Name: Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri l'imaging in vivo dei strati corticali profondi usando microprismi di vetro nel neocorteccia del topo. Questa tecnica consente di visualizzare tutti e sei gli strati corticali contemporaneamente con un campo visivo ampio.

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Ringraziamo Anthony J. Koleske, PhD per fornire i topi YFP.

Parte 1: Ottica microprismi e l&#39;installazione Microscopio <ol><li> Il microprismi da noi utilizzati sono di 1 mm, ad angolo retto prismi a base di vetro BK7 acquistati dal Optosigma Corporation (Figura 1). Microprismi sono trattati con pinze quando possibile. </li><li> L&#39;ipotenusa del microprismi è rivestita con argento migliorato per fornire una riflettività superiore al 97% 400-2000 nm. Ciò fornisce riflessione interna sia la luce laser di eccitazione e la fluorescenza emessa. </li><li> Microprismi sono sempre trattati con pinze quando possibile. I guanti sono indossati in ogni momento a tenere pulito il prisma. </li><li> Usiamo un custom-built microscopio a due fotoni in grado di piccoli animali di imaging. L&#39;animale, collegare al dispositivo stereotassica, è posto su un palco a 3 assi motorizzati. </li><li> Il microscopio è collegato ad un PC Windows in esecuzione il software scanimage. Scanimage è software di acquisizione immagini scritto in Matlab da Pologruto et al 1. </li><li> Per l&#39;imaging microprismi, raccogliamo le immagini con una risoluzione di 1024 x 1024 o 512 x 512 pixel. Inoltre, di solito la scansione a 2 ms / riga o 4 ms / linea. </li><li> Due tipi di obiettivi sono utilizzati negli esperimenti: <ul><li> Una minore apertura numerica (NA) obiettivo aria per ampio campo di vista per immagini (vedi Tabella di reagenti e macchinari). </li><li> Un obiettivo più alto d&#39;aria NA con un collare di correzione di vetro in grado di minimizzare le aberrazioni sferiche indotta da 0 - 2 mm di vetro (vedi Tabella di reagenti e macchinari). </li></ul></li><li> Quando l&#39;animale è pronto per l&#39;imaging con un obiettivo a basso ingrandimento, allineare il modello quadrato raster di scansione del laser con la parte superiore del microprismi. Questo aiuterà l&#39;immagine orientarsi e fare un uso efficiente della potenza del laser. </li><li> Utilizzando un obiettivo più alto NA con un collare di correzione di vetro, impostare il collare di correzione per correggere circa 1 mm di vetro. Una volta che l&#39;immagine fluorescente viene visualizzata durante l&#39;esperimento, si può raggiungere con cura all&#39;interno del microscopio per ottimizzare il collare di correzione per ottimizzare la risoluzione delle immagini. </li></ol> Parte 2: non la sopravvivenza degli animali e Chirurgia inserzione microprismi <ol><li> La lunghezza intera procedura, dalla incisione iniziale fino al completamento di imaging, dipende dagli obiettivi dell&#39;esperimento. Tuttavia, la disposizione non sopravvivenza procedura chirurgica e microprismi si può aspettare che richiede circa 30 - 40 minuti per essere completato. </li><li> Topi (P30-P60) vengono pesati e anestetizzati con una iniezione opportunamente IP di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) a un piano adatto per interventi chirurgici. </li><li> Per tutto l&#39;intero esperimento, l&#39;animale deve essere controllato ogni 15-20 minuti per valutare il livello di anestesia. Se l&#39;animale reagisce a una ditta di convergenza pizzico, una dose supplementare di ketamina / xylazina è richiesto. In genere una dose supplementare è un terzo della dose iniziale e può essere preparata in anticipo in una siringa per l&#39;immediata iniezione IP, se necessario. </li><li> Una volta che il mouse viene adeguatamente anestetizzato, la maggior parte dei capelli sulla testa dell&#39;animale è radere utilizzando un decespugliatore con lama # 40. </li><li> Nair ® è applicato al peli rimasti sulla testa per creare una superficie libera di peli che possono ottenere nel senso della microprismi durante imaging. Dopo 5 minuti, la Nair ® è rimosso con un tampone di cotone con punta. </li><li> L&#39;animale anestetizzato è correttamente inserito in un dispositivo stereotassico mouse. Durante le procedure chirurgiche e le sessioni di imaging l&#39;animale è mantenuto su un pieno d&#39;acqua, piastra elettrica fissato a 36 gradi Celsius. </li><li> Con la testa dell&#39;animale correttamente fissata al suo posto, una incisione pulito è effettuata utilizzando un bisturi lungo la linea mediana del cranio per separare la pelle. </li><li> Una piccola quantità di perossido di idrogeno al 3% è collocato su un batuffolo di cotone con punta e applicata al cranio per eliminare le membrane tra il cranio e la pelle. </li><li> Il perossido di idrogeno aiuta anche a svelare bregma, un punto di riferimento importante nel sapere dove eseguire la craniotomia e inserire il microprismi. </li><li> Prima che la craniotomia è avviato, il bar e il bar morso all&#39;orecchio siano regolate correttamente per inclinare il cranio esposti in modo tale che è fondamentalmente il livello con la tabella. Ciò fornisce una piattaforma migliore per la craniotomia. Inoltre, questo rende la superficie superiore della perpendicolare prisma con la luce di eccitazione in arrivo. Questo contribuirà a minimizzare le aberrazioni ottiche, mentre imaging. </li><li> Una piccola bava dentale (~ 0.8 dimensioni della testa mm) è collegato ad uno strumento di Dremel ® utilizzando un braccio flessibile estensione. Per craniotomie, abbiamo impostato la velocità a circa 7.000 a 10.000 giri. </li><li> La bava dentale è scremato lungo il cranio fino a quando un solco quadrato è stabilita nelle ossa. I lati della piazza sono circa 2-3 mm di lunghezza e 1,5 centrato caudale mm e 1 mm lateralmente al bregma. </li><li> Proseguendo assottigliamento dell&#39;osso fino a una piccola apertura è fatta attraverso il cranio. Un paio di pinze can sollevare il lembo osseo lontano dal cranio. </li><li> La durata deve essere rimosso prima che il microprismi può essere inserito nella corteccia. Il sanguinamento è controllato meglio lasciando coagulare il sangue in superficie per alcuni minuti. Successivamente, il sangue coagulato viene rimosso con una spugna chirurgica prima di inserire la microprismi. </li><li> Per aiutare aiutare l&#39;allineamento del prisma con la corteccia, la faccia verticale del microprismi è allineata parallelamente alle maniglie del forcipe. </li><li> Con il prisma correttamente affermato, la microprismi tutto viene inserito fino a quando la parte superiore del prisma è a filo con la superficie neocorticale. </li><li> Una volta inserito correttamente, il microprismi dovrebbe rimanere nella posizione corretta. Qualsiasi sanguinamento che ne deriva è minimo e può essere assorbito con una piccola spugna chirurgica. Una volta che il prisma è al suo posto l&#39;animale è pronto per l&#39;imaging. </li><li> Dopo un microprismi è stato utilizzato in un animale, può essere riutilizzato più volte. Tuttavia, ha bisogno di essere puliti per rimuovere tutto il materiale residuo biologico. Questo può essere ottenuto immergendo il prisma in un piccolo volume di HCl acido, seguita da un tuffo in metanolo. Il microprismi pulite possono poi essere avvolti in carta per lenti fino al momento dell&#39;uso futuro. </li></ol> Parte 3: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Immagini del angolo retto microprismi. Prismi utilizzati in questo esperimento sono un millimetro, prismi di vetro BK7 con un rivestimento in argento rafforzata sulla ipotenusa per consentire riflessione interna di eccitazione e di emissione di luce. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Immagine dello strato V YFP neuroni piramidali. Ampio campo di vista di imaging con i microprismi rivela una vasta popolazione di corpi cellulari piramidali ~ 800-900 micron in profondità dalla superficie corticale. Inoltre, dendriti apicali che si estende fino alla strato posso anche essere risolto. Barra di scala = 200 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Un obiettivo apertura superiore numerico utilizzato in combinazione con il microprismi offre risoluzione spaziale sufficiente a risolvere spine dendritiche sui dendriti apicali sul livello V neuroni piramidali. Barra di scala = 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: L&#39;immagine ottenuta utilizzando il microprismi e una coda-vena iniezione di colorante fluorescente. L&#39;immagine mostra verticale, vasi di grosso calibro che si estende da regioni cerebrali profonde e più piccoli capillari che si diramano attraverso il volume corticale. Barra di scala = 200 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Utilizzo di un obiettivo più alto apertura numerica, la rete di capillari nella neocorteccia può essere ripreso con maggiore dettaglio. Barra di scala = 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: microprismi consente anche per l&#39;imaging globuli rossi (RBC) che scorre attraverso i vasi. Globuli rossi non assorbono il colorante fluorescente e quindi sono viste come strisce scure che attraversano la nave. Con la scansione lineare attraverso il vaso, si può ottenere misurazioni del flusso dei globuli rossi e velocità. Barra di scala = 10 micron (barra orizzontale di immagine superiore e inferiore) e 250 ms (barra verticale in immagine in basso).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal IACUC della Yale University.

Utilizzando un microprismi in un esperimento di imaging è relativamente semplice e offre molti vantaggi per studi in vivo sul neocorteccia. Esempi rappresentativi di questa tecnica includono immagini tratte da topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla nello strato V neuroni corticali. Utilizzando microprismi si può vedere una collezione di grandi corpi cellulari piramidali dello strato V, quasi 1 mm sotto la superficie corticale. Visto anche i dendriti apicali che si estendono attraverso tutti gli s...

<table><tbody><tr><td>Con rivestimento riflettente argentato migliorato - (R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Con rivestimento riflettente argentato migliorato - (R77)</td></tr><tr><td>Fluoresceina-destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>Obiettivo a immersione in aria, NA 0,28, 4x</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo a immersione in aria, NA 0,60, 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Con correzione vetrino 0-2 mm</td></tr></tbody></table>

imaging in vivo di deep strati corticali usando un microprismi

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Vi presentiamo un protocollo per l&#39;imaging in vivo di tessuto corticale utilizzando una profonda sonda di imaging del cervello in forma di microprismi. Microprismi sono 1-mm e hanno un rivestimento riflettente l&#39;ipotenusa per consentire riflessione interna di eccitazione e di emissione di luce. La sonda microprismi contemporaneamente più immagini strati corticali con una prospettiva tipicamente visto solo in preparati fetta. Le immagini sono raccolte in un grande campo di vista (~ 900 micron). Inoltre, forniamo i dettagli sulla non-sopravvivenza procedura chirurgica e la configurazione microscopio. Risultati rappresentativi includono immagini dello strato V neuroni piramidali da Thy-1-H YFP topi mostrano il loro dendriti apicali si estende attraverso lo strato superficiale della corteccia e si estende in ciuffi. Risoluzione è stata sufficiente a immagine spine dendritiche nei pressi del soma di strato di neuroni V. Una coda vena iniezione di colorante fluorescente svela l&#39;intricata rete di vasi sanguigni nella corteccia. Scansione lineare di globuli rossi (RBC) che fluisce attraverso i capillari rivela la velocità dei globuli rossi e tassi di flusso possono essere ottenuti. Questa sonda microprismi romanzo è un elegante metodo nuovo e potente di visualizzare profonde strutture cellulari e la funzione corticale in vivo.

Angolo retto microprismi inserita nella neocorteccia del mouse permette l&#39;imaging con profonda di più strati corticali con un punto di vista tipicamente si trovano in fetta. Un millimetro microprismi offrono un ampio campo di vista (~ 900 micron) e risoluzione spaziale sufficiente per risolvere spine dendritiche. Dimostriamo strato di imaging neuronale V e neocorticale imaging vascolare con microprismi.

Imaging in vivo di Deep strati corticali usando un microprismi

Presentiamo un protocollo per l'imaging in vivo del tessuto corticale utilizzando una sonda per l'imaging cerebrale profondo a forma di microprisma. I microprismi hanno dimensioni di 1 mm...

Le tecniche di microscopia a fluorescenza hanno una capacità limitata di acquisire immagini di strutture profonde all'interno del tessuto, specialmente in materiali altamente diffusivi alla luce come il tessuto cerebrale. Anche nel caso della microscopia a due fotoni, può risultare molto difficile ottenere immagini in vivo di alta qualità di strutture neurali situate a una profondità superiore a 500 micrometri rispetto alla superficie della neocorteccia. Qui, la linea verde indica una profondità di 500 micrometri.In generale, i livelli neocorticali quattro, cinque e sei si trovano a più di 500 micron dalla superficie. Mostreremo come un microprisma di vetro di un millimetro, inserito nel neocortex, possa convogliare la luce all'interno e all'esterno dei livelli corticali superficiali e profondi. Utilizzando questa tecnica in un topo, è possibile ottenere un campo visivo di un millimetro e visualizzare simultaneamente tutti e sei i livelli corticali da una prospettiva di imaging, tipicamente riscontrabile soltanto in tessuto cerebrale sezionato.I microprismi offrono un ampio campo visivo in grado di visualizzare i corpi cellulari dei neuroni parametali dello strato V con le loro lunghe dendriti apicali e la rete complessa di vasi sanguigni nella neocorteccia, mantenendo al contempo risoluzioni spaziali sufficienti a distinguere le spine dendritiche e il flusso di globuli rossi attraverso i microcapillari. Mi chiamo Thomas Chia e sono uno studente laureato nel laboratorio del Professor Michael Levine presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università di Yale. Il protocollo che discuteremo in questo video riguarda l'utilizzo di microprismi di vetro ad angolo retto di un millimetro per generare immagini a fluorescenza di strutture situate a un millimetro di profondità nella neocorteccia di un topo.I microprismi che utilizziamo sono prismi a angolo retto di un millimetro, realizzati in vetro BK7 e acquistati presso la Opto Sigma Corporation. I microprismi vengono maneggiati con pinzette ogni volta che possibile. L'ipotenusa del microprisma è ricoperta con argento migliorato per garantire una riflettività superiore al 97% da 400 a 2000 nanometri.Questo permette la riflessione interna sia della luce di eccitazione laser sia della fluorescenza rilevata. Utilizziamo un microscopio personalizzato a due fotoni, in grado di effettuare imaging su piccoli animali. L'animale, fissato a un dispositivo stereotassico, viene posizionato su un palcoscenico motorizzato a tre assi.Il microscopio è collegato a un PC Windows che esegue il software Scan Image. Scan Image è un software per l'acquisizione di immagini scritto in MATLAB da Polo Gudo et al. Per l'immagine con microprisma, raccogliamo immagini a una risoluzione di 10 24 per 10 24 oppure di 5 12 per 5 12 pixel.Inoltre, di solito effettuiamo la scansione con un tempo di due millisecondi per riga oppure di quattro millisecondi per riga. Un aspetto importante di questo protocollo è il tipo di obiettivi del microscopio utilizzati in abbinamento ai microprismi. Negli esperimenti vengono impiegati due tipi di obiettivi.L'obiettivo a sinistra è un obiettivo a immersione d'aria con bassa apertura numerica, adatto all'acquisizione di immagini su ampi campi visivi; in questo caso, un obiettivo Olympus 4x 0,28 NA. L'obiettivo a destra è un obiettivo a immersione d'aria da 40x 0,60 NA ad alta apertura numerica, dotato di un collare correttivo in vetro in grado di minimizzare le aberrazioni sferiche indotte da zero a due millimetri di vetro. Per preparare il topo all'intervento chirurgico e all'inserimento del microprisma, il primo passo consiste nell'anestetizzare correttamente l'animale fino a un livello adeguato per procedure chirurgiche.Prima di tutto, si registra il peso dell'animale in base alla dose stabilita. Un volume appropriato di una miscela di chetamina e xilazina viene aspirato in una siringa. I farmaci anestetici vengono somministrati mediante iniezione IP utilizzando un ago da 28 gauge.Una volta che il topo ha raggiunto un piano di anestesia adatto a procedure chirurgiche, la maggior parte del pelo sulla testa dell'animale viene rasata utilizzando un rasoio con lama numero 40. Successivamente, viene applicata una crema depilatoria sui peli residui della testa per ottenere una superficie priva di peli che potrebbero ostacolare il microprisma. Durante l'acquisizione delle immagini, dopo cinque minuti, la crema depilatoria viene rimossa utilizzando un bastoncino di cotone; l'animale anestetizzato viene quindi posizionato correttamente in un apparato stereotassico per topi.Durante le procedure chirurgiche e le sessioni di imaging, l'animale viene mantenuto su un tappetino riscaldante riempito d'acqua, impostato a 36 gradi Celsius. Con la testa dell'animale correttamente fissata, viene effettuata una singola incisione pulita lungo la linea mediana del cranio. Per separare la pelle, una piccola quantità di perossido di idrogeno al 3% viene applicata su un bastoncino di cotone e poi posta sul cranio per rimuovere le membrane presenti tra il cranio e la pelle.L'ossidante di idrogeno aiuta anche a rivelare la BMA, un punto di riferimento fondamentale per individuare dove eseguire la craniotomia e inserire il microprisma. Prima di iniziare la craniotomia, i supporti auricolari e il morsetto per la bocca vengono regolati correttamente in modo da inclinare il cranio esposto fino a renderlo sostanzialmente parallelo al piano del tavolo. Questo offre una piattaforma migliore per la craniotomia.Una piccola fresa dentale è collegata a uno strumento Dremel per le craniotomie. Impostiamo la velocità a circa 7.000-10.000 giri al minuto. La fresa viene passata leggermente lungo il cranio fino a quando si forma una scanalatura quadrata nell'osso.I lati del quadrato hanno una lunghezza di circa due-tre millimetri e sono centrati. Procedere con un taglio di 1,5 millimetri e un margine laterale di un millimetro, continuando ad assottigliare l'osso fino a creare un piccolo foro attraverso il cranio. Una pinza può sollevare il lembo osseo.La dura deve essere rimossa prima che il microprisma possa essere inserito nella corteccia. L'emorragia è meglio controllata lasciando coagulare il sangue sulla superficie per diversi minuti. Successivamente, il sangue coagulato viene rimosso utilizzando una spugna chirurgica per facilitare l'allineamento del prisma con la corteccia.La faccia verticale del microprisma è allineata parallelamente alle impugnature della pinzetta. Con il prisma correttamente tenuto, l'intero microprisma viene inserito fino a quando la parte superiore del prisma risulta allineata con la superficie della neocorteccia. Qui possiamo vedere il prisma a riposo nella neocorteccia.Quando inserito correttamente, il microprisma dovrebbe rimanere nella posizione appropriata. Eventuali sanguinamenti risultanti sono minimi e possono essere assorbiti con una piccola spugna chirurgica. Una volta che il prisma è in posizione, l'animale è pronto per l'acquisizione delle immagini.Con un obiettivo a basso ingrandimento, è possibile osservare la scansione raster del laser sul microprisma presente sulla superficie del cervello. Di seguito sono riportati alcuni esempi rappresentativi di immagini ottenute da topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla. Nei neuroni corticali dello strato cinque, utilizzando microprismi, è possibile osservare un insieme di grandi corpi cellulari paramediali nello strato cinque, a circa un millimetro al di sotto della superficie corticale.Si osservano inoltre i dendriti apicali che si estendono attraverso tutti gli strati superficiali prima di diramarsi in ciuffi; utilizzando un obiettivo ad alta apertura numerica con collare di correzione per il vetro, è possibile risolvere le spine dendritiche in questo caso. Sui dendriti apicali dei neuroni parametali dello strato cinque, le spine dendritiche sono strutture sub-micrometriche e diverse sono identificate nell'immagine mediante punte di freccia gialle. È inoltre possibile marcare i vasi sanguigni corticali con un colorante fluorescente, come il dextrano fluorosceina, utilizzando tecniche consolidate di iniezione nella vena della coda.Utilizzando questa tecnica, è possibile osservare i vasi di calibro maggiore negli strati profondi che si estendono verso la PIA e si ramificano formando la rete di microcapillari. Questa rete delicata di microcapillari nella neocorteccia è meglio apprezzabile utilizzando un obiettivo ad alta apertura numerica. Inoltre, è possibile misurare la velocità e il flusso dei globuli rossi nei capillari neocorticali profondi mediante scansione lineare.La linea rossa indica il modello di scansione della linea sull'immagine del capillare attraverso il microprisma. Poiché i globuli rossi non assorbono il colorante fluorescente, appariranno come striature scure. L'immagine in basso è il risultato di una scansione a linea con una dimensione spaziale in un asse e una dimensione temporale nell'altro.Da questi AE è possibile calcolare il flusso e la velocità dei globuli rossi attraverso il capillare. Dopo che un microprisma è stato utilizzato in un animale, può essere riutilizzato più volte. Tuttavia, deve essere adeguatamente pulito per rimuovere qualsiasi materiale biologico residuo.Questo può essere ottenuto immergendo il prisma in un piccolo volume di acido cloridrico, seguito da un'immersione nel metanolo. Il microprisma pulito può quindi essere avvolto in carta per lenti fino al suo utilizzo. Questo conclude il nostro protocollo sull'uso di microprismi per l'immagine corticale in vivo nei topi.L'utilizzo di microprismi in un esperimento di imaging è relativamente semplice e offre numerosi vantaggi per gli studi in vivo sulla neocorteccia. Speriamo che abbiate trovato questa tecnica interessante e che possiate utilizzarla nel vostro laboratorio in futuro. Grazie per aver guardato e buona fortuna.

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