Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Ciao, sono Hope Campbell, specialista di citometria a flusso presso l'Istituto di Ricerca sul Sangue del Blood Center of Wisconsin. Ciao, sono STR Baso, studente laureato nel laboratorio della dottoressa Bonnie Dieter. Sono anch'io presso l'Istituto di Ricerca sul Sangue del Blood Center of Wisconsin.

Oggi eseguiremo una procedura di isolamento delle cellule mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza. Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare la funzione delle popolazioni di linfociti e cellule mieloidi. Cominciamo.

In questa procedura, le cellule T B e CD4 verranno purificate da citociti di topo. Il numero iniziale di cellule bersaglio deve essere calcolato in base al numero di cellule necessarie e al tasso di recupero della macchina utilizzando questo metodo. Il tasso di recupero tipico per le cellule T B e CD4 è dell'85-90%. La popolazione iniziale di citociti SP è composta approssimativamente per il 60-70% da cellule B e per il 20-30% da cellule T.

Pertanto, se si parte da 100 volte 10 alla sesta cellule, sarà possibile recuperare da 50 a 60 milioni di cellule B e da 20 a 30 milioni di cellule T prima dell'inizio delle procedure. Le soluzioni e i reagenti necessari per il protocollo devono essere posti sul ghiaccio. Questi includono un buffer di marcatura costituito da soluzione salina tamponata al fosfato con siero fetale bovino al 3%, un buffer di sospensione costituito da 25 millimoli di HEPES preparati in soluzione salina equilibrata di Hank o HBSS contenente siero fetale bovino al 3%, una soluzione di hep B 25 millimolare preparata in siero fetale bovino, gli anticorpi per la marcatura e le perle per la compensazione.

Questo protocollo richiede inoltre le seguenti forniture e reagenti. Provette coniche da 15 millilitri, provette in polistirene o polipropilene da 12 per 75 millimetri. Deve essere preparato in anticipo anche un setaccio per cellule in nylon, il trien blu e un emocitometro, insieme alle provette per la raccolta del sorting, necessarie per eseguire questa procedura.

Aggiungere 300 microlitri della soluzione di FCS di he a provette per flusso oppure 1 millilitro della soluzione di HEPs FFC S a provette coniche da 15 millilitri. Queste devono essere poste sul ghiaccio fino all'inizio del processo di raccolta. Iniziare generando una sospensione di singole cellule della popolazione cellulare desiderata.

Se le cellule isolate con questa procedura verranno coltivate, l'intera preparazione cellulare deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare. Utilizzando una tecnica sterile, lavare le cellule una volta aggiungendo un buffer di marcatura freddo su ghiaccio e risospendere le cellule capovolgendo il tubo diverse volte.

Quindi centrifugare le cellule per sette-otto minuti a circa 250 ×g e 4 gradi Celsius. Le condizioni di lavaggio possono variare a seconda del tipo e della concentrazione delle cellule. Per i citi, lavare fino a 200 × 10⁶ cellule con 10 millilitri di buffer di marcatura.

Rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione, in modo che il pellet cellulare rimanga intatto. Successivamente, risospendere le cellule in tampone di marcatura freddo su ghiaccio a una concentrazione massima di 50 × 10⁶ per 100 µL. Risospendere il pellet cellulare agitando leggermente il tubo o vortexando delicatamente.

Quindi trasferire da 0,25 a 1 × 10⁶ cellule in un nuovo tubo da flusso in polistirene o polipropilene da 12 × 75 millimetri su ghiaccio. Mettere da parte questo campione per utilizzarlo successivamente come controllo non colorato. Al primo tubo, aggiungere gli anticorpi primari alla sospensione cellulare per raggiungere la concentrazione finale desiderata. In questo caso, vengono utilizzati anticorpi anti-CD20 coniugati con PE Texas Red per colorare le cellule B, mentre per colorare le cellule T si usano anticorpi anti-TCRβ coniugati con ZI e/o anticorpi anti-CD4 coniugati con 700. Mescolare agitando leggermente il fondo del tubo o con un movimento delicato.

Agitare con vortex, quindi mettere le cellule sul ghiaccio e incubare al buio per 20-30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule marcate mediante risospensione in 10 millilitri di tampone freddo di sospensione, quindi centrifugare come in precedenza, dopo accurata rimozione del soprannatante. Ripetere questo passaggio per lavare le cellule una seconda volta.

Infine, risospendere le cellule nel buffer di sospensione freddo di ghiaccio. Se gli anticorpi primari non sono direttamente coniugati a un fluorocromo, aggiungere anticorpi secondari marcati o streptavidina coniugata alla sospensione cellulare e, nuovamente, incubare le cellule sul ghiaccio al buio per 20-30 minuti dopo l'incubazione. Lavare le cellule due volte con buffer di sospensione freddo di ghiaccio.

Dopo aver risospeso le cellule nel buffer ghiacciato per la sospensione, determinare la concentrazione cellulare e la vitalità utilizzando un colorante vitale come il blu di tripano e un emocitometro. Regolare la concentrazione cellulare a 10-20 × 10⁶ cellule per millilitro aggiungendo il buffer di sospensione, per evitare l'ostruzione del citofluorimetro causata da aggregati di cellule che potrebbero essere morte durante l'isolamento.

Procedura e colorazione. Filtrare le cellule attraverso un setaccio a goccia immediatamente prima di iniziare il protocollo di separazione. La dimensione dei pori del setaccio deve essere scelta in base al tipo di cellule; per le cellule citate si utilizza un setaccio con una dimensione dei pori di 40 micrometri.

Raccogliere le cellule filtrate in un tubo conico da 15 litri o in tubi da flusso da 12 per 75 millimetri, a seconda del volume. Posizionare quindi le cellule sul ghiaccio mentre si prepara il citometro per la procedura di sorting. Se si utilizzano perline di compensazione BD come controlli positivi monocromatici, preparare un tubo controllo per ogni colore impiegato nel saggio, più un tubo controllo negativo non colorato.

Dopo aver agitato accuratamente le sospensioni di perline, aggiungere una goccia ciascuna delle sospensioni di perline negative e positive a 100 microlitri di tampone di sospensione per ogni colore utilizzato e per il controllo negativo. Successivamente, aggiungere un microlitro dell'anticorpo marcato a ciascun tubo di controllo positivo. In questo esperimento, un tubo viene preparato utilizzando anticorpi PE Texas'Red B due 20.

Uno con anticorpi anti-ETCR beta e uno con anticorpi anti-CD4 700LO mixed, agitando delicatamente il fondo dei tubi, e incubare per 15-30 minuti al buio a temperatura ambiente. Lavare le perle una volta con due millilitri di buffer di marcatura e centrifugare a 200 g per 10 minuti. Rimuovere il soprannatante per aspirazione e risospendere il pellet di perle in 200-500 microlitri di buffer di marcatura.

La configurazione del buffer del citometro a flusso varia a seconda del produttore e deve essere eseguita esclusivamente da personale adeguatamente formato. La procedura di sorting cellulare descritta qui verrà effettuata utilizzando il BD defects aria. Prima dello sorting, selezionare l'ugello appropriato in base al tipo di cellule da ordinare.

Le dimensioni disponibili per la facts aria sono 70 micrometri, 100 micrometri e 130 micrometri. La dimensione della punta dovrebbe essere almeno tre volte maggiore rispetto a quella della cellula da ordinare; per i linfociti, si seleziona la punta da 70 micrometri. È possibile eseguire un'ordinazione asettica delle cellule utilizzando l'opzione di ordinazione asettica dello strumento.

Utilizzando questa opzione, l'intero percorso del flusso di guaina viene decontaminato con etanolo al 70% secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi di sostituire i filtri della guaina e di sostituire il PBS con PBS sterile. Una volta che il citometro è pronto, posizionare i tubi di raccolta pre-raffreddati contenenti abbondante FCS nel dispositivo di raccolta appropriato.

I dispositivi di raccolta disponibili possono contenere fino a due provette coniche da 15 millilitri, quattro provette da 12 × 75 millimetri o quattro microprovette. Utilizzare provette da 12 × 75 millimetri per raccogliere meno di 1,5 × 10⁶ cellule e provette coniche da 15 millilitri per raccogliere da 1,5 × 10⁶ a 4,5 × 10⁶ cellule.

Posizionare il dispositivo di raccolta appropriato nella camera di raccolta per l'ordinamento. Indirizzare i flussi laterali verso il dispositivo di raccolta installato per gli ordinamenti multicolore. Il citometro deve essere prima calibrato per tenere conto della sovrapposizione spettrale tra i rilevatori.

L'esempio mostrato qui illustra l'overlap tra gli spettri di emissione di fit E e PE. Questo overlap, indicato nell'area ombreggiata scura, è chiamato spillover. In questo caso, il segnale di spillover di PE verrebbe rilevato nel canale di fit E e il segnale di spillover di fit E verrebbe rilevato nel canale PE.

Questa fuoriuscita deve essere corretta al fine di eliminare la fluorescenza residua di un canale in un altro. Il processo di correzione della fuoriuscita è chiamato compensazione, necessaria per eseguire una compensazione manuale. Utilizzare un software di citometria per impostare un modello che includa un grafico bivariato per visualizzare lo scattering in avanti (FSC) e lo scattering laterale (SSC) e un istogramma per ciascun fluorocromo che verrà utilizzato.

Il metodo per impostare questi grafici varia a seconda del software. Inserire il tubo di controllo negativo com nella porta di caricamento del citometro e avviare l'acquisizione dei dati mentre il campione viene analizzato. Regolare FSC e SSC in modo da posizionare la popolazione di interesse all'interno della scala.

Quindi regolare le impostazioni del PMT per la fluorescenza in modo da posizionare la popolazione negativa o l'autofluorescenza nella porzione più a sinistra dell'istogramma. Registrare il tubo di controllo negativo. Rimuovere il tubo di controllo negativo dal portacampioni del citometro e sostituirlo con il primo tubo composito di controllo positivo.

Ora iniziare l'acquisizione. Ripetere questo processo per ciascuna delle provette di controllo positivo, registrando i dati per ogni provetta. Per ogni controllo positivo, disegnare un'area di intervallo o una finestra intorno agli eventi registrati sull'istogramma.

Quindi tracciare un altro intervallo sulla porzione negativa dell'istogramma. Durante la compensazione manuale, considerare ogni fluorocromo utilizzato nell'esperimento regolando la mediana dei positivi fino a quando non risulti uguale alla mediana dei negativi. Per regolare la mediana, modificare i valori di sovrapposizione spettrale, aumentandoli o diminuendoli, finché le mediane di ciascun parametro fluorescente non corrispondano il più possibile.

Utilizzando le impostazioni stabilite con i campioni di controllo positivo e negativo, prepararsi per la procedura di sorting determinando le impostazioni di gating per il campione sperimentale. Posizionare il tubo delle cellule da ordinare nel portello di carico del citometro e avviare l'acquisizione utilizzando una velocità di nove-diecimila eventi al secondo. Selezionare un dot plot per visualizzare lo scatter anteriore rispetto allo scatter laterale.

Lo scatter in avanti è un indicatore generale delle dimensioni cellulari e viene posizionato sull'asse X, mentre lo scatter laterale è un indicatore della granulosità cellulare e viene posizionato sull'asse Y. Delimitare ora la popolazione di interesse. Una volta stabiliti i gate, verificare che la temperatura del portello di caricamento del citometro sia impostata a quattro gradi Celsius.

Quindi inserire il tubo del campione sperimentale nel portello di caricamento. Premere l'opzione di ordinamento e iniziare l'acquisizione; i tubi di raccolta devono essere posti sul ghiaccio man mano che vengono riempiti. Continuare l'ordinamento fino a quando non è stato raccolto il numero desiderato di cellule o fino a quando il tubo del campione non è vuoto.

Quindi arrestare l'ordinamento selezionando nuovamente il pulsante di ordinamento ed eliminare il campione dalla porta di caricamento. Successivamente, posizionare il tubo di raccolta direttamente sulla porta di caricamento del citometro ed acquisire da 500 a 1000 eventi. Utilizzando le stesse impostazioni usate per l'ordinamento delle cellule T, la procedura di ordinamento ha aumentato la purezza dal 21% al 99%. Per le cellule B, la popolazione iniziale di cellule B del 5% è aumentata al 98% dopo l'ordinamento.

Abbiamo appena mostrato come purificare le popolazioni di cellule B e T da citociti mediante fax. Ricordate, le tecniche di separazione possono essere utilizzate per purificare qualsiasi popolazione cellulare, purché sia possibile ottenere una sospensione di singole cellule e siano disponibili gli anticorpi appropriati. Inoltre, le cellule marcate geneticamente con marcatori fluorescenti possono essere facilmente purificate senza ricorrere all'uso di anticorpi.

Ricordarsi inoltre di utilizzare sempre i controlli appropriati per i propri esperimenti e di verificare sempre la configurazione del laser della citometria a flusso per assicurarsi di utilizzare i fluorocromi corretti e di impostare gate adeguati in modo che racchiudano correttamente le popolazioni cellulari. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.