Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l'imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.

Le tecniche di microscopia a fluorescenza hanno una capacità limitata di visualizzare le strutture in profondità all'interno dei tessuti, specialmente in materiali ad alta diffusione della luce come il tessuto cerebrale. Anche nel caso della microscopia a due fotoni, può essere molto difficile produrre immagini in vivo di alta qualità di strutture neurali che si trovano a una profondità superiore a 500 micron dalla superficie neocorticale. Qui, la linea verde indica una profondità di 500 micron.

In generale, gli strati neocorticali quattro, cinque e sei sono superiori a 500 micron dalla superficie. Mostreremo come un microprisma di vetro di un millimetro inserito nella neocorteccia può trasmettere la luce dentro e fuori dagli strati corticali superficiali e profondi. Utilizzando questa tecnica in un topo, è possibile avere un campo visivo di un millimetro e visualizzare tutti e sei gli strati corticali contemporaneamente in una prospettiva di imaging, che in genere si trova solo nel tessuto cerebrale affettato.

I microprismi offrono un ampio campo visivo in grado di visualizzare i corpi cellulari parametallici di quinto strato con i loro lunghi dendriti apicali e la complessa rete di vasi sanguigni nella neocorteccia, il tutto mantenendo risoluzioni spaziali in grado di risolvere le spine dendritiche e il flusso dei globuli rossi attraverso i micro capillari. Mi chiamo Thomas Chia e sono uno studente laureato nel laboratorio del professor Michael Levine presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Yale. Il protocollo di cui parleremo in questo video riguarderà come utilizzare micro prismi di vetro ad angolo retto da un millimetro per generare immagini a fluorescenza di strutture profonde un millimetro in una neocorteccia di topo.

I microprismi che utilizziamo sono prismi ad angolo retto da un millimetro realizzati in vetro BK sette acquistati dalla Opto Sigma Corporation. I microprismi vengono maneggiati utilizzando una pinza quando possibile. L'ipotenusa del microprisma è rivestita con argento potenziato per fornire una riflettività superiore al 97% da 400 a 2000 nanometri.

Ciò fornisce una riflessione interna sia della luce di eccitazione laser che della fluorescenza ammessa. Utilizziamo un microscopio a due fotoni costruito su misura in grado di eseguire l'imaging di piccoli animali. L'animale attaccato ad un dispositivo stereotassico è posto su un tavolino motorizzato a tre assi.

Il microscopio è collegato a un PC Windows che esegue l'immagine di scansione. Software scan image è un software di acquisizione immagini scritto in MATLAB da Polo Gudo, et al. Per l'imaging con microprismi, raccogliamo immagini con una risoluzione di 10 24 x 10 24 o cinque 12 x cinque 12 pixel da 12 pixel.

Inoltre, in genere eseguiamo la scansione a due millisecondi per riga o quattro millisecondi per riga. Un aspetto importante di questo protocollo è il tipo di obiettivi del microscopio utilizzati in combinazione con i micro prismi. Negli esperimenti vengono utilizzati due tipi di obiettivi.

L'obiettivo a sinistra è un obiettivo ad aria a bassa apertura numerica per l'imaging ad ampio campo visivo, in questo caso, un obiettivo Olympus quattro x 0,28 NA. L'obiettivo a destra è un obiettivo ad aria NA alto 40 x 0,60 con un collare di correzione del vetro in grado di ridurre al minimo le aberrazioni sferiche indotte da zero a due millimetri di vetro. Per preparare il topo per l'intervento chirurgico e l'inserimento del microprisma, il primo passo è quello di anestetizzare adeguatamente l'animale a un livello adatto alle procedure chirurgiche.

Innanzitutto, il peso dell'animale viene registrato in base al dosaggio stabilito. Un volume appropriato di un cocktail di ketamina e xilazina viene aspirato in una siringa. I farmaci anestetici vengono somministrati attraverso un'iniezione IP utilizzando un ago calibro 28.

Una volta che il topo è a un piano di anestesia adatto per le procedure chirurgiche, la maggior parte dei peli sulla testa dell'animale viene rasata usando un tremore con una lama numero 40. Quindi il nare viene applicato sui peli rimanenti sulla testa per aiutare a creare una superficie priva di peli che potrebbero intralciare il microprisma. Durante l'imaging, dopo cinque minuti, l'NA viene pulito utilizzando un tampone di cotone, l'animale anestetizzato viene correttamente inserito in un dispositivo stereotassico per topo.

Durante le procedure chirurgiche e le sessioni di imaging, l'animale viene tenuto su un termoforo pieno d'acqua impostato a 36 gradi Celsius. Con la testa dell'animale correttamente fissata in posizione, viene praticata un'incisione pulita lungo la linea mediale del cranio. Per separare la pelle, una piccola quantità di perossido di idrogeno al 3% viene posta su un batuffolo di cotone e applicata sul cranio per eliminare le membrane tra il cranio e la pelle.

Il perossido di idrogeno aiuta anche a rivelare che la BMA è un punto di riferimento importante per sapere dove eseguire la craniotomia e inserire il microprisma. Prima di iniziare la craniotomia, le barre auricolari e la barra del morso sono regolate correttamente per inclinare il cranio esposto in modo che sia sostanzialmente a livello del tavolo. Ciò fornisce una piattaforma migliore per la craniotomia.

Una piccola fresa dentale è collegata a uno strumento Dremel per craniotomie. Abbiamo impostato la velocità a circa 7.000-10.000 giri/min. La fresa dentale viene scremata lungo il cranio fino a quando non si stabilisce un solco quadrato nell'osso.

I lati del quadrato sono lunghi circa due o tre millimetri e centrati. 1,5 millimetri di coccola e un millimetro di rema laterale continuano ad assottigliare l'osso fino a quando non viene praticata una piccola apertura attraverso il cranio. Un paio di pinze possono sollevare il lembo osseo.

La dura madre deve essere rimossa prima che il microprisma possa essere inserito nella corteccia. Il sanguinamento è meglio controllato lasciando che il sangue coaguli sulla superficie per diversi minuti. Successivamente, il sangue coagulato viene rimosso utilizzando una spugna chirurgica per aiutare l'allineamento del prisma con la corteccia.

La faccia verticale del microprisma è allineata parallelamente alle impugnature della pinza. Con il prisma tenuto correttamente, l'intero microprisma viene inserito fino a quando la parte superiore del prisma non è a filo con la superficie neocorticale. Qui possiamo vedere il prisma che riposa nella neocorteccia.

Se inserito correttamente, il microprisma deve rimanere nella posizione corretta. Qualsiasi sanguinamento che ne risulta è minimo e può essere assorbito con una piccola spugna chirurgica. Una volta che il prisma è in posizione, l'animale è pronto per l'imaging con l'animale.

Sotto un obiettivo a basso ingrandimento, si può vedere il laser che scansiona raster il microprisma sulla superficie del cervello. Ecco alcuni esempi rappresentativi di immagini scattate da topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla. Nello strato cinque di neuroni corticali che utilizzano microprismi, si può vedere una raccolta di grandi corpi cellulari parametallici nello strato cinque, quasi un millimetro sotto la superficie corticale.

Si vedono anche i dendriti apicali che si estendono attraverso tutti gli strati superficiali prima di divergere in ciuffi utilizzando un obiettivo ad alta apertura numerica con il collare di correzione a vetro, in questo caso è possibile risolvere le spine dendritiche. Sui dendriti apicali dei neuroni parametallici del quinto strato, le spine dendritiche sono strutture sub-micron e diverse sono identificate nell'immagine utilizzando punte di freccia gialle. Si possono anche etichettare i vasi sanguigni corticali con un colorante fluorescente, come il destrano di fluoresceina, utilizzando tecniche di iniezione della vena caudale consolidate.

Usando questa tecnica, si possono vedere i vasi di calibro più grande dagli strati profondi che si estendono verso il PIA e si diramano per formare la rete di micro capillari. Questa delicata rete di micro capillari nella neocorteccia si apprezza al meglio utilizzando un obiettivo ad alta apertura numerica. Inoltre, è possibile misurare la velocità e il flusso dei globuli rossi dai capillari neocorticali profondi mediante scansione lineare.

La linea rossa indica il modello di scansione della linea sull'immagine capillare attraverso il microprisma. Poiché i globuli rossi non assorbono il colorante fluorescente, appariranno come striature scure. L'immagine in basso è il risultato di una scansione lineare con una dimensione spaziale in un AE e una dimensione temporale nell'altro.

Gli eventi avversi di questo possono calcolare il flusso e la velocità dei globuli rossi attraverso il capillare. Dopo che un microprisma è stato utilizzato in un animale, può essere riutilizzato più volte. Tuttavia, deve essere adeguatamente pulito per rimuovere il materiale biologico residuo.

Ciò può essere ottenuto immergendo il prisma in un piccolo volume di acido cloridrico, seguito da un'immersione nel metanolo. Il microprisma pulito può quindi essere avvolto in carta per lenti fino all'utilizzo della funzione. Questo conclude il nostro protocollo sull'uso di micro prismi per l'imaging corticale in vivo nei topi.

L'uso di microprismi in un esperimento di imaging è relativamente semplice e offre molti vantaggi quando si tratta di studi in vivo sulla neocorteccia. Ci auguriamo che tu abbia trovato questa tecnica interessante e che potrai utilizzare nel tuo laboratorio in futuro. Grazie per aver guardato e buona fortuna.