Profiling anticorpi Systems Immunoprecipitazione luciferasi (LIPS)

In questo video vengono illustrati i passaggi necessari per eseguire il saggio. Gli antigeni vengono espressi in cellule CO una come fusioni ricombinanti di luciferasi ran vanilla o antigene rook. Vengono ottenuti estratti grezzi e utilizzati senza ulteriore purificazione.

L'analisi mediante lips inizia incubando estratti grezzi di antigeni di Rook con SRA del paziente. In pozzetti microtitolati, la miscela di anticorpi e antigeni viene quindi trasferita in una piastra filtrante a 96 pozzetti contenente perle di proteina A G per catturare le molecole di IgG; successivamente la piastra filtrante contenente le perle di proteina AG viene lavata. L'antigene di Rook legato all'anticorpo viene misurato aggiungendo un substrato chemiluminescente e le unità di luce vengono rilevate mediante un luminometro.

Ciao, sono la dottoressa Catherine Chang del Laboratorio di Biologia Sensoriale presso l'Istituto Nazionale di Ricerca in Odontoiatria e Ricerca Craniofacciale. Oggi vi mostreremo la procedura per i sistemi di immunoprecipitazione della luciferasi delle labbra. Utilizziamo il metodo LIPS nel nostro laboratorio per misurare i titoli anticorpali al fine di diagnosticare malattie e/o infezioni.

Le sottoclassi stratificano gli stati patologici, monitorano la vaccinazione e altre applicazioni coinvolte nella generazione di profili anticorpali. Cominciamo dunque. Prima di iniziare la trasfezione, i plasmidi per le fusioni con la luciferasi vanillina vengono preparati in anticipo come descritto nell'articolo pubblicato su BMC Biotechnology.

Il DNA plasmidico BYO et al. 2005 viene preparato utilizzando un kit MIDI prep con un rendimento di uno-tre milligrammi e conservato come soluzione stock di un milligrammo per millilitro a meno 20 gradi Celsius. Le cellule Cost one utilizzate nella trasfezione vengono coltivate in DMEM con il 10% di FCS seguendo protocolli standard di coltura cellulare. Un giorno prima della trasfezione, suddividere le cellule Cost one in nuove piastre da 100 per 20 millimetri a circa due volte 10 alla sesta cellule per piastra e incubare a 37 gradi Celsius nel giorno successivo.

Le cellule dovrebbero essere confluenti all'80-95%. Prima di procedere, lasciare che il reagente per la trasfezione del gene FU6 si riscaldi a temperatura ambiente, essendo stato precedentemente conservato a quattro gradi Celsius, mentre si attende che il gene FU si riscaldi. Etichettare provette microcentrifuga in polipropilene da 1,5 millilitri per ciascun DNA plasmidico da trasfettare, avendo cura di non toccare le pareti laterali delle provette. Aggiungere sei microlitri del gene fusione FU6 alle provette, che dovrebbero già contenere 94 microlitri di mezzo ottimale, e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere da uno a due microgrammi di plasmide contenente la costruzione fusione per l'antigene Luciferina, mescolare capovolgendo la provetta diverse volte, centrifugare brevemente e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.

Trasferire l'intera soluzione ottimale del DNA di fusione alle cellule lasciandola gocciolare uniformemente nel mezzo dei cos. Incubare le cellule cos transfezionate per due giorni, quindi procedere al raccolto. Per iniziare il raccolto della proteina di fusione, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con sei millilitri di PBS.

Rimuovere delicatamente il PBS residuo dalla piastra per colture cellulari, aggiungere 1,4 millilitri di tampone di lisi freddo e raccogliere le cellule con una spatola per cellule, quindi trasferire rapidamente metà del lisato in ciascuna di due provette microcentrifuga da 1,5 millilitro poste sul ghiaccio. Per rompere le cellule si utilizza un Branson SOLIDIFIER one 50. Posizionare la provetta microcentrifuga contenente il lisato cellulare sul ghiaccio ed eseguire un'impulso di cinque secondi.

Cinque secondi e cinque secondi. Con impostazioni di sonicazione rispettivamente di due, due e quattro. Centrifugare il lisato cellulare a 12.500 giri/min per due minuti e quattro.

Centrifuga a quattro gradi Celsius. Ribaltare delicatamente i tubi tra una centrifugazione e l'altra per rimuovere i detriti debolmente aderenti alla parete del tubo. Quindi trasferire con attenzione il soprannatante, senza disturbare il pellet, dai due tubi a un nuovo tubo microcentrifuga posto sul ghiaccio.

Per misurare le unità di luce (lu) del lisato, diluire un microlitro di lisato con otto microlitri di PBS in un nuovo tubo microcentrifuga; aggiungere direttamente 100 microlitri di un substrato celent erne alla miscela diluita e misurare immediatamente la luminescenza nel tubo utilizzando un luminometro per provette con un tempo di lettura di cinque secondi a partire da questo passaggio. Ricordare di adottare le precauzioni di sicurezza quando si lavora con campioni di origine umana e animale. Per preparare una piastra madre di siero, fonte di anticorpi paziente per il profilo degli antigeni, aggiungere innanzitutto 450 microlitri di buffer A in ogni pozzetto di una piastra micrometrica in polipropilene da 96 pozzetti profondi.

In questa fase, un colorante, il rosso fenolo, può essere aggiunto anche al tampone A per fungere da tracciante durante il monitoraggio delle successive fasi di elaborazione del campione SRA e di altri passaggi del saggio sui lipidi. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di siero da ciascun campione in ogni pozzetto contenente 450 microlitri di tampone. Si noti che si tratta di una diluizione 1:10 dell'SRA nel tampone.

Un SRA non viene tipicamente aggiunto alle ultime due pozzette della piastra master perché queste sono riservate ai bianchi di tampone prima di conservare la piastra master per un uso futuro. Viene agitata vigorosamente per uno o due ore su una piattaforma rotante. A 650 giri al minuto, il siero rimane stabile per almeno un mese o più a quattro gradi Celsius e la piastra può essere sigillata con parafilm per prevenire l'evaporazione se verrà conservata prima di eseguire il saggio dei lipidi; organizzare un foglio di calcolo contenente i numeri di identificazione dei campioni e le relative pozzette sulla piastra master. Piastre microtitolazione in polipropilene da 96 pozzette a fondo piatto vengono utilizzate come piastre di lavoro per testare i sieri.

Nel primo passaggio, aggiungere 40 microlitri di tampone A in ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Successivamente, prelevare 10 microlitri di siero diluito dalla piastra master e aggiungerli direttamente in ogni pozzetto della piastra di lavoro utilizzando una pipetta multicanale. Dopo l'uso, sigillare la piastra master con parafilm, rimettere il coperchio sulla piastra master, quindi avvolgerla con pellicola trasparente e conservarla a quattro gradi Celsius.

Preparare una miscela madre contenente l'estratto antigene rook in modo che un milione di unità lu vengano aggiunte in 50 microlitri di tampone A in ciascun pozzetto. Preparare questa miscela madre ed aggiungere con una pipetta 50 microlitri di miscela antigene rook in ogni pozzetto. Coprire la piastra con un coperchio in polistirene e incubare su un agitatore rotatorio a 100 giri al minuto per un'ora.

A temperatura ambiente, durante l'incubazione, prelevare un'aliquote di 1,5 millilitri di una sospensione al 30% di perle di proteina Ag ultra link in PBS dal frigorifero. Aggiungere cinque microlitri sul fondo di ogni pozzetto di una nuova piastra HTS a filtro da 96 pozzetti. Al termine dell'incubazione della piastra di un'ora, trasferire i 100 microlitri della miscela reazione antigene-anticorpo nei pozzetti della piastra HTS a filtro da 96 contenente le perle di proteina Ag utilizzando una micropipetta a canale multiplo, quindi incubare la piastra a filtro da 96 pozzetti su uno shaker rotatorio per un'ulteriore ora a 100 giri al minuto a temperatura ambiente.

Successivamente, lavare la piastra filtrante utilizzando una stazione automatizzata Biome FX con un manifold a vuoto: ogni pozzetto viene lavato otto volte con 100 microlitri di tampone A, seguito da due lavaggi con 100 microlitri di PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, spegnere il vuoto. Rimuovere la piastra filtrante e asciugarla tamponando con una pila di fazzoletti di carta o carta da filtro, assicurandosi di eliminare l'umidità sia sulla parte superiore che su quella inferiore della piastra. Per determinare la luminescenza in ciascun pozzetto della piastra viene utilizzato un luminometro Burt hold LB nine 60 Centro Microplate.

Accendere la macchina e risciacquare l'injector con acqua distillata. Per il ciclo di lavaggio dell'injector si utilizza il substrato INE, che serve per l'innesto e il funzionamento della macchina ed è preparato utilizzando il kit per substrato ranil di Promega seguendo le istruzioni del produttore; tipicamente sono necessari sei millilitri di una miscela di substrato di ottima qualità per una piastra. Caricare la miscela di substrato nel luminometro, quindi aprire un file di programma contenente le impostazioni per l'iniezione del substrato e la lettura della piastra.

Per queste misurazioni, vengono iniettati 50 microlitri di substrato soine. La piastra viene agitata per due secondi, seguiti da una lettura della luminescenza di cinque secondi.

Avviare il programma che inizia la lettura della piastra al termine della corsa e rimuovere immediatamente la piastra filtrante microtitolata per evitare fuoriuscite nel luminometro. I dati vengono esportati automaticamente dal programma microwind in formato Excel per ulteriori analisi. Mediare i risultati di due corsie diverse effettuate con lo stesso siero.

Per generare i valori di titolo lu per ogni campione, si raccomanda di eseguire duplicati. I campioni duplicati dovrebbero mostrare un'elevata concordanza nei valori di titolo tra le due prove. Per la rappresentazione grafica dei dati, i valori di titolo lu possono essere ulteriormente corretti sottraendo i valori dei bianchi tampone, come mostrato qui.

La sensibilità e la specificità del saggio possono essere calcolate anche utilizzando valori soglia derivati dalla media più tre o cinque deviazioni standard dei campioni di controllo. Vi abbiamo appena mostrato come misurare i titoli anticorpali utilizzando LIPS, una tecnica che richiede un'ottimizzazione minima del saggio e, grazie alla sua semplicità, può essere impiegata per generare dati di alta qualità in meno di due settimane per qualsiasi antigene. Quando si lavora con campioni umani, è importante ricordare di adottare le opportune precauzioni di sicurezza.

E tenete presente che lifts è altamente scalabile e, proprio per questo, può essere utilizzato per analizzare un piccolo numero di campioni mediante lavaggio manuale o un'intera piastra mediante una stazione di lavoro robotizzata; grazie a tale versatilità, riteniamo che lips sarà estremamente utile nell'analisi sierologica degli antigeni e avrà ampie implicazioni nell'analisi delle malattie e nella sanità pubblica in generale. Bene, è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti di profilazione degli anticorpi.