Name: Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Scopri un metodo di lipidomica quantitativa nel lievito utilizzando la spettrometria di massa ESI/MS. Questa tecnica consente l'identificazione rapida e sensibile delle specie lipidiche per studi metabolici avanzati.

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Siamo grati a Alain Tessier per preziosi consigli, discussioni e supporto tecnico. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche di Spettrometria di Massa presso la Concordia University di servizi eccezionali. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal CIHR e la NSERC del Canada. VIT è un investigatore CIHR New Research Chair e Concordia University di Genomica, Biologia Cellulare e invecchiamento.

Materiali e metodi <ol><li> Ceppi di lievito e le condizioni di crescita Il ceppo selvatico BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) era cresciuto in media ricca YEPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di glucosio). Le cellule sono state coltivate a 30 ° C con agitazione di rotazione a 200 rpm in beute con un rapporto &quot;fiasco volume / medio volume&quot; di 5:1. </li><li> Stoccaggio di cellule di lievito per l&#39;estrazione dei lipidi <ol><li> Una cultura da 50 ml di cellule è stato raccolto per centrifugazione a 3000 xg per 5 minuti. </li><li> Lavato due volte con acqua fredda. <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li> Risospendere il pellet in 25 ml di acqua ghiacciata fredda </li><li> Cellule pellet in centrifugare a 3000 xg per 5 minuti </li></ol></li><li> Risospendere il pellet e trasferimento a tubo eppendorf </li><li> Pellet per centrifugazione, 16.000 xg per 2 minuti, rimuovere il surnatante e congelare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. (Usiamo un bicchiere di alcool isopropilico conservati nel congelatore -80, azoto liquido può essere utilizzato anche) </li></ol></li><li> Reagenti Biotech cloroformio grado e metanolo sono da Sigma-Aldrich. Acidi grassi liberi e trigliceridi sono stati acquistati dalla Larodan (Malmö, Svezia). Varie specie di fosfolipidi - tra cui fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositolo, fosfatidilserina, acido fosfatidico e cardiolipins - sono stati ottenuti da lipidi Avanti Polar (Alabastro, AL, USA). Ad alta velocità centrifuga tubi di vetro con tappo rivestito in teflon sono stati da Fisher. </li></ol> Estrazione dei lipidi Si tratta di una modifica del protocollo descritto da Bligh e Dyer 8. Tutte le manipolazioni con i lipidi estratto deve essere fatto utilizzando siringhe o pipette di vetro, plastica crea un segnale di grande fondo se entrano in contatto con il cloroformio. I volumi esatte non sono critiche fino a quando i rapporti di 1:2:0.8 per il cloroformio - MeOH - H 2 O al punto 3 e 2:2:1.8 per il cloroformio - MeOH - H 2 O al punto 7 sono conservati. <ol><li> Risospendere le cellule congelate in 1,6 ml di ghiacciata distillata H 2 O. </li><li> Trasferire 1,6 ml di sospensione cellulare di tubi di vetro ad alta velocità centrifuga. </li><li> Aggiungere 6 ml di cloroformio e MeOH (1:2) e miscelare 0,8 ml di perline di vetro alla sospensione cellulare. </li><li> Vortex la sospensione cellulare con perle di vetro due volte per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 2 ml di cloroformio e mescolare delicatamente. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con miscelazione occasionali. </li><li> Aggiungere 2 ml di H 2 O distillata e mescolare delicatamente. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con miscelazione occasionali. </li><li> Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere tutta la fase liquida in una nuova ad alta velocità, tubo di vetro per centrifuga. </li><li> Aggiungere 3,2 ml di cloroformio al pellet cellulari dal punto 9. </li><li> Vortex due volte per 1 minuto. </li><li> Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il sopranatante in fase liquida a partire dal punto 10. </li><li> Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il superiore (acquosa) di fase e il trasferimento inferiore (organici) in una nuova fase alta velocità tubo di vetro per centrifuga. </li><li> Centrifugare per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire il surnatante in un intero flacone di vetro e secco sotto azoto. </li><li> Sciogliere il film lipidico in 500 ml di cloroformio e conservare a -20 ° C. </li></ol> Analisi dei lipidi mediante spettrometria di massa Un mix stock di standard di lipidi in cloroformio deve essere preparato in anticipo come da tabella 1, così come una soluzione stock di MeOH - cloroformio (1:1) con il 0,1% (v / v) di idrossido di ammonio. <ol><li> Prima dell&#39;iniezione, unire 10 ml di un campione con 10 microlitri della miscela standard di lipidi riportate nella Tabella 1. In 200μL di 1:1 cloroformio: metanolo con 0,1% di NH 4 OH. <ul><li> Lo standard di rapporto di campione possono essere modificati se necessario. </li></ul></li><li> Risolvere i lipidi con un Q-TOF Micromass 2 spettrometro di massa dotata di un nano-elettrospray operativi di fonte ad un flusso di 1 ml / min. <ul><li> Parametri dello strumento esatta varia da strumento a strumento. Vedere la Tabella 2 per le impostazioni di un Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) dotata di un nano-elettrospray fonte. Anche se abbiamo sfruttato l&#39;alta risoluzione di un Q-TOF tipo di spettrometro di massa, non è un requisito obbligatorio. </li></ul></li><li> Dopo l&#39;acquisizione degli spettri di massa vengono smussate, sfondo sottratto e centrato, e quindi l&#39;elenco picco esportati in Excel. I picchi di ogni classe dei lipidi vengono poi normalizzate ai loro standard interno. A seconda dell&#39;applicazione, può essere necessario fare eseguire ulteriori post-elaborazione, come deisotoping e deconvoluzione. </li></ol> Lipidici standard Tabella 1. Interno, la loro concentrazione inil mix standard, e la modalità MS per la loro analisi. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Lipidi classe </td><td> Catena di composizione standard </td><td> Massa di standard </td><td> Concentrazione (mg / ml) </td><td> MS modalità </td></tr><tr><td> L&#39;acido fosfatidico </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 591,40 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidiletanolamina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 634,45 </td><td> 200 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilinositolo </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilserina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 622,37 </td><td> 40 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Cardiolipina </td><td> 4x14: 0 </td><td> 619,92 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Acidi grassi liberi </td><td> 19:00 </td><td> 297,28 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilcolina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 650,48 </td><td> 100 </td><td> Positivo </td></tr><tr><td> Triacilgliceroli </td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698,63 </td><td> 200 </td><td> Positivo </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Impostazioni dello strumento per una Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) dotata di un nano-elettrospray fonte. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Portata </td><td> Cono di tensione </td><td> Tensione capillare </td><td> Collisione di gas </td></tr><tr><td> Modalità positiva </td><td> 1μl/min </td><td> -28 V </td><td> 3,0 kV </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Modalità negativa </td><td> 1μl/min </td><td> 30 V </td><td> -3,2 Kv </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

Questo metodo consente una rapida valutazione quantitativa del lipidome lievito utilizzando prontamente disponibili, materiali poco costosi. Il metodo permette l&#39;identificazione della maggior parte delle specie di lipidi si trovano in cellule di lievito con l&#39;eccezione di diacilgliceroli, ergosteroli ergosteryl ed esteri, anche se questi lipidi possono essere identificati sostituendo idrossido di ammonio e di idrossido di litio. Il metodo descritto permette l&#39;identificazione e quantificazione dei lipidi alle...

una valutazione quantitativa del lipidome lievito con ionizzazione electrospray spettrometria di massa

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

I lipidi sono una delle principali classi di biomolecole e giocare ruoli importanti membrana dinamica, immagazzinamento di energia, e la segnalazione<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Il lievito in erba<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Un organismo geneticamente e biochimicamente eucarioti unicellulari manipolabili con genoma annotati e lipidome molto semplice, è un modello valido per studiare le funzioni biologiche di specie diverse di lipidi negli eucarioti pluricellulari<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;.<em&gt; S. Saccharomyces</em&gt; Ha 10 principali classi di lipidi di lunghezza catena principalmente di 16 o 18 atomi di carbonio e uno o nessun grado di insaturazione<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Gli attuali metodi per l&#39;identificazione e quantificazione dei lipidi - come la cromatografia liquida ad alte prestazioni, cromatografia su strato sottile, microscopia a fluorescenza, e gas-cromatografia seguita da MS - sono ben stabiliti, ma hanno una bassa sensibilità, le varie forme sufficientemente separati molecolari dei lipidi, richiedono derivitization lipidi prima di analisi, o può essere abbastanza tempo. Presentiamo qui una descrizione dettagliata del nostro approccio sperimentale per risolvere queste limitazioni intrinseche tramite sondaggio-scan ESI / MS per l&#39;identificazione e la quantificazione del complemento di tutto di lipidi nelle cellule di lievito. Il metodo descritto non richiede la separazione cromatografica di miscele di lipidi complessi recuperato da cellule di lievito, quindi notevolmente accelerare il processo di acquisizione dei dati. Questo metodo consente l&#39;identificazione e quantificazione dei lipidi alle concentrazioni più basso g / ml ed è stato applicato con successo per valutare lipidomes di cellule di lievito e tutto il loro organelli purificato. Estrazione di lipidi da cellule di lievito tutto per l&#39;utilizzo di questo metodo di analisi dei lipidi richiede da due a tre ore. Ci vogliono solo 5-10 minuti per eseguire ogni campione di lipidi estratti e secca su un Q-TOF spettrometro di massa dotata di un nano-elettrospray fonte.

Descriviamo un nuovo metodo quantitativo per l&#39;identificazione lipidomica numerose specie lipidico nel lievito con sondaggio-scan ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI / MS). Questo metodo supera attualmente i metodi disponibili per l&#39;identificazione e la quantificazione dei lipidi nella capacità di risolvere le varie forme molecolari dei lipidi, la sensibilità e la velocità.

Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

I lipidi rappresentano una delle principali classi di biomolecole e svolgono ruoli importanti nella dinamica di membrana, nell'accumulo di energia e nella segnalazione1-4. Il lievito a gemmazione...

Questo protocollo consente di analizzare rapidamente i principali componenti dei lipidi del lievito. Si inizia raccogliendo e lavando le cellule di lievito. Le cellule lavate vengono poste in una miscela di cloroformio e metanolo in rapporto uno a due e lisate con perline di vetro.L'aggiunta di cloroformio e acqua separa le due fasi. Si raccoglie la fase organica, la si essicca e quindi si dissolve il film lipidico in cloroformio per la conservazione prima della spettrometria di massa. I lipidi estratti vengono diluiti in cloroformio e metanolo con idrossido di ammonio e viene aggiunta una miscela di standard interni.La soluzione lipidica può ora essere iniettata direttamente nello spettrometro di massa. Ciao, sono Simon Bork del laboratorio di Vladimir Teco presso il Dipartimento di Biologia della Concordia University. Oggi vi mostrerò un metodo per quantificare i lipidi del lievito utilizzando la spettrometria di massa.Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le variazioni dei lipidi del lievito in diverse condizioni di crescita. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, risospendere i pellet di lievito precedentemente preparati e congelati in 1

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Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Descrizione di una procedura di fosforilazione quantitativa, utilizzando cryolysis, solubilziation urea, frazionamento HILIC e arricchimento IMAC di peptidi fosforilati.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Qui, presentiamo un'implementazione MATLAB di rilevamento automatico e descrizione quantitativa delle goccioline lipidiche nelle immagini di microscopia a fluorescenza di fissione e cellule di lievito in erba.

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