Non invasiva In Vivo Piccoli Animali MRI e MRS: Basic procedure sperimentali

Per iniziare questo esperimento, un topo anestetizzato viene posizionato su un supporto per animali che successivamente viene inserito in una bobina a radiofrequenza o bobina RF. Prima di un esperimento di risonanza magnetica (MRI) o spettroscopia (MRS), la bobina RF viene quindi accordata alla frequenza di risonanza e adattata a un'impedenza caratteristica di 50 ohm. Successivamente, si esegue l'acquisizione MRI o MRS dopo aver ottimizzato la sequenza di impulsi; infine, le immagini o gli spettri vengono analizzati mediante programmi di analisi.

Ciao, sono Dawn Lee del laboratorio di ricerca R del dipartimento di Radiologia dell'Università di Washington. E io sono David Senek, anch'io del laboratorio di ricerca R e dei dipartimenti di radiologia e bioingegneria dell'Università di Washington. Oggi vi mostreremo una procedura per la risonanza magnetica e la spettroscopia mediante risonanza magnetica nei topi.

Nel nostro laboratorio, utilizziamo queste procedure per studiare modelli tumorali murini, distrofia muscolare e metabolismo muscolare. Cominciamo dunque. Questo protocollo non ha lo scopo di coprire ogni aspetto della risonanza magnetica e spettroscopia per piccoli animali (M-R-I-M-R-S), ma piuttosto di introdurre le procedure di base degli esperimenti di M-R-I-M-R-S nei topi.

L'obiettivo è fornire una comprensione più approfondita delle procedure di base per esperimenti di risonanza magnetica in vivo su piccoli animali, in modo che i ricercatori nuovi nel campo della risonanza magnetica possano pianificare meglio le componenti non MR dei loro studi. In questo modo, alla fine, le procedure MR e quelle non MR potranno essere integrate in modo fluido. Per iniziare i preparativi per l'esperimento di risonanza magnetica, o MRI, posizionare un topo anestetizzato con isoflurano su un supporto per animali, inserendo il suo muso in un cono nasale.

Un dispositivo di fissaggio della testa può essere utilizzato per l'imaging della testa e un supporto per il corpo può essere utilizzato per l'imaging del corpo. Mantenere gli occhi dell'animale umidi con un unguento lubrificante oculare sterile.

L'animale deve essere mantenuto a una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius durante l'esperimento, all'interno di un sistema di circolazione di acqua calda. Un sistema di monitoraggio animale viene utilizzato sia per controllare la temperatura corporea, la respirazione e il ciclo cardiaco, sia per sincronizzare la respirazione e la sincronizzazione cardiaca con le acquisizioni delle immagini. Successivamente, posizionare un campione standard di agar accanto all'animale per monitorare bruschi cambiamenti del segnale.

Questo campione agricolo standard è particolarmente utile per l'acquisizione di immagini multi-slice e multi-temporale. Quando si rileva un cambiamento imprevisto del segnale in una sezione delle immagini acquisite, la sezione può essere eliminata. Una volta che l'animale è al sicuro e tutti i componenti di monitoraggio sono posizionati, posizionare il supporto per l'animale al centro di una bobina a radiofrequenza o bobina RF.

Spostare la bobina RF nella stanza del magnete e inserirla nel sistema di circolazione di acqua calda posizionato all'interno del magnete. Iniziare ora l'acquisizione dei dati di risonanza magnetica. Durante il periodo di acquisizione delle immagini, regolare il flussimetro tra 0,4 e 0,8 millilitri al minuto e ridurre il vaporizzatore di isoflurano al 1,2-1,5%. Il gas espirato proveniente dal cono nasale del topo viene aspirato in un sistema di vuoto interno.

Per ottimizzare la ricezione del segnale, regolare la bobina RF alla frequenza di risonanza del protone H¹ e adattare l'impedenza caratteristica della bobina a 50 ohm. Utilizzando il pannello di taratura nello scanner MR, la maggior parte degli scanner MRI per uso umano non richiede un processo separato di adattamento dell'impedenza, tranne nelle procedure di spettroscopia RM (MRS). Iniziare lo shimming utilizzando una singola sequenza a impulsi.

Il processo di shimminazione ottimizza l'omogeneità del campo magnetico nella regione di interesse. Ogni scanner ha un proprio metodo per eseguire il processo di shimminazione, inclusi processi automatici di shimminazione rapida, come la mappatura rapida e la shimminazione del gradiente. Al termine della shimminazione, ottimizzare l'impulso RF.

Massimizzando il profilo dell'immagine unidimensionale, è possibile variare le potenze degli impulsi RF mantenendo costante la durata dell'impulso e garantendo un ritardo di riciclo sufficientemente lungo. Il TR dovrebbe essere approssimativamente da tre a cinque volte il valore di T1 del tessuto; acquisire immagini preliminari lungo tre orientamenti ortogonali per ottenere immagini assiali, coronali e sagittali.

Una sequenza di acquisizione immagini rapida può essere utilizzata per acquisire le immagini preliminari. Le immagini acquisite verranno utilizzate per pianificare l'effettiva acquisizione, determinando i piani di imaging. Durante l'acquisizione effettiva, viene utilizzata una sequenza a eco di spin.

Due misurazioni possono essere effettuate utilizzando un'immagine a eco multiplo o un'immagine a eco singolo con diversi valori di T. Una volta completato l'esperimento di risonanza magnetica, esaminiamo la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo, o MRS, per il muscolo scheletrico dell'arto posteriore del topo, a riposo e con produzione mitocondriale massimale. La produzione di ATP può essere determinata mediante MRS misurando le variazioni del fosfocreatina durante e immediatamente dopo l'ischemia.

Cominciare costruendo una cuffia per indurre un'ischemia reversibile. Prendere un pezzo di tubo in PVC largo circa cinque-sette millimetri con un diametro interno di 12-15 millimetri. Praticare un piccolo foro attraverso la parete, quindi tagliare un pezzo di un palloncino in modo che sia aperto su entrambe le estremità.

I palloncini di qualità in elio funzionano meglio. Inserire questo pezzo attraverso il tubo in PVC e avvolgerlo nuovamente all'indietro. Fissare i capi insieme sulla parete esterna del tubo in PVC.

Successivamente, utilizzare un film termoretraibile per sigillare le estremità del palloncino intorno al tubo. Si otterrà un manicotto con una parete esterna solida e una parete interna gonfiabile. Tagliare una sezione di film termoretraibile e del palloncino nella zona del foro filettato.

Avendo cura di lasciare abbondante materiale tra il foro e il bordo del pezzo in PVC, inserire un tratto di 1,5 centimetri di metallo non ferroso nel foro del PVC. Questo permetterà di gonfiare la cuffia. Sigillare la zona con una resina epossidica a presa rapida (5 minuti).

Ora fissare il manicotto accanto alla bobina RF nella sonda MRS e collegarlo a un manometro esterno per il segnale del polso. Posizionare quindi un topo anestetizzato supino sul supporto per topo all'interno della sonda MRS.

Posizionare il palloncino riempito di liquido sul lato ventrale del mouse e fissarlo con le cinghie di supporto per il mouse. Inserire il mouse e il supporto corporeo nella sonda MRS. Far passare una delle zampe posteriori attraverso il manicotto ischemico e la bobina MRS.

La gamba deve essere posizionata al centro della bobina il più possibile. Questa disposizione permette di posizionare orizzontalmente il corpo dell'animale. All'interno di un magnete con foro verticale, inserire il corpo della sonda nel magnete, sintonizzare, adattare e shimare per ottimizzare il rapporto segnale-rumore della spettroscopia di risonanza magnetica (MRS), come descritto per la risonanza magnetica (MRI), con l'eccezione che nella MRS l'impulso a radiofrequenza viene ottimizzato massimizzando l'ampiezza dello spettro.

Ora utilizzare la spettroscopia MRS con P 31 ad alto rapporto segnale-rumore, completamente rilassata, o FRS per determinare i rapporti tra fosfato inorganico e fosfocreatina rispetto a TP in condizioni completamente rilassate. Per eseguire un esperimento ischemico, raccogliere innanzitutto gli spettri a riposo per circa cinque minuti. Indurre quindi l'ischemia gonfiando il manicotto a 270-300 millimetri di mercurio per 10-12 minuti.

Rilasciare il manicotto e raccogliere gli spettri di recupero per cinque minuti. Gli esperimenti possono essere ripetuti nei giorni successivi. Ora mostreremo alcuni risultati rappresentativi di MRI e MRS in vivo.

Il topo nudo presenta un tumore cerebrale D 2 82 in xenotrapianto sul dorso ed è stato sottoposto a imaging mediante una sequenza convenzionale a eco di spin con diversi effetti di rilassamento. Nell'immagine pesata in T uno, il tumore appare con un'intensità simile a quella del tessuto adiacente. Mentre nell'immagine corrispondente in T due il tumore è chiaramente visibile come una regione iperintensa.

L'acquisizione multieco consente il calcolo di una mappa T2 contenente informazioni quantitative sulla variazione del tempo T2 nel corpo dell'animale. Le variazioni regionali di T2 nella zona del tumore possono essere monitorate longitudinalmente sull'immagine sovrapposta. Qui viene mostrato uno spettro di risonanza magnetica del fosforo-31 (P31 MRS) completamente rilassato proveniente dall'arto posteriore di un topo.

Questo spettro rappresenta 16 fis sommati. L'ordine dei picchi da sinistra a destra rappresenta i seguenti metaboliti muscolari: fosfato inorganico pi, fosfo, creatina, PCR e i fosfati di ATP gamma, alfa e beta. Spettri MRS di P-31 raccolti durante l'esperimento dinamico di ischemia e ri-perfusione mostrano che durante l'ischemia la PCR diminuisce e il PI aumenta. La velocità di riduzione della PCR durante l'ischemia è pari alla produzione mitocondriale di ATP a riposo.

Il recupero della PCR dopo l'ischemia può essere utilizzato per calcolare la produzione massima di ATP mitocondriale. Abbiamo appena mostrato come acquisire immagini in vivo di topi e misurare il metabolismo muscolare in vivo nei topi mediante spettroscopia di risonanza magnetica e imaging a risonanza magnetica. Per la spettroscopia di risonanza magnetica, abbiamo realizzato una sonda RF personalizzata che permette di mantenere il corpo del topo in posizione orizzontale all'interno di un magnete con foro verticale.

Pertanto, questi esperimenti possono essere eseguiti su qualsiasi sistema verticale con ampio diametro. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni operative, come un migliore accordo e sintonizzazione della bobina RF e un miglioramento del flusso del campo magnetico. È inoltre fondamentale monitorare le condizioni dell'animale mediante un sistema di monitoraggio per mantenere uno stato fisiologico stabile e prevenire eventuali misurazioni artefattuali.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.