniettore esterno si trovi in corrispondenza di questo punto di riferimento.Scegliere un secondo iniettore insieme alle relative coordinate. Spostare la serie di iniettori lungo l'asse Z della differenza relativa in altezza o direzione Z tra le coordinate del primo e del secondo iniettore. Tagliare questo secondo iniettore in modo che la punta si trovi ora all'altezza del punto di riferimento e appiattirlo con un utensile Dremel.L'array dell'iniettore può essere spostato nelle direzioni X e Y per facilitare il confronto tra la punta dell'iniettore e il punto di riferimento. Dopo aver ripetuto questo processo di rifinitura per gli iniettori rimanenti, l'array dell'iniettore è pronto per essere assemblato nell'intero sistema. L'assemblaggio dell'intero sistema richiede la pinza stereotassica precedentemente costruita e l'array personalizzato dell'iniettore.Dopo aver sterilizzato la matrice di iniettori, inserire l'estremit&agrave; posteriore di ciascun iniettore, ovvero quella che non &egrave; stata tagliata, in un manicotto blu F due 40 per tubo. Utilizzando un dado P 2 35 e un P 200 freal, collegare l'estremit&agrave; posteriore dell'iniettore all'adattatore filettato gi&agrave; connesso alla pompa Hamilton mediante tubo di polietilene. Con un ago da 27 gauge, iniettare olio di silicone sterile all'interno della parte posteriore delle siringhe Hamilton, in modo che l'intero sistema risulti riempito dalle siringhe Hamilton fino alle punte degli iniettori.Si raccomanda la massima attenzione per evitare l'introduzione di bolle d'aria, altrimenti il volume di virus iniettato risulterà errato o il virus potrebbe non essere iniettato affatto. Quando le siringhe Hamilton vengono sostituite nella pompa Hamilton, si mantiene il volume massimo possibile di olio al silicone all'interno delle siringhe. Se l'esperimento richiede l'uso di più di due siringhe, è possibile inserire distanziali nella pompa Hamilton, come abbiamo fatto in questo caso.In alternativa, è possibile acquistare da Harvard Apparatus un kit di aggiornamento multipiastra per contenere fino a 10 siringhe contemporaneamente. Per iniettare il virus nel cervello del topo, iniziare somministrando analgesici in base al protocollo previsto per l'animale. Posizionare il topo anestetizzato sul microscopio stereoscopico e verificare, mediante pizzicamento del dito del piede, che l'animale sia sufficientemente anestetizzato.Eseguire quindi un'unica incisione lungo la linea mediana della cute, dalla regione tra gli occhi fino a quella tra le orecchie. Tirare indietro la cute per esporre il cranio e rimuovere la fascia. Fissare una pipetta di vetro tirata agli stereo attacchi.Regolare la posizione dei puntali auricolari finché bgma e lambda non sono allineati alla stessa altezza e la linea che li collega risulta parallela all'asse Y dello stereotassico. Azzerare lo stereotassico con la punta della pipetta di vetro posizionata su bgma, quindi spostare la punta leggermente al di sopra del cranio alle coordinate x e y di uno dei siti di iniezione. Utilizzando un trapano dentale, praticare con attenzione un foro nel cranio al di sotto della punta fino a quando rimane solo uno strato osseo estremamente sottile; quindi, con un ago da 30 gauge, rimuovere delicatamente una piccola porzione di questo strato alle corrette coordinate x e y per esporre la dura madre.Questo foro deve essere appena sufficientemente grande da ospitare uno degli iniettori in questo modo. Vengono praticati piccoli fori larghi 0,25 millimetri nel cranio alle coordinate x e y corrispondenti a ciascun sito di iniezione. Al termine della foratura, scartare la pipetta di allineamento in vetro e fissare l'array personalizzato di iniettori al sistema stereotassico utilizzando la pinza stereotassica.Per impostare correttamente l'angolo dell'array di iniettori, selezionare due iniettori esterni da calibrare rispetto a un punto di riferimento specifico. Dopo aver allineato uno degli iniettori con il punto di riferimento, considerare le distanze relative lungo gli assi X e Y tra i siti di iniezione per questo iniettore e l'altro. Spostare l'array di iniettori nelle direzioni x e y di queste distanze relative. Se il secondo iniettore non è allineato con il punto di riferimento, la cannula metallica viene allentata e ruotata.Ripetere questo processo in modo iterativo finché l'array dell'iniettore non è orientato correttamente. Impostare la velocità di ricarica della pompa Hamilton su un microlitro al minuto e ricaricare gli iniettori con olio di silicone fino a quando le siringhe raggiungono il valore di due microlitri o superiore. Questo garantisce una riserva di olio tale da consentire la facile rimozione di eventuali bolle d'aria o ostruzioni alla punta, spingendo l'olio in avanti mediante la pompa Hamilton, senza dover ricaricare l'intero sistema con olio di silicone dalla parte posteriore delle siringhe, come descritto in precedenza.Posizionare un pezzo pulito di paraform sul cranio e abbassare delicatamente gli iniettori sul paraform. Se si intende somministrare un microlitro di virus per ciascun sito, pipettare 1,5 microlitri di virus sul paraform per ogni sito, mantenendo la stessa velocità di ricarica di un microlitro al minuto. Ricaricare 1,2 microlitri di virus in ciascun iniettore.Azzera la punta dell'injectore più lungo su bgma, quindi sposta l'array di injectori alle coordinate x e Y di tale injectore. Abbassa l'array di injectori attraverso i piccoli fori realizzati con gli aghi da 30 gauge per correggere la profondità in Z. Inietta un microlitro di virus attraverso ciascun injectore a una velocità di 0,1 microlitri al minuto o inferiore.Lasciare le iniezioni a riposo per 30 minuti affinché si diffondano. Dopo 30 minuti, estrarre lentamente l'array di iniezione dal cervello. Quindi impostare la pompa Hamilton per infondere allo stesso flusso di 0,1 microlitri al minuto al fine di verificare l'occlusione di ciascun iniettore.Successivamente, pulire gli iniettori ricaricandoli e infondendo due microlitri di etanolo a una velocità di due microlitri al minuto. Infine, ricaricare gli iniettori con olio di silicone per mantenere la zona tampone di due microlitri in ciascuna siringa Hamilton. Questa figura mostra il risultato dell'utilizzo dell'array di iniettori appena illustrato, contenente tre cannule, per somministrare reagenti virali a diverse aree del cervello del topo.In questo caso, il carico genetico del virus contiene la molecola fluorescente GFP, producendo tre volumi fluorescenti di cellule marcate in un unico passaggio. In linea di principio, un numero arbitrario di cannule può essere utilizzato per costruire un array di iniettori virali. Qui, ad esempio, è mostrato un array di iniettori adatto per un targeting bilaterale del CA1 dell'ippocampo mediante 16 iniettori.Utilizzando il protocollo che vi abbiamo mostrato oggi, sarete in grado di somministrare un virus in un modello tridimensionale al cervello, creando efficacemente transgenici a livello di circuito. Inoltre, l'array di iniettori paralleli può essere utilizzato per somministrare qualsiasi reagente fluidico al cervello, permettendo, ad esempio, che agonisti dopaminergici vengano erogati in modo mirato a circuiti neurali specifici in un animale in comportamento con la testa fissata. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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