Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

Questo protocollo consente di analizzare rapidamente i principali componenti del lipide del lievito. Si inizia con la raccolta e il lavaggio delle cellule di lievito. Le cellule lavate vengono poste in una miscela di cloroformio o due e lisate con perle di vetro.

L'aggiunta di cloroformio e acqua separa le due fasi. La fase organica viene raccolta, essiccata e il film lipidico viene quindi disciolto in cloroformio per la conservazione prima della spettroscopia di massa. I lipidi estratti vengono diluiti in cloroformio e metanolo con idrossido di ammonio e viene aggiunto un mix di standard interni.

La soluzione lipidica può ora essere iniettata direttamente nello spettrometro di massa. Ciao, sono Simon Bork del laboratorio di Vladimir Teco presso il Dipartimento di Biologia della Concordia University. Oggi vi mostrerò un metodo per quantificare i lipidi del lievito utilizzando la spettroscopia di massa.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i cambiamenti dei lipidi del lievito in diverse condizioni di crescita. Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, sospendere nuovamente i pellet di lievito congelati precedentemente preparati in 1,6 millilitri di ghiaccio, acqua distillata fredda e trasferire 1,6 millilitri della sospensione cellulare in provette da centrifuga di vetro ad alta velocità.

Si noti che durante questa procedura, tutte le manipolazioni con i lipidi estratti vengono eseguite utilizzando pipette o siringhe di vetro. Poiché le materie plastiche creano un grande segnale di fondo, se entrano in contatto con il cloroformio, iniziare l'estrazione dei lipidi aggiungendo sei millilitri di una miscela di metanolo cloroformio in un rapporto di uno a due e 0,8 millilitri di perle di vetro misurate in un tubo einor alla sospensione cellulare. I volumi esatti non sono critici finché si mantiene il rapporto di uno a due a 0,8 per cloroformio, metanolo e lievito sospeso in acqua. Vortice.

La sospensione cellulare e le perle di vetro si mescolano due volte per un minuto ogni volta, continuano aggiungendo due millilitri di cloroformio e mescolando delicatamente, quindi incubano per cinque minuti a temperatura ambiente mescolando occasionalmente. Dopo i cinque minuti di incubazione, aggiungere due millilitri di acqua distillata e mescolare delicatamente. Quindi di nuovo, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente mescolando occasionalmente.

Anche in questo caso, è più importante mantenere il rapporto di due a due a 1,8 per il cloroformio, il metanolo e l'acqua piuttosto che un volume specifico. Al termine della seconda incubazione. Centrifugare per cinque minuti a 3000 Gs a temperatura ambiente, raccogliere tutto il surnatante di questa prima estrazione in una nuova provetta da centrifuga di vetro ad alta velocità e aggiungere 3,2 millilitri di cloroformio ai restanti pellet cellulari per una seconda estrazione lipidica.

Agitare i pellet di cella con il cloroformio aggiunto due volte per un minuto ogni volta. Quindi centrifugare per cinque minuti a 3000 Gs A temperatura ambiente, aggiungere il surnatante di questa seconda estrazione al surnatante raccolto dopo la prima estrazione. Centrifugare quindi i surnatanti raccolti per cinque minuti.

A 3000 Gs a temperatura ambiente, i lipidi estratti sono ora disciolti nella fase organica inferiore. Scartare la fase acquosa superiore e trasferire la fase inferiore in una nuova provetta da centrifuga in vetro ad alta velocità. Per produrre spettri più puliti sulla centrifuga dello spettrometro di massa, la fase organica per cinque minuti a 3000 Gs a temperatura ambiente e trasferire l'intero surnatante in una fiala di vetro.

Essiccare i lipidi disciolti sotto azoto, sciogliere il film lipidico essiccato in 500 microlitri di cloroformio e conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento di analizzare i campioni mediante spettrometria di massa. Iniziare preparando una miscela standard dei lipidi nel cloroformio come elencato nella tabella uno che si trova nel protocollo scritto allegato. Ogni lipide rappresenta una classe diversa.

Questa soluzione può essere conservata a meno 20 gradi Celsius per essere utilizzata in un secondo momento prima dell'iniezione dei lipidi estratti nello spettrometro di massa. Combinato 10 microlitri del campione con 10 microlitri della miscela standard di lipidi. Si noti che il rapporto standard/campione può essere modificato in base alle esigenze.

Risolvere il campione e la miscela lipidica standard utilizzando uno spettrometro di massa a due spettrometri di massa da Q a F, dotato di una sorgente di nano elettrospray funzionante a una velocità di flusso di un microlitro al minuto. Le impostazioni sono descritte in dettaglio nella tabella due del protocollo scritto allegato. Sebbene l'uso dell'alta risoluzione di uno spettrometro di massa da Q a F sia vantaggioso, non è un requisito obbligatorio.

I parametri esatti dello strumento variano tra gli spettrometri di massa. Dopo l'acquisizione dei dati, gli spettri di massa vengono levigati, lo sfondo sottratto e i picchi centrati. Infine, esporta l'elenco dei picchi in Excel.

Quindi normalizzare i picchi di ciascun vetro lipidico al loro standard interno. A seconda dell'applicazione, potrebbe essere necessario eseguire ulteriori operazioni di post-elaborazione, come l'isotopo de e la deconvoluzione. Questo metodo consente la rapida e approfondita determinazione dei principali componenti del lipide del lievito.

Qui abbiamo evidenziato un lipide, che è stato de isotopo de contorto e normalizzato al suo standard interno. Ti abbiamo appena mostrato come isolare i lipidi del lievito e come determinare i lipidi del lievito utilizzando la spettroscopia di massa a ionizzazione con display elettronico. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare l'uso di plastica e di mantenere il campione nell'intervallo lineare di concentrazioni.

Questo metodo è abbastanza flessibile e in molti dei volumi può essere modificato secondo necessità. Questo protocollo di estrazione è adatto anche per altri metodi di analisi dei lipidi, come la cromatografia su strato sottile e la spettroscopia di massa multidimensionale. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.