Primer Capture Estensione: Recupero sequenza mirata da fonti DNA fortemente degradate

Questo video illustra la tecnica di cattura mediante estensione dell'innesco, o PECA, che consente il recupero mirato di sequenze di DNA da fonti di DNA altamente frammentate con numero estremamente basso di copie. Abbiamo utilizzato questa tecnica per sequenziare genomi mitocondriali completi da ossa di Neanderthal vecchie di oltre 40.000 anni, e il metodo può essere impiegato per la cattura di qualsiasi piccola regione bersaglio o polimorfismi del singolo nucleotide, e da molti individui. I passaggi principali di questa procedura sono l'amplificazione mediante PCR di una libreria primaria di DNA, la quantificazione della libreria amplificata mediante PCR quantitativa, l'estensione primaria sul bersaglio, la cattura su perle dei prodotti di estensione primaria per rimuovere i frammenti non bersaglio, e l'eluzione e il sequenziamento dei bersagli catturati e lavati.

Ciao, sono Adrian Briggs del laboratorio di Shanti Payable presso il Dipartimento di Genetica del Max Plank Institute for Evolutionary Anthropology di Lipsia. Oggi vi mostreremo un procedimento per isolare specifiche sequenze di DNA di interesse da una fonte complessa e altamente degradata di DNA, come ad esempio ossa antiche. Abbiamo utilizzato questo procedimento per studiare la diversità genetica mitocondriale di Homo neanderthalensis, o uomo di Neanderthal.

Iniziamo. Il DNA utilizzato nel nostro esperimento proviene da ossa di Neanderthal risalenti a un'età compresa tra 40.000 e 70.000 anni, ritrovate in diversi siti all'interno dell'areale geografico dei Neanderthal. Un osso viene prima esposto per tutta la notte alla luce UV per decontaminare la superficie da eventuali DNA estranei.

Si utilizza un trapano fine per produrre da 100 a 500 milligrammi di polvere ossea. Il DNA viene estratto dalla polvere ossea mediante un procedimento descritto nell'articolo del 2007 "Confronto e ottimizzazione dell'estrazione di DNA antico" di Nadine Rockland e Michael Hof.Writer. L'estrazione di DNA viene quindi convertita in una libreria di sequenziamento aggiungendo siti di innesco adattatori universali alle estremità di tutti i frammenti di DNA, poiché una libreria 454 generata da un osso di Neanderthal contiene solo piccole quantità di DNA, a volte appena pochi picogrammi. Questa libreria primaria di DNA viene inizialmente amplificata mediante PCR utilizzando primer per PCR in emulsione corrispondenti ai primer universali della libreria.

Per preparare la miscela PCR per l'amplificazione della libreria, unire i seguenti reagenti in un tubo PCR: utilizzare 10 microlitri di tampone PCR 10 X GAMP, due microlitri di cloruro di magnesio, due microlitri di BSA, un microlitro di mix di DNTP, tre microlitri ciascuno di primer forward e reverse MPCR 4,54 M, un microlitro di amply gold DNA polimerasi e 25 microlitri di template della libreria. Infine, aggiungere 45 microlitri di acqua di grado PCR per ottenere un volume totale di 100 microlitri. La DNA polimerasi amply Tech gold è stabile a temperatura ambiente, quindi non è necessario lavorare sul ghiaccio.

Dopo aver preparato la reazione di PCR, posizionare il tubo PCR in un termociclatore iniziando con un passaggio di denaturazione a 95 gradi Celsius per 12 minuti, seguito da 14 cicli di 95 gradi Celsius per 30 secondi, 60 gradi Celsius per un minuto e 72 gradi Celsius per un minuto. Al termine di questi 14 cicli, impostare un passaggio finale a 72 gradi Celsius per cinque minuti, dopo il quale il tubo PCR può essere mantenuto indefinitamente a 10 gradi Celsius fino al momento dell'uso, una volta completata l'amplificazione PCR. Successivamente, purificare il prodotto PCR utilizzando una colonna spin Kyogen MinLu seguendo le istruzioni del produttore ed eluire il DNA dalla colonna con 50 microlitri di tampone EB fornito con il kit MinLu, prima dell'estensione primaria e del trattenimento del prodotto.

È necessario eseguire una PCR quantitativa su aliquote delle librerie non amplificate e amplificate al fine di quantificare e verificare la qualità del prodotto della libreria amplificata. La libreria amplificata in 14 cicli dovrebbe contenere migliaia di volte più DNA rispetto alla libreria primaria. In caso contrario, le condizioni di amplificazione devono essere verificate e ripetute.

I primer di cattura per l'estensione primaria, che verranno utilizzati per isolare le sequenze di interesse dalla libreria amplificata, devono essere progettati come normali primer per PCR in modo da appaiarsi alla regione bersaglio desiderata con una temperatura di fusione ideale di 60 gradi Celsius all'estremità 5' di ciascuna di queste sequenze bersaglio, in corrispondenza della sequenza di coda di 12 basi, e devono includere un residuo di biotina all'estremità 5'. Fino a 150 primer PEC possono essere utilizzati contemporaneamente in una singola miscela multiplex preparata da soluzioni madre di 200 micromolari. Per la reazione di estensione primaria, preparare una miscela PCR in un tubo PCR adatto aggiungendo cinque microlitri di tampone PCR 10 X GAMP, due microlitri di cloruro di magnesio, un microlitro di BSA, 0,5 microlitri di dNTP, cinque microlitri della miscela di primer di cattura per l'estensione primaria, 0,5 microlitri di DNA polimerasi tack gold, due microlitri di DNA della libreria amplificata per 14 cicli e, infine, 31 microlitri di acqua di grado PCR, ottenendo un volume totale di 50 microlitri.

Se il modello di libreria amplificato contiene più di 1 × 10¹² copie per microlitro, il modello deve essere dapprima diluito con tampone EB in modo che non vengano aggiunte al mix di reazione più di 2 × 10¹² copie. Dopo aver preparato la provetta per PCR, posizionarla nel termociclatore e impostare un singolo ciclo di reazione. Iniziare con una denaturazione di 12 minuti a 95 °C, seguita da 1 minuto a 60 °C e da 5 minuti a 72 °C per l'estensione primaria.

E una volta terminato il singolo ciclo, 72 gradi Celsius per mantenere il prodotto PCR fino al passaggio successivo. Per evitare l'appaiamento non specifico dei primer e per catturare direttamente 150 microlitri di tampone PBI o PB dal kit di purificazione Kyogen Ute nei tubi della reazione PCR, mentre la miscela di reazione è ancora nel termociclatore mantenuto a 72 gradi Celsius. Questa procedura inattiva la polimerasi mentre la temperatura è troppo elevata per l'estensione non specifica dei primer bersaglio; chiudere i tubi, vortexare brevemente e quindi raccogliere il liquido mediante centrifugazione con una centrifuga da banco.

Utilizzare esclusivamente tampone PBI o PB in questo passaggio, poiché altri tamponi di legame come il Qiagen PM Buffer possono interferire con il successivo processo di cattura. Successivamente, rimuovere la miscela dal tubo PCR e trasferirla su una colonna Rogen MinLu spin per la purificazione, seguendo le istruzioni del produttore; come precedentemente effettuato, eluire il DNA dalla colonna con 30 microlitri di tampone EB fornito con il kit MinLu. Al fine di rimuovere tutti i frammenti che non si sono legati ai primer PEC, viene eseguito un passaggio di cattura basato su microsferette.

Per prima cosa, risospendere una soluzione madre di M 270 strip divide in perle mediante vortex e prelevare una quantità di perle equivalente a 25 microlitri per campione. Lavare le perle due volte con 500 microlitri di buffer BW due volte e risospendere nello stesso volume di BW due volte del volume di perle inizialmente prelevato. Preparare 25 microlitri della sospensione.

Per ogni campione, aggiungere 25 microlitri del DNA purificato eluito a 25 microlitri della sospensione di perle, conservando i rimanenti cinque microlitri per una successiva quantificazione. Mescolare il DNA e la sospensione di perle aspirando e dispensando con la pipetta e agitando con la punta perpet, quindi ruotare lentamente su un agitatore rotante da banco per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo il mescolamento, trasferire il contenuto in una nuova provetta PCR da 1,5 millilitro.

Durante il precedente passaggio di incubazione in rotazione, parte del DNA non bersaglio potrebbe essersi attaccata alla parete del tubo. Pertanto, trasferendo la sospensione di perline in un nuovo tubo si evita la possibilità che questo DNA non bersaglio venga rilasciato nei prodotti finali. Durante il passaggio di eluizione termica, utilizzare il raccoglitore di particelle magnetiche per formare il pellet delle perline; dopo 10-20 secondi, tutte le perline si saranno spostate verso la parete, lasciando un sopranatante limpido che deve essere rimosso per lavare le perline. Aggiungere 500 microlitri di buffer BW 1x al tubo e vortexare per circa tre secondi a velocità lenta.

Una volta con il tubo in posizione verticale e una volta con il tubo capovolto, nessun microsfera dovrebbe rimanere aderente alla parete del tubo. Utilizzando una centrifuga da banco, centrifugare la sospensione per uno a tre secondi, giusto il tempo necessario per rimuovere tutto il liquido dalle pareti del tubo. Riposizionare il tubo nel MPC e attendere da 10 a 20 secondi finché tutte le microsfere non si saranno raccolte sul lato del tubo.

Quindi rimuovere il sopranatante. Il primo lavaggio è ora completato. Ripetere questa procedura ulteriori quattro volte dopo l'ultimo lavaggio con BW e la rimozione del sopranatante.

Aggiungere 500 microlitri di buffer di lavaggio caldo una volta. Mescolare la sospensione mediante vortexaggio breve e centrifugazione come in precedenza, quindi agitare il tubo per due minuti a 65 gradi Celsius su un agitatore per blocco termico a 1000 giri al minuto, dopo una breve centrifugazione per rimuovere le tracce di supernatante entro un minuto dal prelievo dal blocco termico. Questo passaggio rimuoverà i frammenti che potrebbero legarsi ai primer PEC, ma che non sono stati allungati nel passaggio di estensione del primer. Risospendere il pellet in 30 microlitri di buffer EB e trasferire la miscela in un nuovo tubo PCR da 1,5 millilitri.

Incubare il tubo nel termociclatore a 95 gradi Celsius per tre minuti. Raccogliere le perle nel collettore di particelle magnetiche. Occorrono da 10 a 20 secondi affinché il sopranatante si schiarisca completamente; rimuovere quindi il sopranatante S in un tubo fresco etichettato.

Aver cura di non trasferire alcuna perlina. Conservare il soprannatante, che contiene il prodotto catturato di frammenti di DNA. Le perline possono essere eliminate a questo stadio.

Per amplificare il prodotto catturato, preparare una miscela PCR fino a un volume totale di 100 microlitri come eseguito nella parte due e applicare le stesse condizioni di termociclaggio PCR. Ancora una volta, al termine dell'amplificazione PCR del prodotto catturato, procedere con la purificazione utilizzando una colonna Qiagen Ute spin come precedentemente effettuato nella sezione due, eluendo il DNA dalla colonna con 50 microlitri di tampone Eeb. Il prodotto è ora pronto per il sequenziamento ad alto rendimento. Sono stati progettati 574 primer PEC per coprire l'intero genoma mitocondriale di Neanderthal.

Abbiamo suddiviso questi in quattro miscele multiplex e due round seriali di cattura dell'estensione primaria su librerie provenienti da cinque fossili di Neanderthal di quattro siti in tutta l'Eurasia, datati tra i 40.000 e i 70.000 anni fa, generando da 170.000 a 500.000 sequenze per individuo e allineando i risultati a una sequenza di riferimento mitocondriale. Abbiamo riscontrato che la procedura PEC aveva enormemente arricchito il DNA mitocondriale, ottenendo una copertura completa dell'intero DNA mitocondriale per ciascun individuo con una copertura media compresa tra 18 e 56,3 volte. Con questi risultati, siamo stati in grado di generare una sequenza di genoma mitocondriale completo di alta qualità per ciascun individuo.

Abbiamo quindi effettuato un confronto filogenetico di queste sequenze con un campione mondiale di esseri umani odierni e con i nostri parenti viventi più stretti, lo scimpanzé e il bonobo. Ciò ha confermato risultati precedenti secondo cui il DNA mitocondriale dei Neandertal è strettamente imparentato, ma chiaramente distinto da quello degli esseri umani moderni. Inoltre, il confronto tra le sequenze dei Neandertal ha rivelato una diversità genetica estremamente bassa, inferiore a quella osservata tra gli esseri umani attuali a livello globale e simile a quella degli europei odierni.

Questa evidenza, unita a un'analisi dell'evoluzione proteica nelle sequenze di Neanderthal, suggerisce che i Neanderthal avevano una dimensione di popolazione a lungo termine ridotta, il che è coerente con le evidenze archeologiche, secondo cui la densità di popolazione dei Neanderthal non raggiunse mai i livelli raggiunti dagli esseri umani moderni. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire un'estensione primate mediante cattura per amplificare e isolare sequenze bersaglio in preparazione al sequenziamento ad alto rendimento. Quando si segue questa procedura, è importante rispettare tutte le specifiche di temperatura sul termociclatore, ma bisogna tenere presente che i primer possono avere temperature di annealing diverse, quindi potrebbe essere necessario regolare la temperatura di annealing in base ai propri primer specifici e prestare attenzione durante tutti i passaggi di lavaggio per rimuovere la maggior quantità possibile di liquido.

Grazie quindi per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.