Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa
21 agosto 2009
Descriviamo un nuovo metodo quantitativo per l'identificazione lipidomica numerose specie lipidico nel lievito con sondaggio-scan ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI / MS). Questo metodo supera attualmente i metodi disponibili per l'identificazione e la quantificazione dei lipidi nella capacità di risolvere le varie forme molecolari dei lipidi, la sensibilità e la velocità.
Questo protocollo consente di analizzare rapidamente i principali componenti dei lipidi del lievito. Si inizia raccogliendo e lavando le cellule di lievito. Le cellule lavate vengono poste in una miscela di cloroformio e metanolo in rapporto uno a due e lisate con perline di vetro.
L'aggiunta di cloroformio e acqua separa le due fasi. Si raccoglie la fase organica, la si essicca e quindi si dissolve il film lipidico in cloroformio per la conservazione prima della spettrometria di massa. I lipidi estratti vengono diluiti in cloroformio e metanolo con idrossido di ammonio e viene aggiunta una miscela di standard interni.
La soluzione lipidica può ora essere iniettata direttamente nello spettrometro di massa. Ciao, sono Simon Bork del laboratorio di Vladimir Teco presso il Dipartimento di Biologia della Concordia University. Oggi vi mostrerò un metodo per quantificare i lipidi del lievito utilizzando la spettrometria di massa.
Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le variazioni dei lipidi del lievito in diverse condizioni di crescita. Cominciamo dunque. Per iniziare questa procedura, risospendere i pellet di lievito precedentemente preparati e congelati in 1,6 millilitri di acqua distillata fredda di ghiaccio, quindi trasferire 1,6 millilitri della sospensione cellulare in provette di centrifuga in vetro ad alta velocità.
Si noti che durante tutta questa procedura, tutte le manipolazioni dei lipidi estratti vengono effettuate utilizzando pipette o siringhe di vetro. Poiché le materie plastiche genererebbero un segnale di fondo elevato se venissero a contatto con il cloroformio, iniziare l'estrazione dei lipidi aggiungendo sei millilitri di una miscela cloroformio-metanolo in rapporto uno a due e 0,8 millilitri di perline di vetro misurate in un tubo einor alla sospensione cellulare. I volumi esatti non sono critici, purché venga mantenuto il rapporto di uno a due a 0,8 per cloroformio, metanolo e lievito sospeso in acqua. Vortexare.
Sospendere le cellule e i microsfere di vetro due volte per un minuto ciascuna, quindi aggiungere due millilitri di cloroformio e mescolare delicatamente; incubare per cinque minuti a temperatura ambiente con mescolamenti occasionali. Al termine dell'incubazione di cinque minuti, aggiungere due millilitri di acqua distillata e mescolare delicatamente. Quindi, incubare nuovamente per cinque minuti a temperatura ambiente con mescolamenti occasionali.
Anche in questo caso, è più importante mantenere il rapporto di due a due a 1,8 tra cloroformio, metanolo e acqua piuttosto che un volume specifico. Al termine della seconda incubazione, centrifugare per cinque minuti a 3000 G a temperatura ambiente, raccogliere tutto il soprannatante di questa prima estrazione in un nuovo tubo da centrifuga in vetro ad alta velocità e aggiungere 3,2 millilitri di cloroformio ai pellet cellulari rimanenti per una seconda estrazione lipidica.
Vortexare i pellet cellulari con il cloroformo aggiunto due volte per un minuto ogni volta. Quindi centrifugare per cinque minuti a 3000 G a temperatura ambiente, aggiungere il soprannatante di questa seconda estrazione al soprannatante raccolto dopo la prima estrazione. Successivamente, centrifugare i soprannatanti raccolti per cinque minuti.
A 3000 G a temperatura ambiente, i lipidi estratti sono ora disciolti nella fase organica inferiore. Eliminare la fase acquosa superiore e trasferire la fase inferiore in un nuovo tubo centrifugo in vetro ad alta velocità. Per ottenere spettri più puliti sullo spettrometro di massa, centrifugare la fase organica per cinque minuti a 3000 G a temperatura ambiente e trasferire tutto il soprannatante in un vial di vetro.
Asciugare i lipidi disciolti sotto azoto, sciogliere il film lipidico essiccato in 500 microlitri di cloroformio e conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'analisi dei campioni mediante spettrometria di massa. Iniziare preparando una miscela standard dei lipidi in cloroformio come indicato nella tabella uno del protocollo scritto allegato. Ogni lipide rappresenta una classe diversa.
Questa soluzione può essere conservata a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo prima dell'iniezione dei lipidi estratti nello spettrometro di massa. Combinare 10 microlitri del campione con 10 microlitri della miscela standard di lipidi. Si noti che il rapporto tra standard e campione può essere modificato secondo le necessità.
Separare la miscela del campione e dei lipidi standard utilizzando uno spettrometro di massa micro mass Q to F, dotato di una sorgente nano-elettrospray che opera a un flusso di un microlitro al minuto. Le impostazioni sono dettagliate nella tabella due del protocollo scritto allegato. Sebbene l'utilizzo dell'elevata risoluzione di uno spettrometro di massa Q to F sia vantaggioso, non rappresenta un requisito obbligatorio.
I parametri esatti dello strumento variano a seconda degli spettrometri di massa. Dopo l'acquisizione dei dati, gli spettri di massa vengono lisciati, viene sottratto il fondo e i picchi vengono centrati. Infine, esportare l'elenco dei picchi in Excel.
Quindi normalizzare i picchi di ogni vetrino lipidico rispetto al relativo standard interno. A seconda dell'applicazione, potrebbe essere necessario eseguire ulteriori elaborazioni successive, come la desotopizzazione e la deconvoluzione. Questo metodo consente una rapida determinazione approfondita dei componenti principali del lipido di lievito do.
Qui abbiamo evidenziato un lipide, che è stato desovrapposto per isotopi e normalizzato rispetto al suo standard interno. Vi abbiamo appena mostrato come isolare i lipidi del lievito e come determinare i lipidi del lievito utilizzando la spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrostatico. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di evitare l'uso di materiali plastici e di mantenere il campione entro il range lineare di concentrazioni.
Questo metodo è piuttosto flessibile e molti dei volumi possono essere modificati secondo le esigenze. Questo protocollo di estrazione è adatto anche ad altre metodiche di analisi dei lipidi, come la cromatografia su strato sottile e la spettrometria di massa multidimensionale. Ecco tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo di lipidomica quantitativa per l'identificazione di diverse specie lipidiche nel lievito mediante spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray in modalità analisi completa (ESI/MS). Questo metodo rappresenta un notevole miglioramento rispetto alle tecniche esistenti per quanto riguarda l'identificazione e la quantificazione dei lipidi, la sensibilità e la velocità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Lipidomica
- Spettrometria di Massa
- Biologia del Lievito
Sfondo
- La lipidomica è fondamentale per comprendere le funzioni cellulari.
- I metodi tradizionali per l'analisi dei lipidi presentano limitazioni in termini di sensibilità e risoluzione.
- La spettrometria di massa con ionizzazione ESI in modalità scan di rilevamento rappresenta un'alternativa promettente.
- Questo studio mira a migliorare l'identificazione e la quantificazione dei lipidi nel lievito.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido ed efficiente per l'analisi dei lipidi.
- Migliorare la risoluzione nell'identificazione delle specie lipidiche.
- Aumentare la sensibilità nella quantificazione dei lipidi.
Metodi Utilizzati
- Raccolta e lavaggio delle cellule di lievito.
- Lisi delle cellule mediante perline di vetro in una miscela di cloroformio-metanolo.
- Separazione delle fasi lipidiche utilizzando cloroformio e acqua.
- Preparazione dei campioni lipidici per l'analisi mediante spettrometria di massa.
Risultati principali
- Il nuovo metodo consente l'identificazione di numerose specie lipidiche.
- Presenta una sensibilità superiore rispetto alle tecniche esistenti.
- La velocità di analisi è notevolmente migliorata.
Conclusioni
- Questo metodo rappresenta un notevole progresso nell'ambito della lipidomica.
- Può essere applicato a diverse aree di ricerca che coinvolgono l'analisi dei lipidi.
- Studi futuri potrebbero estenderne l'applicazione ad altri organismi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La lipidomica quantitativa mediante spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray (ESI/MS) consente un profilo rapido e ad alta sensibilità dei lipidomi del lievito, supportando la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi nella fase iniziale della scoperta. Questo flusso di lavoro accelera l'identificazione e la quantificazione dei lipidi, fornendo dati solidi per l'analisi dei percorsi metabolici e studi funzionali. L'approccio è direttamente rilevante per i team biofarmaceutici che cercano analisi lipidomiche scalabili e riproducibili per informare le decisioni nella fase di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi completa delle specie lipidiche per chiarire i percorsi metabolici.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli legati ai lipidi in modelli di lievito geneticamente modificabili.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico quantificando le variazioni lipidiche in diverse condizioni.
- Fornisce dati quantitativi per guidare le decisioni di selezione dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una quantificazione dei lipidi validata e riproducibile, adatta alla standardizzazione dei saggi.
- Riduce il tempo di preparazione del campione eliminando i passaggi di separazione cromatografica.
- Consente la pronta esecuzione di schermature ad alto rendimento grazie ad analisi rapide dei campioni.
- Permette confronti affidabili degli effetti dei composti sui profili lipidici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea agli studi lipidomici rilevanti per le malattie consentendo l'analisi dei lipidi specifica per organelli.
- Fornisce continuità dai risultati ottenuti nel modello di lievito ai sistemi eucariotici superiori.
- Supporta un avanzamento proporzionato al rischio quantificando i biomarcatori lipidici.
- Migliora la fiducia predittiva nella ricerca traslazionale di biologia lipidica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di lipidomica con spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospruzzo (ESI/MS) è adatto dalla fase iniziale della scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti, supportando sia approcci basati su ipotesi sia flussi di lavoro di screening.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi metabolici mediante profilazione quantitativa dei lipidi.
- Screening: Fornisce misurazioni dei lipidi pronte per saggi e riproducibili per la valutazione di composti.
- Analisi: Genera output quantitativi normalizzati per confronti statistici robusti.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica quando si estendono i risultati oltre il lievito.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma flessibile e scalabile adattabile a diverse esigenze di ricerca lipidomica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella biologia dei lipidi.
- Valore operativo: Ottimizza i flussi di lavoro con un'elaborazione e un'analisi rapida e standardizzata dei campioni.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del processo decisionale e riduce i rischi biologici in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e l'avanzamento di programmi mirati ai lipidi, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in spettrometria di massa e protocolli di estrazione dei lipidi.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per spettrometria di massa ad alta risoluzione e a software analitici.
- Richiede una rigorosa standardizzazione della manipolazione dei campioni per garantire la riproducibilità.
- È adattabile ad altri sistemi modello mediante ottimizzazione del protocollo.
- È necessario evitare l'uso di materiali in plastica per prevenire interferenze nel segnale di fondo.
