Name: Cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 44 s
Description: Impara a isolare e coltivare neuroprecursori dalla corteccia cerebrale di embrioni di topo. Questo metodo riproducibile utilizza laminina per l'adesione cellulare e supporta studi di neuroscienza e biologia dello sviluppo.

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<ol><li> Precursori del mouse neurali (NPC) sono stati isolati da E12.5 corteccia embrionale. </li><li> Strati della pelle e mesenchimali sono state rimosse dalla sezionati vescicole telencefaliche. </li><li> Le vescicole sono state incubate a 0,05% di tripsina con EDTA 0,02% e lo 0,2% di BSA in HBSS per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Tripsinizzazione è stato fermato da un uguale volume di 1 inibitore della soia mg / ml di tripsina (Sigma # T6522) a HBSS. </li><li> Tessuto digerisce erano dissociate utilizzando varie tornate di triturazione con il fuoco lucidato pipette Pasteur. </li><li> Le cellule sono state lavate una volta con 0,2% di BSA in HBSS e placcato a 50.000 cellule / ml su laminina rivestite coprioggetto in media con 20 ng / ml di EGF, 10 ng / ml FGF2 (R &amp; D Systems o Peprotech), e 2 ug / eparina ml ( Sigma). </li></ol>

<ol><li>Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+roles+of+CNS+dorsal+midline+cells+in+choroid+plexus+epithelial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation.</a> Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).</li>
<li>Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).</li>
</ol>

Grandi progressi nella nostra comprensione dello sviluppo del SNC e biologia delle cellule staminali è stato reso possibile dalla nostra capacità di raccogliere, isolare e cultura cellule embrionali staminali neurali. Questo video dimostra la dissezione di E12.5 il mouse corteccia cerebrale e la conseguente disgregazione e la coltura di cellule embrionali staminali neurali. Molti altri metodi simili sono stati impiegati con successo da altri ricercatori.

<table><tbody><tr><td>Forbici dritte per iris</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Forbici medie</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici micro</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinze ricurve</td><td>Strumento</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primaria colture di cellule staminali neurali sono utili per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo del sistema nervoso centrale. Ricerca sulle cellule staminali aumenteranno la nostra comprensione del sistema nervoso e può consentire di sviluppare terapie per malattie attualmente incurabili cerebrali e lesioni. Inoltre, le cellule staminali devono essere utilizzati per la ricerca sulle cellule staminali finalizzate allo studio dettagliato dei meccanismi di differenziamento neurale e transdifferenziazione ed i segnali genetici ed ambientali che dirigono la specializzazione delle cellule in particolari tipi di cellule. Questo video mostra una tecnica utilizzata per disaggregare le cellule embrionali giorni dal 12,5 proencefalo del mouse dorsale. La procedura di dissezione comprende la raccolta E12.5 embrioni di topo dall&#39;utero, eliminando la &quot;pelle&quot; con sottile dissettore e infine isolare pezzi di corteccia cerebrale. Dopo la dissezione, il tessuto viene digerito e meccanicamente dissociato. Le cellule risospese dissociate vengono poi coltivate in &quot;cellule staminali&quot; media che favorisce la crescita delle cellule staminali neurali.

Questo video descrive il metodo utilizzato per l&#39;isolamento di neuroprecursors dalla corteccia sviluppo embrionale dei topi. Il procedimento per eliminare gli embrioni dall&#39;utero, sezionare il tessuto corticale, e digerire la corteccia cerebrale isolato viene mostrato.

Cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse

Le colture primarie di cellule staminali neurali sono utili per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo del sistema nervoso centrale. La ricerca sulle cellule staminali aumenterà...

Questo è quindi il primo passaggio nell'isolamento, dissociazione e coltura delle cellule precursori neurali. Per prima cosa, provvederò a rivestire una piastra a 24 pozzetti. Non è trattata per la coltura dei tessuti.Lo rivestirò con laminina in modo che le cellule aderiscano. Quindi, per prima cosa lo rivestirò con una miscela di acqua e poli-D-lisina. Aggiungerò circa 450 microlitri per pozzetto.Quindi, ho appena rivestito metà della piastra, queste due file qui, con la soluzione di poli-D-lisina. E la lascerò in incubazione per cinque minuti a temperatura ambiente, sempre all'interno della cappa. È rimasta in incubazione per cinque minuti.Sto per rimuovere la soluzione di PDL utilizzando il vuoto qui. Azione della pompa a vuoto. Ora risciacquerò nuovamente le pozzette con acqua, circa 450 microlitri.Assolutamente nessun tempo di incubazione per il risciacquo con acqua. Procederò semplicemente ad aspirare l'acqua. Ora aggiungerò la soluzione per la laminazione.Il laminato viene sciolto nel mezzo EM a due microgrammi per millilitro. Aggiungerò quindi 450 microlitri della soluzione di laminato a ciascun campione; al momento sto ricoprendo la plastica. In alternativa, si possono ricoprire anche coprioggetti in queste pozzette.Incuberò le cellule a 37 °C in un incubatore per colture cellulari per almeno quattro ore. Ho due pinzette fini piegate ad un angolo di 45 gradi. Ho anche un paio di forbici fini, anch'esse piegate ad un angolo di 45 gradi.Un paio di pinze smussate per la dissezione iniziale dell'utero e un paio di forbici grandi per il taglio nella femmina. Va bene, questa è una femmina normale CD1. È incinta con embrioni al giorno 12 e mezzo di sviluppo embrionale.Ho già sacrificato l'animale utilizzando l'asfissia da CO2 e la dislocazione cervicale. Ora procederò a rimuovere l'utero e successivamente gli embrioni. Per prima cosa, devo disinfettare la zona dell'addome con etanolo al 70%.Con la mia pinza grande afferro l'addome nella metà inferiore, effettuo un taglio, appoggio gli strumenti e semplicemente strappo la pelle, esponendo nuovamente l'addome, afferrando nello stesso punto. Effettuo un altro taglio al centro e proseguo lateralmente, aprendo la femmina. Ora sto esponendo gli embrioni.Ecco il suo utero, gonfio di embrioni. Quindi effettuo il primo taglio appena sotto le ovaie, rimuovo il grasso lungo il percorso e tiro verso l'alto. Appoggio quel lato verso il basso e afferro soltanto tra un embrione e l'altro.Ovviamente, afferrare gli embrioni dalla sommità potrebbe danneggiare il tessuto. Ed è evidente. Hanno l'aspetto di un grappolo d'uva.Prendere tra gli acini, tagliando nuovamente al di sopra dell'ovario sull'altro lato e rimuovere il tessuto adiposo. L'incisione finale verrà eseguita qui al centro. Ancora una volta, sto rimuovendo il tessuto adiposo.C'è l'utero con gli embrioni. Il mio mezzo di dissezione è PBS con glucosio allo 0,6% e penicillina-streptomicina. Per prima cosa risciacquerò gli embrioni nel mezzo di dissezione, per rimuovere il sangue.Quindi la mia dissezione è pulita. Ora taglierò lungo il lato dell'utero opposto rispetto al lato del tessuto adiposo per esporre gli embrioni. Dov'è il tessuto adiposo?È sull'altro lato perché non è visibile. Quindi qui c'è un embrione esposto. Posso mostrarvi come appare al microscopio.Ecco come appare sotto la lente. Taglierò lungo questo lato dell'utero. Dal lato opposto, il grasso.Si vede il grasso qui, riesco a vedere chiaramente il tessuto adiposo. Quindi procederò a tagliare lungo tutta la parte superiore. E si può notare che gli embrioni usciranno man mano che proseguo lungo l'utero.Poco più a nord. Oh, eccone uno. Splendido. Stai tagliando lungo il lato opposto rispetto agli embrioni grassi che stanno appena uscendo.Sì, lo sono tutti. Ce ne sono alcuni qui a cui devi tornare indietro a volte e aprire qualcosa se te la sei persa. Quindi questa è la membrana amniotica oppure è il corion e il, questo è il corion.L'amnios è all'interno, è strettamente associato all'embrione. Vede, non riesce a vedere bene l'amnios da qui. Una volta estratto l'embrione, potrà notare che questi sono più piccoli e non li utilizzerò.Tuttavia, ora ci sono tutti gli embrioni esposti. Ora ho gli embrioni esposti qui. Rimuoverò gli strati dall'embrione e poi trasferirò l'embrione in una capsula pulita per la dissezione fine.Quindi c'è il primo strato. Una volta che l'ho rimosso, di solito cerco il cordone ombelicale. È un tessuto piuttosto resistente.E in realtà posso sollevare l'animale con il cordone ombelicale. È proprio lì. Puoi indicarlo?Sì, proprio lì. Veda il vaso rosso, quella specie di sacchetto. Sì. Quello è il cordone ombelicale, che si attacca all'addome; di solito allungo semplicemente la mano e lo afferro.Ecco fatto. Ora rimuoverò la pelle dalla testa dell'embrione. Ciò espone la corteccia cerebrale, da cui preleverò le cellule.Quindi, con la mano sinistra, trafiggo la parte posteriore dell'embrione per tenerlo proprio in questo modo. Lo sto tenendo contro il fondo della piastra. Con la mano destra, userò la pinzetta sotto l'occhio, sollevando sotto la pelle, trafiggendola e quindi staccandola.Ora ho un bordo che posso afferrare. Ok. Poi, con gli altri quattro passaggi, afferro il bordo opposto e stacco la pelle, e di solito il mesenchima sottostante viene via insieme. Ora potete vedere l'emisfero destro esposto a nord.Girerò l'embrione e cercherò un altro bordo a cui aggrapparmi. C'è un altro bordo della pelle. Giralo, continua a staccare.Ecco fatto. Esposizione della corteccia cerebrale. Ora procederò semplicemente a staccare la testa con una pinzata, il che mi permetterà di assumere una posizione migliore per rimuovere frammenti della corteccia cerebrale.Pertanto, pinzio semplicemente con la mia pinzetta, strofino con l'altra pinzetta al di sotto, tagliando proprio in quel punto. E questa è una vista dorsale. Qui potete vedere una vista dorsale del proencefalo, i due emisferi della corteccia cerebrale, il telencefalo e, più in basso, il mesencefalo.Ecco cosa serve per prelevare i frammenti destinati all'associazione con cellule staminali neurali. Ora afferrerò l'embrione con la pinzetta sinistra per tenerlo fermo in questo modo, in modo da avere una buona posizione e un angolo adeguato per asportare dei pezzi della corteccia.Ora, con le mie forbici fini, entro e recido semplicemente la corteccia cerebrale anteriore in questo modo. Creo un foro in modo da poter effettuare il taglio laterale ed eseguo un taglio vicino alla linea mediana dorsale, ma evito le cellule della linea mediana cercando di isolare i precursori neuronali o i neuro precursori presenti nella corteccia. Questo quindi è un frammento proveniente dalla corteccia cerebrale.E come puoi vedere, c'è un ispessimento qui sul lato destro. Questo in realtà è l'inizio dell'eminenza GIC laterale, che nel nostro preparato non vogliamo, poiché siamo interessati ai precursori della corteccia dorsale. Quindi procederò semplicemente a rimuoverlo.Le sto lasciando solo le cellule dalla corteccia dorsale. Ora passerò all'altro lato. Stesso metodo.È un po' più scomodo perché sono destro, ma di nuovo, effettuare il taglio anteriore, inserire le forbici nel foro. Tagliare lungo il lato dorsale, lato laterale. Questa volta cercherò di evitare il ganglio con evidenza maniacale.Ecco qui i due frammenti provenienti dagli emisferi della corteccia dorsale. Ora userò una punta per pipetta P1000 tagliata per trasferire le cortecce in un tubo conico da 15 ml contenente mezzo di dissezione, dove rimarranno mentre proseguo la dissezione del resto della nidiata. Ora aspirerò un frammento.Ora trasferisco le cortecce dalla piastra al tubo conico da 15 ml contenente il mezzo di dissezione, dove rimarranno mentre procedo con la dissezione del resto della nidiata. Ho completato la dissezione dell'intera nidiata e ora aspirerò il mezzo di dissezione in eccesso, lasciando una piccola quantità di liquido e le cortecce. A questo punto aggiungerò circa 500 microlitri di Trix e EDTA, ponendo il tubo in un bagnomaria a 37 gradi per 20 minuti.Dopo l'incubazione di 20 minuti, aggiungo 500 microlitri di inibitore del triptano della soia. Ora procederò a dissociare meccanicamente le cellule utilizzando una pipetta di Pasteur con il bordo levigato a fiamma e un foro molto stretto. Non voglio introdurre molte bolle d'aria, ma se ciò accade, va comunque bene.Si sale e si scende circa da cinque a dieci volte e le cellule dovrebbero disperdersi formando una nuvola. Ora centrifugerò le cellule a 1000 giri al minuto, a 25 gradi per un minuto. Dopo la centrifugazione, rimuoverò il liquido in eccesso mediante aspirazione, lasciando un piccolo pellet, appena visibile.Sembra uno striscio di SA di piccole dimensioni sul fondo di questa provetta conica. Credo che basti una piccola quantità di liquido, avendo molta cura di non aspirare il pellet. Ovviamente, ora sto aggiungendo la soluzione di lavaggio al pellet.Ok, un'altra centrifugazione a mille giri al minuto, a 25 gradi per un minuto. Ancora una volta, aspirerò il liquido in eccesso lasciando solo il pellet cellulare e una quantità molto ridotta di liquido dopo l'aspirazione. Aggiungerò il mio terreno di crescita desiderato con i fattori di crescita.Ovviamente specifico per l'esperimento di coltura, il volume che aggiungerò dipende dal numero di embrioni dissecati e dalla loro età. Di solito, per un'intera cucciolata di embrioni E12,5, si possono aggiungere fino a circa 700 microlitri. Per questo caso, aggiungerò circa 300 microlitri per concentrare un po' di più le mie cellule. Prendere la mia piastra rivestita con laminina dall'incubatore.Sono passate almeno quattro ore. Ora procederò ad aspirare il mezzo di laminazione. E adesso eseguirò un risciacquo con il mio mezzo di crescita.Sto eseguendo il risciacquo con circa 300 microlitri e provvederò ad aspirare e aggiungere 400 microlitri di terreno di crescita. Ho contato le mie cellule utilizzando un citometro Hema e intendo seminare circa 100.000 cellule per pozzetto in questa piastra a 24 pozzetti.Ogni esperimento richiede un numero diverso di cellule per pozzetto. Per il mio particolare saggio, 100.000 cellule hanno funzionato bene. Metterò le cellule nell'incubatore per colture cellulari, a 37 gradi e 5% di CO2, e le lascerò crescere per circa un giorno.Adereranno al laminato e si espanderanno dopo 24 ore. Aggiungerò i fattori di crescita desiderati per il mio saggio specifico.

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Qui mostriamo il nostro metodo per isolare il mouse epidermiche cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC). Tecnica prevede micro-dissezione follicoli baffi, isolando il rigonfiamento e placeing in colture di tessuti. EPI-NCSC iniziano a emigrare da espianti rigonfiamento sul substrato entro 3 - 4 giorni.

Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

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Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Isolamento di embrionale cresta neurale dal tubo neurale facilita l'uso...

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

Questo video mostra un protocollo dettagliato per isolare le pareti del ventricolo laterale dal cervello del topo adulto ed eseguire la dissociazione enzimatica del tessuto per ottenere singole cellule. Queste cellule sono poi sottoposte a specifiche condizioni di coltura che aumentano selettivamente la proliferazione delle cellule staminali neurali e ne promuovono la differenziazione in co-colture di oligodendrociti e astrociti.

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