Purificazione della popolazione di cellule specifiche per fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS)

Ciao, sono Hope Campbell di Specialista in Citometria a Flusso presso l'Istituto di Ricerca sul Sangue del Blood Center del Wisconsin. Ciao, sono STR Baso, uno studente laureato nel laboratorio della dottoressa Bonnie Dieter. Sono anche al Blood Research Institute of Blood Center del Wisconsin.

Oggi faremo una procedura per isolare le cellule utilizzando la selezione cellulare attivata fluorescente. Utilizziamo questa procedura in laboratorio per studiare la funzione dei linfociti e delle popolazioni di cellule mieloidi. Iniziamo.

In questa procedura B e CD quattro cellule T saranno purificate da citi di topo. Il numero iniziale di cellule bersaglio deve essere calcolato in base al numero di cellule necessarie e al tasso di recupero della macchina utilizzando questo metodo. Il tasso di recupero tipico per le quattro cellule T B e CD è compreso tra l'85 e il 90%La popolazione iniziale di cellule SP è di circa il 60-70% di cellule B e tra il 20 e il 30% di cellule T.

Quindi, se si inizia con 100 volte 10 per le sei cellule, si sarà in grado di recuperare da 50 a 60 milioni di cellule B e da 20 a 30 milioni di cellule T prima di iniziare i fatti. Le soluzioni e i reagenti necessari per il protocollo devono essere posti su ghiaccio. Questi includono tampone di colorazione costituito da soluzione salina tamponata con fosfato con tampone di sospensione di siero fetale di vitello costituito da 25 millimolari HEP preparati nella soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS contenente il 3% di siero fetale di vitello A, 25 millimolare di hep B soluzione preparata in siero fetale di vitello, anticorpi di colorazione e perle di compensazione.

Questo protocollo richiede anche le seguenti forniture e reagenti: tubi conici da 15 millilitri, tubi di flusso da 12 per 75 millimetri in polistirene o polipropilene. A tale scopo, è necessario preparare in anticipo un filtro cellulare in nylon trien blue e un emocitometro per le provette di raccolta di selezione.

A 300 microlitri della soluzione he's FCS per tubi di flusso o un millilitro della soluzione HEPs FFC S per tubi conici da 15 millilitri. Questi devono essere posti sul ghiaccio fino all'inizio del processo di raccolta. Inizia generando una sospensione a singola cellula della popolazione cellulare desiderata.

Se le cellule sono state isolate, utilizzando questa procedura verranno coltivate. L'intera preparazione cellulare deve essere eseguita in una cappa di coltura tissutale. Utilizzando la tecnica sterile, lavare le cellule una volta, aggiungendo ghiaccio, colorare, tampone e riprendere, sospendendo le cellule capovolgendo più volte il tubo.

Quindi centrifugare le celle per sette-otto minuti a circa 250 GS a quattro gradi Celsius. Le condizioni di lavaggio possono variare in base al tipo di cella e alla concentrazione. Per i citi, lavare fino a 200 volte 10 nelle sei cellule con 10 millilitri di tampone colorante.

Rimuovere con cautela il surnatante mediante aspirazione in modo che il pellet cellulare rimanga intatto. Quindi risospendere le cellule in un tampone di colorazione ghiacciato a una concentrazione fino a 50 volte 10 al sesto per 100 microlitri. Risospendere il pellet della cella facendo scorrere o agitando delicatamente il tubo.

Quindi trasferire da 0,25 a una volta 10 delle sei celle in un nuovo tubo di flusso in polistirene o polipropilene da 12 x 75 millimetri su ghiaccio. E metterlo da parte per usarlo in seguito come campione di controllo non colorato nella prima provetta, aggiungere gli anticorpi primari alla sospensione cellulare per ottenere la concentrazione finale desiderata. Qui, gli anticorpi coniugati rossi anti B 20 del Texas vengono utilizzati per colorare le cellule B, mentre gli anticorpi coniugati ZI anti TCR R beta e/o 700 anticorpi coniugati anti CD quattro vengono utilizzati per colorare le cellule T mescolate sbattendo il fondo del tubo o con la luce.

Vortexing, quindi posizionare le cellule sul ghiaccio e incubare al buio per 20-30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare le cellule marcate da Resus, sospendendole in 10 millilitri di sospensione ghiacciata, tampone e centrifusion come prima, dopo un'attenta rimozione del surnatante. Ripetere questo passaggio per lavare le celle una seconda volta.

Infine, risospendere le celle in sospensione ghiacciata Buffer. Se gli anticorpi primari non sono direttamente coniugati a un fluoro quattro, aggiungere anticorpi secondari marcati o streptococco AVID in coniugato alla sospensione cellulare e, di nuovo, incubare le cellule su ghiaccio al buio per 20-30 minuti dopo l'incubazione. Lavare le celle due volte con un tampone di sospensione ghiacciato.

Dopo la sospensione delle cellule in un tampone di sospensione ghiacciato. Determinare la concentrazione e la vitalità cellulare utilizzando un colorante vitale come il blu trian e l'emocitometro. Regolare la concentrazione delle cellule da 10 a 20 volte da 10 a un sesto di cellule per millilitro aggiungendo un tampone di sospensione per evitare di intasare il fax con gruppi di cellule che potrebbero essere morte durante l'isolamento.

Procedura e colorazione. Filtrare le cellule attraverso un colino a goccia immediatamente prima di iniziare il protocollo di selezione. La dimensione dei pori del colino deve essere scelta in base al tipo di cellula per i citi: viene utilizzato un colino con una dimensione dei pori di 40 micrometri.

Raccogliere le cellule filtrate in un tubo conico da 15 litri o in tubi di flusso da 12 x 75 millimetri a seconda del volume. E posizionare le cellule sul ghiaccio mentre il citometro è impostato per la procedura di smistamento. Se si utilizzano le microsfere BD comp come controlli positivi di un singolo colore, preparare una provetta di controllo per ogni colore utilizzato nel test più una provetta di controllo negativo non colorata.

Dopo aver fatto vorticare accuratamente le sospensioni di perline, aggiungerne una, far cadere ciascuna delle sospensioni di perline negative e positive in un tampone di sospensione da 100 microlitri per ogni colore utilizzato e il controllo negativo. Quindi, aggiungere un microlitro dell'anticorpo marcato a ciascuna provetta di controllo positivo. In questo esperimento, una provetta viene preparata utilizzando PE Texas'Red B due anticorpi 20.

Uno con anticorpi beta ETCR fit e uno con quattro anticorpi da 700 CD miscelati strofinando il fondo delle provette e incubando per 15-30 minuti al buio a temperatura ambiente. Lavare le perle una volta con due millilitri di colorante, tamponare e centrifugare a 200 Gs per 10 minuti. Rimuovere il surnatante per aspirazione e risospendere il pellet di perlina in 200-500 microlitri di colorazione.

L'impostazione del tampone del citometro a flusso varia a seconda del produttore e deve essere eseguita solo da personale adeguatamente addestrato. La procedura di smistamento delle cellule qui verrà eseguita utilizzando l'aria dei difetti BD. Prima di ordinare, selezionare l'ugello appropriato in base al tipo di cella da ordinare.

Le misure disponibili per l'aria dei fatti sono 70 micrometri, 100 micrometri e 130 micrometri. La dimensione dell'ugello deve essere almeno tre volte la dimensione della cellula da smistare per i linfociti, viene selezionato l'ugello da 70 micrometri. La selezione asettica delle cellule può essere eseguita utilizzando l'opzione di selezione asettica dello strumento.

Utilizzando questa opzione, l'intero percorso della guaina viene decontaminato con etanolo al 70% secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi di sostituire i filtri della guaina e sostituire il PBS con PBS sterile. Una volta che il citometro è pronto per l'uso, posizionare le provette di raccolta pre-raffreddate contenenti cumuli di FCS nell'apposito dispositivo di raccolta.

I dispositivi di raccolta disponibili possono contenere fino a due provette coniche da 15 millilitri. Quattro tubi da 12 x 75 millimetri o quattro microtubi. Utilizzare provette da 12 x 75 millimetri per raccogliere meno di 1,5 volte 10 alla sesta cella e provette coniche da 15 millilitri per raccogliere 1,5 volte 10 al sei a 4,5 volte 10 alla sesta cella.

Posizionare il dispositivo di raccolta appropriato nella camera di raccolta differenziata. Dirigere i flussi laterali nel dispositivo di raccolta installato per gli smistamenti multicolore. Il citometro deve essere prima calibrato per tenere conto della sovrapposizione spettrale tra i rivelatori.

L'esempio mostrato qui illustra la sovrapposizione tra gli spettri di emissione dell'accoppiamento E e pe. Questa sovrapposizione mostrata nell'area ombreggiata scura è chiamata spillover. In questo caso, lo spillover PE verrebbe rilevato nel canale E e e verrebbe rilevato nel canale PE.

Questo spillover deve essere corretto per eliminare la fluorescenza residua di un quarto piano in un altro canale. Il processo di correzione dello spillover è chiamato compensazione per eseguire la compensazione manuale. Utilizzare il software di citometria per impostare un modello che includa un grafico bivariato per visualizzare l'FSC a dispersione diretta e l'SSC a dispersione laterale e un istogramma per ogni fluro che verrà utilizzato.

Il metodo per impostare questi grafici varia a seconda del software. Posizionare il tubo di controllo negativo nella porta di caricamento del citometro e iniziare l'acquisizione dei dati mentre il campione è in funzione. Regolare l'FSC e l'SSC per posizionare la popolazione di interesse su scala.

Quindi regolare le impostazioni PMT della fluorescenza per posizionare la popolazione negativa o l'autofluorescenza nella parte all'estrema sinistra dell'istogramma. Registrare il tubo di controllo negativo. Rimuovere il tubo di controllo negativo dalla porta di caricamento del citometro e sostituirlo con il primo tubo di controllo positivo.

Ora inizia l'acquisizione. Ripetere questo processo per ciascuna delle provette di controllo positivo registrando i dati per ciascuna provetta. Per ogni controllo positivo, disegna una porta di intervallo o una casella attorno agli eventi registrati sull'istogramma.

Quindi disegna un'altra porta di intervallo nella parte negativa dell'istogramma. Quando si esegue la compensazione manuale, prendere in considerazione ogni fluro utilizzato nell'esperimento regolando la mediana dei positivi fino a quando non è uguale alla mediana dei negativi. Per regolare la mediana, regolare i valori di sovrapposizione spettrale, più alti o più bassi, fino a quando le mediane per ciascun parametro fluorescente non corrispondono il più possibile.

Utilizzando le impostazioni stabilite con i campioni di controllo positivi e negativi, prepararsi per la procedura di smistamento determinando le impostazioni dell'andatura per il campione sperimentale. Posizionare la provetta di cellule da smistare nella porta di caricamento del citometro e iniziare l'acquisizione utilizzando una velocità da nove a 10.000 eventi al secondo. Selezionare un grafico a punti per visualizzare la dispersione diretta rispetto alla dispersione laterale.

La dispersione diretta è un indicatore generale delle dimensioni delle celle ed è posizionata sull'asse x, mentre la dispersione laterale è un indicatore della granularità delle celle ed è posizionata sull'asse Y. Ora porta la popolazione di interesse. Una volta determinati i cancelli, verificare che la temperatura della porta di caricamento del citometro sia impostata su quattro gradi Celsius.

Quindi posizionare il tubo del campione sperimentale nella porta di caricamento. Premere l'opzione di ordinamento e iniziare l'acquisizione I tubi di raccolta devono essere posizionati sul ghiaccio mentre vengono riempiti. Continuare lo smistamento fino a quando non è stato raccolto il numero desiderato di cellule o fino a quando la provetta del campione non è vuota.

Quindi interrompere lo smistamento selezionando nuovamente il pulsante di smistamento e rimuovere il campione dalla porta di caricamento. Quindi, posizionare la provetta di raccolta direttamente sulla porta di caricamento del citometro e acquisire da 500 a 1000 eventi. Utilizzando le stesse impostazioni utilizzate per lo smistamento delle cellule T, la procedura di smistamento ha aumentato la purezza dal 21 al 99%Per le cellule B, la popolazione iniziale di cellule B del 5% è stata aumentata al 98% dopo lo smistamento.

Quindi ti abbiamo appena mostrato come purificare la popolazione di cellule b e t dai citi via fax. Ricorda, i fatti possono essere utilizzati per purificare qualsiasi popolazione cellulare se è possibile generare una sospensione di una singola cellula e sono disponibili anticorpi appropriati. Inoltre, le cellule impilate geneticamente con marcatori fluorescenti possono essere facilmente purificate senza l'uso di anticorpi.

Inoltre, ricordate sempre di utilizzare i controlli adeguati per i vostri esperimenti e controllate sempre la configurazione del laser per citometria a flusso per assicurarvi di utilizzare i fluorocromi corretti e assicuratevi di utilizzare i gate appropriati in modo che si trovino correttamente intorno alle vostre popolazioni. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.