Name: La preparazione e la cultura di espianti Lens Rat epiteliali per lo Studio differenziazione terminale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Impara a coltivare espianti epiteliali del cristallino di ratti neonati per studiare la differenziazione terminale indotta da FGF-2. Questo metodo consente analisi di espressione genica e localizzazione proteica.

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La preparazione di espianti lente epiteliale è stato adattato dai metodi origine nel laboratorio del Dr. John McAvoy 9. Questo lavoro è finanziato dal National Eye Institute, Research Program Intramural Z01-EY000238-22

Parte 1: La rimozione di lenti Materiali e reagenti: <ol><li> Micro-dissezione forbici, curvo, consigli smussato, (come as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD), micro-dissezione pinzette, punta ricurva (come Roboz # RS5137). </li><li> Mezzo di sospensione: Medium 199 contenente 0,1% di albumina sierica bovina, 100 unità / ml di penicillina, streptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml di amfotericina B. I reagenti sono disponibili da Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Euthanize ratti neonati (di età compresa tra 2-4 giorni) in conformità alle linee guida fornite dal National Institutes of Health, Bethesda, MD. </li><li> Rimuovere le palpebre con le forbici chirurgiche. Premere delicatamente con le pinzette ricurve ai lati opposti della cavità oculare per costringere l&#39;occhio a rigonfiamento verso l&#39;esterno. Fai una piccola incisione nella parte posteriore dell&#39;occhio con le forbici. Premendo con le pinzette contro il lato dell&#39;occhio opposto l&#39;incisione, l&#39;obiettivo e una piccola quantità di corpo vitreo allegati possono poi essere costretto attraverso la rottura, permettendo l&#39;obiettivo di essere prelevati con una pinzetta curva. Si deve prestare attenzione a non rompere la capsula del cristallino. </li><li> Utilizzare le pinzette ricurve per trasferire le lenti per un piatto 60 millimetri di plastica coltura di tessuti contenenti 5 ml caldo, medio sterile sospensione. </li></ol> Parte 2: Microdissezione di espianti Materiali e reagenti: <ol><li> Micro pinzette dissezione, 0,1 punte mm, (come Roboz RS-4976). Noi usiamo lega Dumostar a causa della flessibilità della punta, ma altre leghe di acciaio sono anche accettabili. Pinzetta con punte sottili di 0,1 mm non sono raccomandati, in quanto tendono a rompere o piegare durante questa procedura. </li><li> Sospensione medio (vedere la Parte 1) </li><li> Senza supplementi Ham F12 medio o medio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procedimento: <ol><li> Le seguenti operazioni devono essere eseguite in un ambiente pulito, privo di correnti d&#39;ambiente utilizzando strumenti sterili dissezione e medie sterile. </li><li> Utilizzando un microscopio stereo-dissezione, pulire le lenti di qualsiasi tessuto aderendo con le pinzette 0,1 mm punta e di trasferirli in un secondo piatto 60 millimetri cultura medio sterile contenente 5 ml di sospensione (questo modo è possibile ridurre la contaminazione). Con le pinzette, trasferire il numero desiderato di lenti per un piatto cultura 35 millimetri contenente 5 ml sterile, senza supplementi di media. (Spesso usiamo Ham F12 (Invitrogen) per questo passo, perché la concentrazione di colorante inferiore rende dissezione più facile, tuttavia, Medium 199 è anche accettabile Nessun antibiotici o altre aggiunte sono necessari in questa fase..) Come ben 12 espianti possono essere effettuate al centro di un piatto di queste dimensioni. Tuttavia, un piatto di 35 mm dovrebbe essere utilizzato anche se meno espianti verranno, perché gli strumenti di dissezione non possono essere manipolati facilmente in un piatto più piccolo. Trasferire il piatto contenente le lenti rimanenti per un tessuto cultura incubatore a 37 ° C fino a quando non sono necessari. </li><li> Identificare il lato posteriore del cristallino. Ci sono molti modi per riconoscere questo: 1) Il posteriore è più rotondo rispetto alle anteriori, che è leggermente appiattita, 2) le lenti a forma di ratto neonato cataratta freddo come si raffreddano a temperatura ambiente durante la dissezione. Se la cataratta freddo non ha completamente riempito la lente, il lato posteriore è il lato più lontano dalla regione opaca. Se l&#39;opacità ha riempito la lente, il riscaldamento il piatto a 37 ° C per qualche minuto lo retromarcia. Il lato posteriore può essere identificato come le riforme cataratta sul raffreddamento. 3) Le vestigia della tunica lentis vasculosa possono essere visibili sul lato posteriore. 4) La sutura posteriore può essere visibile sul lato posteriore. Identificare il lato posteriore correttamente è fondamentale, poiché è qui che la capsula sarà aperto. Aprendo la lente sulla parte anteriore si strappa l&#39;epitelio. </li><li> Una volta che il lato posteriore è stato identificato, si volta verso l&#39;alto e afferrare la lente le pinzette sinistra (per un destrorso lavoratore). Poi un pizzico della capsula posteriore con la pinzetta diritto di produrre una piccola piega. </li><li> Mentre si tiene la capsula posteriore con le pinze a destra, afferrare la piega della capsula con le pinze sinistra e tirate le due paia di pinzette in direzioni opposte per fare un piccolo strappo nella capsula. </li><li> Mentre afferrare il bordo della capsula retrattile con le pinze, tirarlo verso il basso, prima da una parte, poi dall&#39;altra, premendo in plastica del piatto con la pinzetta. Ripetere questa operazione diverse volte, spostando tutto il equatore della lente, fino a quando la capsula è saldamente attaccato alla piastra in molti punti. Tenendo la capsula in posizione con le pinzette sinistra, agitare delicatamente la massa di fibre con la pinzetta diritto di rompere l&#39;attaccamento tra le cellule delle fibre e le cellule epiteliali all&#39;equatore lente. Quindi spingere la massa di fibre di distanza, rotolare fuori della capsula / epitelio, che rimane attaccato al fondo dellapiatto. Continuare questo processo con tutti gli obiettivi nel piatto. Rimuovere e gettare le masse fibra (o salvarli congelati come fonte di proteine ​​lente per altri studi). </li></ol> Parte 3: Microdissezione e la cultura di espianti centrale Materiali e reagenti: <ol><li> Sterili monouso bisturi, lama # 15, (Surgical Co. Cincinnati Cincinnati, OH) </li><li> Fosfato sterile salina tamponata con calcio e magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Terreno di coltura: media Sospensione contenente 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO). </li></ol> Procedimento: <ol><li> Usando un bisturi sterile, tagliare via l&#39;epitelio periferici (PE), che contiene le cellule nelle prime fasi della differenziazione (Figura 1A), lasciando una piazza centrale di circa 2,0 millimetri di lato, composto da centrale, cellule epiteliali solo (CE) (Figura 1B). </li><li> Trasferire il piatto contenente il espianti centrale di un armadio biosicurezza. Lavare 3 volte con PBS sterile contenente calcio e magnesio e una volta con 1 ml di fresco, equilibrato (37 ° C, 5% CO 2) mezzo di sospensione. Questi lavaggi ridurre notevolmente la probabilità di contaminazione. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno di coltura per indurre la differenziazione 1, e posizionare il espianti in un umidificata, colture di tessuti incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. Periodi di cultura può essere il più breve di poche ore o di estendere fino a due o tre settimane, a seconda del parametro oggetto di studio. Medio dovrebbe essere cambiato ogni due o tre giorni. </li></ol> Parte 4: raccolta di espianti per l&#39;analisi di eventi associati con differenziazione 1. Espianti di raccolta per l&#39;analisi di proteine ​​o RNA Materiali: <ol><li> Pinzette Microdissecting </li><li> SDS Lysis Buffer o RNA dopo </li></ol> Procedimento: <ol><li> Al termine del periodo di incubazione, rimuovere il terreno di coltura. </li><li> Utilizzando il microscopio stereo-dissezione, allentare leggermente i bordi di ogni espianto. </li><li> Sollevare ogni espianto con le pinzette e trasferirlo in una provetta contenente circa tampone 100μl lisi SDS (per l&#39;analisi delle proteine) o RNA-successivo (per l&#39;analisi del RNA). Agitare la punta delle pinzette nella soluzione per garantire che l&#39;espianto non si attacca alle pinzette. </li></ol> 2. Espianti di raccolta per immunofluorescenza Materiali e reagenti: <ol><li> Tampone fosfato di calcio e magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampone fosfato (senza calcio e magnesio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> 4% paraformaldeide (Bioproducts Boston, Worcester, MA) </li><li> Pinzette Microdissecting </li><li> Idrofobo pennarello </li><li> Vetrini per microscopio </li><li> 0,25% Triton X-100 in tampone fosfato salino. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Sciacquare espianti brevemente in PBS contenente calcio e magnesio. </li><li> Fissare i tessuti con l&#39;aggiunta di 4% paraformaldeide per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Togliere il fissativo e sostituire con tampone fosfato. Espianti fisso diventare un po &#39;rigida, permettendo loro di essere sollevato e trasferito alle diapositive di vetro per immunocolorazione. </li><li> Mettere una piccola goccia di PBS (senza calcio e magnesio) sulla diapositiva per posizionare il tessuto e prevenire il curling. Utilizzando le pinzette microdissecting, sollevare l&#39;espianto e inserirlo nel menu della diapositiva. Senza toccare l&#39;espianto, rimuovere con attenzione il liquido con uno stoppino di carta per appiattire l&#39;espianto sul vetro e lasciare asciugare il tessuto in aria a temperatura ambiente per 3 a 5 minuti. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 A. L&#39;epitelio periferico esprime differenziazione specifiche proteine. L&#39;espianto è stato mostrato immunostained per N-caderina subito dopo microdissezione. Espressione è visto in una banda di cellule nell&#39;epitelio periferici, indicando che le cellule in questa regione hanno cominciato a differenziarsi. B. L&#39;epitelio periferica può essere tagliata fuori per rimuovere le cellule che esprimono N-caderina e altre differenziazione specifiche proteine. L&#39;anello rosso rappresenta l&#39;ubicazione delle cellule che esprimono N-caderina, mentre la piccola piazza delineato in grigio rappresenta il quadrante dell&#39;epitelio mostrato nel pannello di 1A. L&#39;epitelio periferica può essere rimossa da quattro tagli di bisturi, lasciando una piazza centrale che contiene solo le celle che non hanno ancora cominciato a differenziarsi.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

L&#39;obiettivo del sistema di ratto espianto è stato usato con successo da una serie di laboratori per studiare differenziazione terminale delle cellule epiteliali alle fibre lente lente 21,3,4,5. Se esposto a FGF-2 a 100ng/ml il espianti inizierà a mostrare i cambiamenti nella segnalazione in pochi minuti 6, con i cambiamenti nella morfologia e l&#39;espressione genica che appaiono in sequenza nell&#39;arco di diversi giorni 3,4,5. Le culture rimanere vitali per 2-3 settimane se si ha cura di evitare contaminazioni. Il espianti centrale descritte in questo protocollo sono particolarmente utili per lo studio della sequenza di eventi associati con la differenziazione, in quanto contengono pochi se le cellule che esprimono marcatori di differenziazione prima di FGF-2 si aggiunge 1,5. Le cellule si differenziano in modo sincrono, come una coorte, il che rende possibile seguire l&#39;andamento temporale di segnalazione e di eventi trascrizionali associati differenziazione. Espianti coltura per periodi di tempo diversi quindi fornisce precise informazioni temporali sugli eventi sequenza. Inibitori specifici possono essere aggiunti al mezzo di coltura per identificare vie di segnalazione rilevanti. Espianti possono essere utilizzati per analizzare l&#39;espressione proteica mediante elettroforesi su gel SDS e immunoblotting o per analizzare l&#39;espressione di mRNA specifico mediante RT-PCR. Proteine ​​gamma rendimenti 20-50 mg / espianto e la resa è di circa RNA 200-600 ng / espianto, a seconda della lunghezza del periodo di cultura. Siamo in generale che per ogni piatto 5-6 espianti fornirà sufficienti proteine ​​o RNA per analisi diverse. RNA da espianti possono essere utilizzati anche per la preparazione del DNA per valutare l&#39;espressione genica mediante l&#39;analisi microarray, in grado di identificare nuovi geni che potrebbero essere cruciali per la differenziazione. Espianti possono anche essere transfettate. Anche se l&#39;efficienza di trasfezione è generalmente bassa, è sufficiente per il saggio geni reporter 4, 7, 8. Microscopia a immunofluorescenza del espianti fornisce un utile complemento ai metodi biochimici per determinare la posizione subcellulare di proteine ​​di interesse. Così, la preparazione e la cultura di espianti lente ratto fornisce un sistema potente per lo studio lente differenziazione terminale nei mammiferi, che possono integrare in tecniche in vivo, come la generazione di topi transgenici e knock-out.

la preparazione e la cultura di espianti lens rat epiteliali per lo studio differenziazione terminale

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

La superficie anteriore della lente oculare è coperto da un monostrato di cellule epiteliali, che proliferano in una zona anulare alla base del corpo ciliare. A seguito di divisione, queste cellule migrano posteriormente, dove la diffusione dalla retina FGF induce a differenziarsi in una serie di cellule allungate posteriore in fibra ottica, che compongono la maggior parte della lente. Differenziazione delle cellule epiteliali in fibre lente lente può essere indotta in vitro da espianti coltura della regione centrale dell&#39;epitelio anteriore in presenza di FGF-2. Espianti sono preparati da lenti di ratti neonati, rimuovendo la lente dall&#39;occhio e di cogliere capsula del cristallino sul lato posteriore con una pinzetta dissezione. La capsula posteriore è poi delicatamente squarciato e premuto sul fondo di un piatto di plastica coltura di tessuti. Le regioni periferiche del espianto vengono rimosse con un bisturi e la zona centrale è poi coltivate in presenza di 100ng/ml FGF-2 per tutto il tempo 2-3 settimane, a seconda dei parametri da studiare. Dato che le cellule epiteliali in espianti in coltura differenziare in sincronia approssimativa per un periodo di giorni o settimane, la durata della segnalazione e l&#39;espressione genica può essere determinata utilizzando tecniche molecolari, biochimiche e farmacologiche. Microscopia a immunofluorescenza è un potente coadiuvante a questi metodi, come dimostra la localizzazione subcellulare di proteine ​​di interesse e può rivelare le conseguenze fisiologiche di manipolazioni sperimentali delle vie di segnalazione.

Espianti della regione centrale della lente epiteli ratto differenziare in modo sincrono quando coltivate in presenza di FGF-2. Microscopia a immunofluorescenza della presenza di tali culture possono fornisce informazioni romanzo sulla espressione genica e di segnalazione eventi associati a differenziazione terminale.

La preparazione e la cultura di espianti Lens Rat epiteliali per lo Studio differenziazione terminale

La superficie anteriore del cristallino è ricoperta da un monostrato di cellule epiteliali, che proliferano in una zona anulare sottostante il corpo ciliare. ...

Questa procedura inizia rimuovendo le lenti da ratti di due o quattro giorni di età e pulendole da qualsiasi tessuto aderente. Viene identificato il lato posteriore della lente e viene praticato un piccolo strappo nella capsula. La capsula viene quindi staccata verso il basso e premuta sul fondo della piastra.Questo processo viene ripetuto lungo l'intera lente. La massa delle fibre lenticolari viene rimossa oscillandola lateralmente. L'epitelio periferico viene asportato e quindi le strutture vengono coltivate.Infine, vengono trasferiti in una provetta per l'analisi biochimica o su un vetrino per la microscopia. Ciao, sono Peggy Lanka nel laboratorio di Biologia Molecolare e dello Sviluppo presso l'Istituto Nazionale per la Salute Oculare del NIH. Ciao, sono Al Tu, anch'io del Laboratorio di Biologia Molecolare e dello Sviluppo dell'Istituto Nazionale per la Salute Oculare.Sono Chung Ga, anch'io del medesimo laboratorio del NEI. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'espianto e la coltura di epitelio lentico da ratti neonati. Vi mostreremo come rimuovere la regione periferica dell'epitelio, che contiene cellule in stadi iniziali di differenziazione.Quindi vi mostreremo come indurre le rimanenti cellule epiteliali centrali del cristallino a differenziarsi formando le fibre del cristallino esponendole a FGF. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i tempi degli eventi coinvolti nel differenziamento terminale. Raccogliamo l'EXPLAN in diversi momenti dopo l'aggiunta di FGF al mezzo di coltura.Successivamente analizziamo l'espressione proteica mediante western blotting, l'espressione dell'RNA mediante R-T-P-C-R o microarray e immunostainiamo l'espianto per determinare la localizzazione subcellulare delle proteine di interesse. Cominciamo quindi spostando i cristallini da ratti neonati. Per iniziare, utilizzare forbici da microdissezione per rimuovere i cristallini dagli occhi di ratti di 2-4 giorni di età sacrificati, praticando un piccolo incisione posteriore e premendo sul lato opposto.Trasferire le lenti in una piastra di coltura in plastica da 60 millimetri contenente cinque millilitri di mezzo di sospensione sterile tiepido, utilizzando pinzette con punta da 0,1 millimetri. Rimuovere eventuali tessuti aderenti dalle lenti e trasferirle in una seconda piastra di coltura da 60 millimetri contenente cinque millilitri di mezzo di sospensione sterile. Questo aiuta a ridurre la contaminazione tramite le pinzette.Trasferire il numero desiderato di lenti in una piastra di coltura da 35 millimetri contenente due millilitri di mezzo sterile non supplementato. Al centro di una piastra di queste dimensioni è possibile preparare fino a 12 x explan. Le lenti in eccesso possono essere conservate nella seconda piastra da 60 millimetri preparata in precedenza e collocate in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius fino a un'ora prima dell'uso per la preparazione di X explan.Ora identificate il lato posteriore del cristallino. Questi due, posso dire, sono posizionati con il lato anteriore verso l'alto. Li ruoterò lateralmente in modo che possiate guardare lungo il loro asse e vedrete la cataratta fredda, che è un'area opaca al centro.Il lato più lontano dal centro opaco è il lato posteriore. Quindi lo giro sulla faccia posteriore. Sul lato posteriore, si possono anche osservare queste striature, che sono i residui di questa tenal vasculite.È un modello di vasi sanguigni attorno alla periferia del cristallino che contraddistingue anche il lato posteriore. Corretto. L'identificazione è fondamentale poiché è in questo punto che verrà aperta la capsula. Aprire il cristallino sul lato anteriore strapperà l'epitelio.Esistono diversi modi per identificare il lato posteriore. Innanzitutto, è più arrotondato rispetto al lato anteriore, che è leggermente appiattito. In secondo luogo, le lenti di ratto neonato formano cataratte da freddo quando si raffreddano alla temperatura ambiente durante la dissezione.Se la cataratta fredda non ha ancora completamente riempito il cristallino, il lato posteriore è quello più lontano dalla regione opaca. Se l'opacità ha riempito il cristallino, riscaldare la piastra a 37 gradi Celsius per alcuni minuti ne determinerà la reversibilità. Il lato posteriore può essere identificato in quanto la cataratta si riforma durante il raffreddamento.Potrebbero essere visibili terzi residui dei VASIs della tunica sulla faccia posteriore. Infine, la sutura posteriore potrebbe essere visibile sul lato posteriore. Una volta identificato il lato posteriore, posizionarlo verso l'alto e sostenere la lente con la pinzetta sinistra.Poi pizzicare la capsula posteriore con la pinzetta destra per creare una piccola piega; tenendo ferma la capsula posteriore con la pinzetta destra, afferrare la piega della capsula con la pinzetta sinistra e tirare le due pinzette in direzioni opposte per produrre un piccolo strappo nella capsula. Mentre si tiene il bordo della capsula retratta con la pinzetta, tirarla prima verso il basso da un lato, quindi dall'altro, premendola contro la superficie in plastica della piastra con la pinzetta. Ripetere questa operazione più volte, spostandosi lungo tutta la circonferenza della lente finché la capsula non sarà saldamente fissata alla piastra. In diversi punti, tenere ferma la capsula con la pinzetta sinistra e muovere delicatamente avanti e indietro la massa delle fibre con la pinzetta destra per rompere il collegamento tra le cellule fibrillari e le cellule epiteliali all'equatore della lente.Ora tirare delicatamente la massa di fibre, arrotolandola via dalla capsula, che rimane attaccata al fondo della piastra. Ripetere questo procedimento con tutte le lenti presenti nella piastra. Le masse di fibre possono essere eliminate oppure congelate e conservate come fonte di proteine lenticolari per altri studi, con microdissezione di espiantri epiteliali interi completi.Esaminiamo la dissezione microscopica e la coltura dell'esplanato centrale. Utilizzando un bisturi sterile, rimuovere l'epitelio periferico, che contiene cellule nelle fasi iniziali di differenziazione. Lasciare un quadrato centrale, di circa due millimetri per lato, costituito da cellule epiteliali centrali.Trasferire solo la piastra contenente l'espianto centrale in una cappa a sicurezza biologica. Lavare le melanzane tre volte con PBS sterile e una volta con un millilitro di mezzo di sospensione fresco ed equilibrato. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo di coltura per indurre la differenziazione e posizionare l'espianto in un incubatore per colture tessutali umidificato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.Il periodo di coltura può durare da poche ore fino a due o tre settimane, a seconda del parametro in esame. Il mezzo deve essere sostituito ogni due o tre giorni con microdissezione e Turing completo. Iniziamo a raccogliere gli espianti per l'analisi.Al termine del periodo di incubazione, rimuovere il mezzo di coltura utilizzando pinzette da dissezione. Allentare delicatamente i bordi di ogni espianto. Afferrare ogni espianto con le pinzette e trasferirlo in un tubo contenente circa 100 microlitri di buffer di lisi SDS per l'analisi delle proteine o RNA later per l'analisi dell'RNA, agitando la punta delle pinzette nella soluzione per assicurarsi che l'espianto non rimanga attaccato alle pinzette.Gli explant sono ora pronti per l'analisi di proteine o RNA; gli explant possono anche essere analizzati mediante immunofluorescenza. Per iniziare, risciacquare brevemente gli explant in PBS. Fissare i tessuti aggiungendo paraformaldeide al 4% per 30 minuti.A temperatura ambiente, rimuovere il fissativo e sostituirlo con PBS. L'explants diventa leggermente rigido, consentendo di essere sollevato e trasferito su vetrini per l'immunomarcatura. Posizionare una piccola goccia di PBS senza calcio e magnesio sul vetrino per aiutare a posizionare il tessuto e prevenire l'arrotolamento. Utilizzando pinzette da dissezione microscopica, sollevare l'explants e inserirlo nella goccia sul vetrino senza toccarlo; utilizzare con attenzione una striscia di carta per rimuovere il liquido e appiattire l'explants sul vetrino.Lasciare asciugare il tessuto all'aria a temperatura ambiente per tre-cinque minuti. Gli innesti sono ora pronti per l'analisi di immunofluorescenza. Qui è mostrato un esempio di un espianante epiteliale intero ottenuto mediante microdissezione che è stato sottoposto a immunomarcatura per NCO, un marcatore adesivo per cellule.Nelle fasi iniziali della differenziazione, solo le cellule della regione periferica dell'epitelio risultano positivamente colorate per questa proteina in fase di taglio. L'epitelio periferico, come descritto in questo protocollo, lascia un espianto centrale che contiene poche, se non nessuna, cellula che esprime e risulta coerente. Questo è dimostrato mediante analisi di western blotting dei tessuti epiteliali centrale e periferico; il western blotting per GA.DH è stato utilizzato per confermare che i campioni proteici fossero stati caricati in quantità equimolari.Il momento degli eventi associati alla differenziazione può essere determinato coltivando l'esplanato centrale per diversi periodi di tempo. Gli esplanati centrali sono stati coltivati per 2, 5, 24 e 48 ore in mezzo con o senza 100 nanogrammi per millilitro di FGF. Gli esplanati X sono stati raccolti ai tempi indicati e trasferiti nel buffer campione SDS per l'analisi mediante western blotting.I risultati mostrano che l'espressione del proteina ricombinante viene indotta dopo 24-48 ore in coltura. Il Western blot per GA DH dimostra che i campioni proteici sono stati caricati in quantità equimolari.Immunomarcatura di espianți centrali coltivati per quattro giorni in assenza o in presenza di 100 nanogrammi per millilitro di FGF, che mostra un forte aumento dell'immunofluorescenza per la N-caderina negli espianți esposti al FGF. L'immunofluorescenza mostra inoltre la localizzazione subcellulare della N-caderina ai margini tra cellula e cellula.Abbiamo appena mostrato come preparare in coltura epiteliali del cristallino per lo studio della differenziazione. Il vantaggio principale di questo sistema è che le cellule si differenziano in modo sincrono. Ciò rende possibile determinare la sequenza degli eventi.Inoltre, possiamo aggiungere al mezzo fattori di crescita o inibitori specifici per attivare o bloccare particolari vie di segnalazione. Durante questa procedura, è importante ricordare di prevenire la contaminazione effettuando la dissezione e utilizzando mezzi sterili in un ambiente pulito e osservando attentamente l'espianto prima della coltivazione. Questo è tutto.Grazie per aver guardato. In bocca al lupo per il vostro esperimento. Arrivederci. Ciao.

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Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

L'angiogenesi coinvolge interazioni multi-cellula e multi-sistema che devono essere studiate in un ambiente fisiologicamente rilevante. L'obiettivo di questo studio è dimostrare la capacità del modello di coltura del mesentere di ratto di effettuare confronti time-lapse di reti microvascolari intatte durante l'angiogenesi.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks

Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l'innesto in modelli animali.

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

Questo studio mira a sviluppare un nuovo modello di coltura retinica organotipica umana (HORC) che impedisce di compromettere l'integrità retinica durante la manipolazione dell'espianto. Ciò si ottiene coltivando la retina con il vitreo sovrastante e il pigmento retinico sottostante epitelio-coroide (RPE-coroide) e sclera.

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Questo protocollo presenta e descrive i passaggi per l'isolamento, la dissezione, la coltivazione e la colorazione degli espianti retinici ottenuti da un topo adulto. Questo metodo è utile come modello ex vivo per lo studio di diverse malattie neurovascolari retiniche come la retinopatia diabetica.

Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l'isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.

Ottimizzazione della coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino di topo: una guida completa alla tripsinizzazione

Abbiamo sviluppato un modello di ratto di grave infiammazione corneale attraverso il curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali. Lo studio ha valutato i modelli di infiammazione corneale, la proliferazione epiteliale e i cambiamenti nelle cellule staminali limbari in condizioni infiammatorie.

Definizione di un modello di grave infiammazione corneale nei ratti basato sul curettage dell'epitelio corneale combinato con suture corneali

Questo protocollo descrive in dettaglio la separazione dell'epitelio del cristallino oculare di topo e della massa cellulare delle fibre, seguita dall'isolamento dell'RNA e dall'analisi qPCR. Questo metodo consente di separare i compartimenti delle cellule del cristallino per un'analisi più dettagliata del trascrittoma e dei processi biologici nelle cellule epiteliali rispetto alle cellule di fibre differenziate.

Isolamento dell'RNA dall'epitelio del cristallino oculare di topo e dalle masse di massa delle cellule fibrose

Impara a coltivare espianti epiteliali del cristallino di ratti neonati per studiare la differenziazione terminale indotta da FGF-2. Questo metodo consente analisi di espressione genica e localizzazione proteica.

La preparazione e la cultura di espianti Lens Rat epiteliali per lo Studio differenziazione terminale

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