Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l'ingegneria tissutale

Il processo graduale per l'incapsulamento delle cellule inizia con la preparazione e la sterilizzazione di stampi in idrogel e altri materiali, seguita dall'isolamento delle cellule in singole popolazioni, in provette per ogni set di gel. L'azione viene quindi eseguita in presenza di cellule, seguita dal periodo di incubazione in vitro o in vivo. L'analisi a valle del comportamento cellulare può includere test di vitalità, morfologia, proliferazione e differenziazione.

Ciao Amidio Kahan del laboratorio del Dr.Jason Burdick presso il Dipartimento di Bioingegneria dell'Università della Pennsylvania. Oggi vi mostreremo una procedura per l'incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l'ingegneria tissutale. Utilizziamo questa procedura per studiare gli effetti della composizione e della struttura dell'idrogel sul comportamento delle cellule incapsulate.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione allo 0,5% in peso del fotoiniziatore air cure 2 9 5 9 o I 2 9 5 9 in PBS. Mescolare e incubare per due o tre giorni al buio a 37 gradi Celsius.

Quando è pronta, utilizzare un filtro per siringa per sterilizzare la soluzione e conservarla a temperatura ambiente. Successivamente, utilizza un programma per fogli di calcolo come Microsoft Excel per calcolare la quantità di polimero e reticolante necessari dimostrati. Ecco l'acido ialuronico funzionalizzato con gruppi reattivi acrilati.

Calcola anche la quantità del peptide pendente contenente il dominio adesivo funzionale con l'aminoacido cistina, arginina, glicina e aspartato. La cistina serve per legarsi al polimero. Ora che sono state determinate le quantità richieste di reticolante polimerico e pent, pesarle e metterle in un tubo eorico.

Regola il foglio di calcolo di conseguenza. Per l'effettiva massa di polimero ottenuta, procedere alla preparazione degli stampi in gel. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare le punte di sterili confezionate singolarmente.

Siringhe monouso da un millilitro. Assicurarsi che venga eseguito un taglio piatto per gli stampi da utilizzare per il modello fotografico e i gel. Infine, sterilizzare gli stampi delle siringhe, le provette EOR con i tappi aperti e qualsiasi altro materiale necessario posizionandoli sotto una fonte di luce germicida incorporata nella cabina di sicurezza biologica per 30 minuti.

Una volta completata la sterilizzazione, procedere alla preparazione delle cellule dopo la sterilizzazione dell'apparecchiatura sperimentale. Lavorare nella cappa e aggiungere TEA sterile al polimero utilizzato nella reticolazione di tipo mical e PBS sterile al polimero utilizzato per la reticolazione dei radicali liberi. AGGIUNGI il tampone corrispondente ai tubi di porzione pendenti e al vortice.

Per sciogliere la porzione del pendente, si lega all'acido ialuronico alchilato tramite un tiolo da un gruppo INE sul peptide per attaccare la porzione del ciondolo al polimero, aggiungerla alla soluzione polimerica e sigillare con param. In breve, agitare e incubare a 37 gradi Celsius mescolando. Durante la preparazione delle cellule, mentre la porzione pendente si sta attaccando, preparare le cellule per essere incapsulate tryis, cellule staminali mesenchimali umane o HMC lavandole con PBS.

Quindi incubare con tripsina per un minuto a temperatura ambiente, rimuovere la tripsina, incubare altri cinque minuti a 37 gradi. Quindi aggiungere il terreno di coltura HMSC per neutralizzare la tripsina e rilasciare le cellule dalla superficie della piastra. Contare le cellule con un emocitometro.

Separare le cellule contate in porzioni contenenti il numero appropriato per ogni set di gel. Per un set di tre gel da 50 microlitri a una densità di 10 milioni di cellule per millilitro, separare 1,5 milioni di cellule in un singolo tubo conico. Non preparare più di quattro gel in un singolo set a causa dei tempi di azione.

Centrifugare quindi le celle a 500 RCF per sei minuti. A temperatura ambiente, mentre le cellule stanno ruotando, preparare la miscela di polimerizzazione per la reticolazione in edizione mical. Aggiungere il tampone al reticolante per ottenere la concentrazione appropriata.

Per la reticolazione dei radicali liberi iniziata dalla luce, aggiungere la soluzione di I 2 9 5 9 precedentemente preparata alla soluzione polimerica. Al 10% del volume totale del gel indurito per una concentrazione finale dell'iniziatore dello 0,05% in peso. Ora le cellule e la miscela di polimerizzazione sono pronte per l'incapsulamento nell'idrogel.

Iniziare aspirando la bocchetta dalle celle della centrifuga. Attendere che il liquido si depositi dopo l'aspirazione iniziale e riaspirare per rimuovere il più possibile il terreno senza interrompere il pellet cellulare Resus. Sospendi il pellet della cella con la soluzione polimerica per evitare bolle d'aria.

Pipettare lentamente la soluzione su e giù circa 10 volte, il che dovrebbe essere sufficiente per distribuire uniformemente le cellule. Per la reazione di addizione di tipo micale, utilizzare una punta di pipetta a orifizio largo per aggiungere il volume appropriato di soluzione di reticolante alla cella polimerica. Impostando la pipetta sul volume di gel individuale desiderato.

Pipettare la soluzione su e giù per omogeneizzare ed Eloqua negli stampi per puntali della siringa. Eseguire rapidamente la fase per garantire una distribuzione uniforme delle cellule e consentire un'incubazione da 10 a 30 minuti nella cappa di coltura per la reticolazione. Per la luce ha iniziato la reticolazione dei radicali liberi.

Aliquotare il volume appropriato negli stampi per punte della siringa. Esporre le siringhe alla luce UV per la reticolazione radicale con un'esposizione di 10 minuti a 365 nanometri. La luce UV di quattro milliwatt per centimetro quadrato è comune per i polimeri funzionalizzati ACRL.

Eseguire rapidamente il passaggio per ridurre al minimo l'assestamento delle cellule prima dell'esposizione ai raggi UV. Dopo la reticolazione, immergere i gel nei pozzetti di una piastra di coltura tissutale contenente terreni per l'incubazione e l'analisi. La reticolazione dell'idrogel può anche essere eseguita in sequenza.

Innanzitutto, aggiungere il colorante funzionalizzato rumina metalolata a una concentrazione finale di 20 nanomolari nel gel. Il colorante aiuta a visualizzare il modello poiché si incorpora preferenzialmente nelle regioni radicalmente reticolate del gel. Quindi iniziare con la reazione di polimerizzazione di tipo mic producendo una frazione dei legami incrociati teorici per quanto segue.

Reticolazione radicale libera sarà necessario utilizzare una maschera progettata in un programma come Adobe Photoshop o Illustrator e stampata direttamente su maschere di trasparenza. Le dimensioni della maschera devono corrispondere alla parte superiore rotonda della siringa. Utilizzare una pinzetta sterilizzata per applicare una maschera sterile direttamente sulla superficie del gel ed esporla alla luce per reticolare il gel.

Qui vengono ulteriormente mostrati gli HMC all'interno di idrogel a base di HA un'ora dopo l'incapsulamento. Poiché gli idrogel sintetizzati sono in genere trasparenti, le cellule possono essere visualizzate per la morfologia utilizzando la microscopia ottica. Le stesse cellule sono state visualizzate per la vitalità 24 ore dopo l'incapsulamento utilizzando un kit fluorescente di colorazione di morti vivi.

Abbiamo usato il calcio M per rilevare le cellule vive e l'omodimero di aterio per le cellule morte e abbiamo osservato una vitalità superiore al 95%. Abbiamo anche utilizzato il saggio del blu di alamar per determinare il livello di proliferazione cellulare misurato da quanto bene le cellule metabolizzano il reagente del saggio, con conseguente cambiamento di colore. La colorazione cellulare è stata eseguita su H HMC sette giorni dopo l'incapsulamento all'interno di un idrogel degradabile e adesivo a base di HA e utilizzando procedure standard di fissazione e permeabilità.

L'acton cellulare è visibile utilizzando la phin marcata con fluoresceina e i nuclei trattenuti con dpi. L'immunocolorazione contro la cullina viene utilizzata per la visualizzazione delle aderenze focali all'interno della matrice di idrogel. La colorazione istologica viene eseguita dopo la disidratazione, l'inclusione di paraffina e il sezionamento degli idrogel utilizzando protocolli standard di idrogel di HA incapsulati HMSC radicalmente polimerizzati.

Dopo una settimana di coltura, sono stati colorati con l'emat toin che contrassegna i nuclei e l'ASIN che contrassegna il tessuto connettivo A e le colorazioni blu per i glicosaminoglicani. In tempo reale. La PCR viene utilizzata per quantificare la differenziazione delle cellule staminali incapsulate Dopo aver sottratto il background, il livello di espressione di un gene di interesse è determinato dal numero di ciclo in cui è stata raggiunta la fluorescenza di soglia rispetto a un segnale di riferimento passivo, che è un gene di housekeeping costitutivamente attivo. Quindi ti abbiamo appena mostrato come incapsulare le cellule in idrogel 3D e studiare il comportamento delle cellule nei gel.

Quando si utilizzano queste procedure, è importante garantire la completa sterilità dei materiali, mantenendo soluzioni tampone e reagenti sterili a lungo termine o sterilizzandoli con la lampada UV germicida. Quindi questo è tutto. Grazie per il lavaggio e buona fortuna con i tuoi esperimenti.