Name: Non invasiva In Vivo Piccoli Animali MRI e MRS: Basic procedure sperimentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Impara le procedure di base per la risonanza magnetica e la spettroscopia in vivo su piccoli animali. Questo metodo ottimizza le tecniche di imaging per analizzare processi biologici nei modelli murini.

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Questo studio è stato sostenuto in parte dal NIH / NIBIB R21EB008166 di DL e NIA AG028455 e NIA AG022385 per DJM. Ringraziamo il dottor James Olson presso il Centro di Fred Hutchinson Cancer Research per aver fornito loro i topi D282 tumore.

Parte 1: Sicurezza Magnete Sia MRI e MRS usare un forte campo magnetico, che richiede estrema cautela. Ad esempio, il 4,7 T strumento che abbiamo usato per il presente lavoro ha un campo magnetico circa 90.000 volte il campo magnetico terrestre. Il campo magnetico è sempre, anche quando lo scanner RM non è in uso. Oggetti metallici che entra in contatto con un campo magnetico ad alta sarà fortemente e rapidamente attratto dalla calamita. E &#39;estremamente pericoloso se un soggetto sperimentale o operatore si trova nel percorso del proiettile di un oggetto metallico volare nel magnete. Pertanto, il personale che condurre esperimenti MR deve fare attenzione a rimuovere oggetti metallici dai loro vestiti prima di entrare nella vicinanza dello strumento e anche mantenere l&#39;ambiente circostante libero da tali oggetti. Informazioni più dettagliate sulla sicurezza magnete appare nella letteratura 1 e la seguente pagina web: <a href="http://www.imrser.org/">http://www.imrser.org/</a> . La presenza di materiale metallico non può che causare il problema di sicurezza di cui sopra, ma interferiscono con i risultati sperimentali inducendo immagini / artefatti spettroscopiche. Il presente materiale metallico vicino o dentro l&#39;oggetto di imaging possono alterare il campo magnetico in prossimità e quindi generano artefatti sulle immagini acquisite o ampliare la larghezza di riga degli spettri. Di conseguenza, lasciare portafogli, chiavi, penne, ecc al di fuori del magnete se trattare gli animali per le procedure di MR. Parte 2: In Vivo MRI del mouse in un magnete orizzontale Alesaggio Preparazione degli animali per la risonanza magnetica <ol><li> Tutte le procedure animale deve essere approvato dalla cura degli animali e il comitato istituzionale uso (IACUC) prima di eseguire qualsiasi tipo di trattamento degli animali. </li><li> Noi usiamo vaporizzato isoflurano per anestetizzare gli animali per esperimenti di risonanza magnetica. Anestesia degli animali può essere raggiunto da altri anestetici come Avertin (2,2,2-tribromoethanol o TBE) e un cocktail di ketamina e xilazina. Informazioni sul dosaggio di ogni anestetico si trova nella tabella 1. </li><li> Linea di una camera di induzione con plastica tampone assorbente sostenuta (blu o pad mandrino). Posizionare un mouse (o più topi per il multi-mouse imaging) nella camera di induzione. </li><li> Regolare il flussimetro del vaporizzatore per isofluorano 0,8 1,5 L / min. Quindi regolare il vaporizzatore isoflurano al 4% per circa 2 3 minuti. </li><li> Dopo aver raggiunto il piano chirurgico di anestesia (cioè nessuna risposta pizzico tep), posizionare il mouse su un supporto animale con il naso inserito in un cono (o maschera). Un dispositivo di immobilizzazione testa può essere utilizzata per l&#39;imaging testa e un supporto del corpo può essere utilizzato per l&#39;imaging del corpo. </li><li> Detentori degli animali sono usati per impedire il movimento potenziale: ci sono diversi tipi di supporti commerciali. Inoltre, un supporto progettato su misura possono essere fabbricati per soddisfare esigenze speciali di un apparato sperimentale. Per un supporto personalizzato, assicurarsi di utilizzare solo materiale non magnetico. </li><li> Durante il periodo delle immagini, regolare il misuratore di portata a 0,4 0,8 ml / min e ridurre il vaporizzatore per isofluorano 1,2 1,5%. Il gas è scaduta proveniente dal cono del mouse viene raccolto da una pompa e rimosso in un in-house vuoto. </li><li> Gli occhi dell&#39;animale sarà tenuto umido con un unguento sterile lubrificazione dell&#39;occhio. L&#39;animale sarà mantenuto a 35-37 ° C durante l&#39;esperimento all&#39;interno di un sistema di circolazione dell&#39;acqua calda. Altri tipi di fonte di calore può essere utilizzato come pad di riscaldamento e aria calda soffiata nel (RF) bobina a radiofrequenza. </li><li> Un sistema di monitoraggio degli animali è in atto per monitorare la temperatura corporea, la respirazione / ciclo cardiaco, la respirazione e la sincronizzazione / gating cardiaco con acquisizioni di immagini. </li><li> Un campione standard in agarosio si trova accanto all&#39;animale per monitorare il cambiamento brusco del segnale. Questo esempio agar standard è particolarmente utile per il multi-slice e multi-imaging in tempo punto. Quando un segnale inaspettato cambiamento viene rilevato in una fetta dalle immagini acquisite, la fetta con la variazione del segnale inaspettato può essere eliminato. Inoltre, la sua intensità del segnale può essere regolato in base al cambiamento del segnale del campione standard durante la post-analisi delle immagini. </li><li> Dopo la messa in sicurezza degli animali e dei componenti il ​​monitoraggio sul supporto degli animali, la posizione del detentore degli animali al centro di una bobina RF. </li><li> Spostare la bobina RF alla sala magnete e inserire la bobina RF nel sistema di circolazione dell&#39;acqua calda posto all&#39;interno del magnete. La Figura 2 mostra alcune componenti di uno scanner MRI osservato dalla parte anteriore del magnete. </li></ol> Esperimento MRI <ol><li> Sintonizzare la bobina RF alla frequenza di risonanza 1 H e abbinare l&#39;impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm utilizzando il pannello messa nello scanner MR. Questo per ottenere condizioni ottimali di ricezione del segnale. Scanner MRI più umano non richiedono un processo separato in sintonia / match, trannenelle procedure di MRS. </li><li> Condurre un processo di spessoramento utilizzando una singola sequenza di impulsi. Un segnale MR si basa sulla omogeneità ambientale campo magnetico. Il processo di spessoramento consente il campo magnetico nella regione di interesse per essere il più omogenei possibile. Ogni scanner MR ha il suo modo di eseguire il processo di spessoramento, compreso automatico processi veloci spessoramento come mappa veloce e spessoramento gradiente. </li><li> Ottimizzare l&#39;impulso RF massimizzando un profilo dimensionale immagine. RF poteri di impulso può essere schierato, mantenendo costante la lunghezza degli impulsi e una lunga abbastanza TR (ritardo di riciclo) che è di circa 3 - 5 volte il T 1 di tessuto. </li><li> Acquisire esploratore immagini lungo tre orientamenti ortogonali per creare assiale, coronale e sagittale immagini. Una rapida sequenza di acquisizione delle immagini (gradient echo o alla veloce rotazione di imaging echo) può essere utilizzato per acquisire le immagini scout. Le immagini acquisite verranno utilizzati per la pianificazione per l&#39;imaging attuale con determinazione di piani d&#39;immagine. </li><li> Cambia per far girare la sequenza eco. Selezionare i parametri sequenza corretta: TR (ritardo di riciclo), dovrebbero essere tre a cinque volte il tessuto T 1 di acquisire immagini in pieno relax, come la densità protonica o T 2 pesate. TE (tempo di eco) è la durata di tempo tra il primo impulso RF e il centro del segnale eco. Un valore TE possono essere selezionate a seconda del contrasto dell&#39;immagine come riassunto nella tabella 2. La Figura 2 mostra in immagini acquisite in vivo con effetti di rilassamento differenti di T 1, T 2 e T 2 * per un mouse nudo con un tumore xenotrapianto sulla sua schiena. </li><li> T 2 misure può essere fatto sia usando multiecho immagini o immagini eco singola con più valori TE. </li><li> A seguito della MRI / MRS esperimento in vivo, gli animali devono essere monitorati durante il processo di recupero. Dopo la RM, gli animali saranno portati fuori dal bobina RF e monitorati per assicurare il pieno recupero quando tornò alla gabbia. La perdita di calore è rapida nei topi anestetizzati. Tenere gli animali caldo coprendoli con garze o asciugamani e / o fornire una fonte di calore fino a quando gli animali sono recuperati da anestesia. </li></ol> Image Processing <ol><li> Rassegna delle immagini acquisite sulla console MR e il trasferimento dei dati selezionati in una post-elaborazione del computer. </li><li> Usiamo tipicamente ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) per analizzare le immagini. L&#39;analisi delle immagini comprende una scalatura delle immagini / filtro, calcoli di T 1, T 2 e la diffusione, misurazioni del volume del tumore e la segmentazione dei tumori. </li></ol> Parte 3. In Vivo MRS per muscolare degli arti posteriori del mouse scheletrici in un magnete verticale del foro Costruzione di bracciale per indurre ischemia reversibile <ol><li> Inizia con un pezzo di tubo in PVC, che è circa 5-7 millimetri di larghezza con un id di 12-15 mm. Praticare un piccolo foro attraverso la parete di questo pezzo e filo. </li><li> Tagliare un pezzo di pallone ed è quindi aperto a entrambe le estremità (palloncini elio lavoro di qualità migliore). Inserire questo pezzo attraverso il pezzo in PVC e avvolgere intorno e indietro il nastro finisce insieme sulla parete esterna del pezzo in PVC. </li><li> Usa termoretraibile per sigillare il pallone termina attorno al tubo. Si dovrebbe avere un bracciale con un muro solido esterno e una parete interna gonfiabili. </li><li> Tagliare una superficie di termoretraibile e pallone attorno al foro filettato, avendo cura di lasciare un sacco di materiale tra il foro e il bordo del pezzo in PVC. Pezzo di filo di 1,5 cm di metalli non ferrosi (ottone ad esempio) nel foro in PVC. Ciò consente di gonfiare il bracciale. Sigillare l&#39;area con 5 minuti epossidica. </li><li> Risolvere il bracciale al posto accanto alla bobina RF nella sonda MRS e connettersi a un sfigmomanometro esterno. </li></ol> Respirazione Monitor personalizzati <ol><li> Noi utilizziamo un monitor personalizzati respirazione fatto che è fatto per essere compatibile con lo spazio ristretto e l&#39;accesso al foro del magnete. Diversi modelli commerciali sono inoltre disponibili. </li><li> Legare un palloncino alla fine del tratto tubi resistenti immessa nella sonda. </li><li> Collegare l&#39;altra estremità del tubo di un trasduttore di pressione. </li><li> Assicurarsi che la linea di pallone e sono privi di bolle d&#39;aria. Le bolle si attenua il segnale dalla compressione del pallone a causa del movimento del corpo del mouse grazie alla respirazione. </li></ol> Posizionamento del mouse in MRS Probe <ol><li> Anestetizzare il mouse con il 5% Avertin (0,010 ml / g di peso corporeo). </li><li> Dopo aver raggiunto il piano chirurgico di anestesia, posizionare il mouse nella sonda MRS posizionando il mouse su le spalle al supporto per il mouse. Collocare il palloncino pieno di liquido sul lato ventrale del mouse e fissarlo in posizione con cinghie di supporto per il mouse. </li><li> Posizione del mouse e il supporto del corpo nella sonda MRS. </li><li> Tirare uno degli arti posteriori attraverso il bracciale ischemico e la bobina MRS. La gamba deve essere centrato nella bobina come much possibile. Questa disposizione permette al corpo del mouse per essere posizionato orizzontalmente in un magnete verticale foro (Figura 3). </li><li> Fissare una gamba in posizione da taping piedi supporto rigido. </li><li> Luogo termocoppia per via sottocutanea nella arti posteriori di fuori della regione campionati dalla bobina. </li><li> Inumidire gli occhi con l&#39;unguento lubrificante occhio per evitare che gli occhi si asciughi. Coprire gli occhi del mouse e volto a evitare lo sfregamento o irritazione dalla parete della sonda. </li><li> Sonde di monitoraggio di altri possono essere aggiunti a seconda delle esigenze specifiche dell&#39;esperimento. </li></ol> Impostazione Esperimento MRS <ol><li> Collegare il flusso d&#39;aria per elemento riscaldante sulla sonda MRS. </li><li> Impostare la variabile di unità di controllo della temperatura sul software VNMR per mantenere la temperatura della gamba a 35-37 ° C. </li><li> Sintonizzare la frequenza e l&#39;impedenza della bobina match usando il pannello di regolazione nel software MRS sia per 1 H e 31 risonanze P. </li><li> Regolare spessoramento circuiti per ottimizzare l&#39;omogeneità del campo magnetico B1 nella regione di interesse utilizzando 1 spettroscopia H. </li><li> Passa a 31 frequenze P per determinare la durata degli impulsi del segnale RF per produrre il massimo da un decadimento di induzione libero (FID) (90 tempo °). </li><li> Raccogliere segnale alto a spettri di rumore in pieno relax (FRS) per determinare i rapporti di fosfato inorganico (P i) e fosfocreatina (PCr) di ATP in condizioni di pieno relax. Questi spettri sono raccolti con il tempo di 90 ° con il tempo tra le acquisizioni FID (TR) di circa 5 volte il T 1 di PCr (20 sec. Alle 7 T). Questi saranno utilizzati per la quantificazione della PCR e di P i livelli di MR spettri. </li></ol> Esperimento ischemica <ol><li> Una perturbazione semplice ischemico consente la determinazione di riposo e la massima produzione di ATP mitocondriale misurando i cambiamenti nella fosfocreatina durante e immediatamente dopo l&#39;ischemia. </li><li> Set-up serie di raccogliere spettri multipli usando un 45 ° larghezza di impulso (ovvero 0,5 x il 90 ° tempo) e un TR di 0,5 x T 1 (~ 1,5 sec.). Noi di solito raccogliere 4 FID per ogni spettri (numero di media (na) = 4 in VNMR software) per una risoluzione temporale di circa 6 secondi. Questa risoluzione del tempo è sufficiente per determinare con precisione il riposo e la massima produzione di ATP mitocondriale. </li><li> Raccogliere spettri di riposo per circa 5 minuti. </li><li> Indurre ischemia gonfiando il bracciale a 270-300 mmHg per 10-12 minuti. </li><li> Rilasciare il bracciale e raccogliere spettri di recupero per 5 minuti. </li><li> Rimuovere la sonda dal magnete e il mouse dalla sonda. Lasciare che il mouse per recuperare da anestesia in condizioni adeguate. Gli esperimenti possono essere ripetuti nei giorni successivi. Dopo la finale muscoli del mouse spettroscopia esperimento gambe sono immediatamente rimossi e gelo-bloccato in N 2 liquido per l&#39;analisi delle concentrazioni di ATP mediante HPLC. </li></ol> Analisi dei dati <ol><li> I dati vengono analizzati in linea con uno dei vari programmi di analisi spettrale per spettri NMR. Il nostro laboratorio utilizza in genere idonei a norma 2 e jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) per quantificare aree dei picchi. </li><li> Iniziale i tassi di guasto PCr durante l&#39;ischemia sono una misura della produzione di ATP mitocondriale in condizioni normossia come descritto in diversi documenti 3-5. PCr tassi di recupero possono essere utilizzati per determinare la capacità massima per la produzione di ATP mitocondriale sulla base di un approccio descritto in precedenza 4,6. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig1.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" /></a> Figura 1. Risonanza magnetica in vivo configurazione vista dal lato anteriore del magnete. La configurazione comprende una bobina di RF, il riscaldamento del sistema animale (o sistema di circolazione dell&#39;acqua calda) e inserire gradienti. Tutti questi componenti sono inseriti in un magnete orizzontale. L&#39;acqua calda è riscaldata in un serbatoio d&#39;acqua al di fuori della sala magnete e introdotto nel sistema di riscaldamento degli animali attraverso un tubo Tygon (nastro verde). Dopo aver circolato nel cilindro, l&#39;acqua viene estratta dal sistema di riscaldamento al serbatoio d&#39;acqua da riscaldare. Un tubo isoflurano ed il tubo a vuoto sono usate per anestetizzare topi durante gli esperimenti di risonanza magnetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig2.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /></a> Figura 2 Nelle immagini in vivo per un topo nudo con tumore xenotrapianto (D282 tumore) sulla schiena (freccia) con diversi effetti di rilassamento:. A. T 1 pesato immagine (TR / TE = 500/14.2ms). B. T 2 pesate immagine (TR / TE = 2s/40ms). Entrambe le 2 immagini T 1 e T ponderate sono stati acquisiti dalla sequenza di spin echo. C. T mappa 2 trattati con 4 serie di immagini acquisite da DIFvalori diversi TE da 20 a 80 ms. D. T 2 * immagini pesate (TR / TE = 180/7.39ms, angolo di capovolgere = 20 gradi), acquisito dal sequenza gradiente eco. Campo visivo di 35 x 35 mm 2 è per tutte le immagini MR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig3.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" /></a> Figura 3. Illustrazione del mouse posizionato nel supporto corpo orizzontale con gamba fissata in bobina RF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig4.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" /></a> Figura 4. In vivo 31 P spettri attraverso un ciclo di ischemia riperfusione. I dati sono stati raccolti su un magnete 7 T foro verticale e la linea ampliato con un filtro a 20 Hz esponenziale. TR = 1, na = 4, ogni spettri 20 sono tracciati. Tabella 1. Dosaggio di anestetico per mouse MRI / MRS. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Animale Specie </td><td> Anestetico Agente </td><td> Dose (Mg / kg per iniettabili) </td><td> Percorso </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Gas isoflurano </td><td> 4,0% per 2-3 min (induzione), poi 1,2-1,5% costantemente (manutenzione) </td><td> Inalato attraverso cono </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Avertin </td><td> 5%, il peso corporeo 10ml/kg </td><td> intraperitoneale (IP) </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Ketamina / xylazina </td><td> 100 mg / kg e 10 mg / kg </td><td> IP </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Immagine con ponderazioni relax <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Immagine di ponderazione </td><td> TR (ritardo riciclo) </td><td> TE (tempo di eco) </td></tr><tr><td> T1 </td><td> Breve (meno di T1) </td><td> Breve (meno di T2) </td></tr><tr><td> T2 </td><td> Lunga (3 ~ 5 volte T1) </td><td> Lunga (circa T2) </td></tr><tr><td> PD (densità protonica) </td><td> Lunga (3 ~ 5 volte T1) </td><td> Breve (meno di T2) </td></tr></tbody></table> T1: reticolo di rilassamento di spin (o di rilassamento longitudinale) tempo T2: rotazione di rilassamento di spin (o di rilassamento trasversale) tempo

<ol><li>Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+safety+issues+in+magnetic+resonance+imaging%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol+Med%22%5BJournal%5D)">Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art.</a> Radiol Med. 112, 491-491 (2007).</li>
<li>Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+spectral+analysis+of+kinetic+data+using+natural+lineshapes%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes.</a> Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).</li>
<li>Amara, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+in+vivo%3A+spectroscopy+provides+window+on+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics.</a> Methods. 46, 312-312 (2008).</li>
<li>Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+measures+of+ATP+utilization+and+recovery+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle.</a> J Physiol. 465, 203-203 (1993).</li>
<li>Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+coupling+in+vivo+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).</li>
<li>Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+dependence+of+muscle+phosphocreatine+kinetics+on+oxidative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity.</a> Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).</li>
<li>Sun, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+detection+of+gliomas+by+chlorotoxin-conjugated+superparamagnetic+nanoprobes%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes.</a> Small. 4, 495-495 (2008).</li>
<li>Marcinek, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mitochondrial+coupling+in+vivo+alters+cellular+energetics+in+aged+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle.</a> J Physiol. 569, 467-467 (2005).</li>
</ol>

La pre-acquisizione passi di sintonia / partita e spessoramento sono fondamentali per l&#39;acquisizione ad alta risoluzione spaziale e un elevato rapporto segnale-rumore (SNR). E &#39;anche importante per monitorare le condizioni degli animali con un sistema di monitoraggio degli animali per mantenere uno stato stabile fisiologico degli animali durante acquisizioni segnale a rispettare la movimentazione animale umano e per prevenire qualsiasi misure di potenziale artefatta. Le procedure spiegato nel protocollo può esse...

<table><tbody><tr><td>Inova 200 MR scanner/4.7 T</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td>Utilizzato per la risonanza magnetica in vivo nei topi</td></tr><tr><td>Inova 300 NMR spectrometer/7 T</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td>Utilizzato per la spettroscopia di risonanza magnetica del muscolo scheletrico nei topi</td></tr></tbody></table>

non invasiva in vivo piccoli animali mri e mrs: basic procedure sperimentali

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Piccoli animali risonanza magnetica (MR) la ricerca è emerso come un elemento importante della moderna ricerca biomedica a causa della sua natura non invasiva e la ricchezza di informazioni biologiche che fornisce. MR non richiede alcuna radiazioni ionizzanti e non invasivo in grado di fornire una risoluzione maggiore e migliore rapporto segnale-rumore in confronto ad altri tomografiche o modalità spettroscopica. In questo protocollo, ci concentreremo su piccoli animali RM e spettroscopia RM (MRI / MRS) per l&#39;acquisizione non invasiva relax ponderata<sup&gt; 1</sup&gt; Immagini H di mouse e di ottenere<sup&gt; 31</sup&gt; P spettri del muscolo del mouse. Questo lavoro non tenta di coprire ogni aspetto di piccoli animali MRI / MRS ma piuttosto introduce procedure di base del mouse MRI / MRS esperimenti. L&#39;obiettivo principale di questo lavoro è quello di informare i ricercatori delle procedure di base per<em&gt; In vivo</em&gt; MR esperimenti sugli animali di piccole dimensioni. L&#39;obiettivo è di fornire una migliore comprensione di base di procedure sperimentali per permettere nuovi ricercatori nel campo MR per pianificare meglio per i non-MR componenti dei loro studi in modo che sia MR e non-MR procedure sono perfettamente integrate.

Questo lavoro descrive le procedure di base della risonanza magnetica non invasiva animali piccoli e MRS<em&gt; In vivo</em&gt;.

Non invasiva In Vivo Piccoli Animali MRI e MRS: Basic procedure sperimentali

La ricerca tramite risonanza magnetica (RM) su piccoli animali è emersa come un elemento fondamentale della ricerca biomedica moderna grazie alla sua natura non invasiva e alla ...

Per iniziare questo esperimento, un topo anestetizzato viene posizionato su un supporto per animali che successivamente viene inserito in una bobina a radiofrequenza o bobina RF. Prima di un esperimento di risonanza magnetica (MRI) o spettroscopia (MRS), la bobina RF viene quindi accordata alla frequenza di risonanza e adattata a un'impedenza caratteristica di 50 ohm. Successivamente, si esegue l'acquisizione MRI o MRS dopo aver ottimizzato la sequenza di impulsi; infine, le immagini o gli spettri vengono analizzati mediante programmi di analisi.Ciao, sono Dawn Lee del laboratorio di ricerca R del dipartimento di Radiologia dell'Università di Washington. E io sono David Senek, anch'io del laboratorio di ricerca R e dei dipartimenti di radiologia e bioingegneria dell'Università di Washington. Oggi vi mostreremo una procedura per la risonanza magnetica e la spettroscopia mediante risonanza magnetica nei topi.Nel nostro laboratorio, utilizziamo queste procedure per studiare modelli tumorali murini, distrofia muscolare e metabolismo muscolare. Cominciamo dunque. Questo protocollo non ha lo scopo di coprire ogni aspetto della risonanza magnetica e spettroscopia per piccoli animali (M-R-I-M-R-S), ma piuttosto di introdurre le procedure di base degli esperimenti di M-R-I-M-R-S nei topi.L'obiettivo è fornire una comprensione più approfondita delle procedure di base per esperimenti di risonanza magnetica in vivo su piccoli animali, in modo che i ricercatori nuovi nel campo della risonanza magnetica possano pianificare meglio le componenti non MR dei loro studi. In questo modo, alla fine, le procedure MR e quelle non MR potranno essere integrate in modo fluido. Per iniziare i preparativi per l'esperimento di risonanza magnetica, o MRI, posizionare un topo anestetizzato con isoflurano su un supporto per animali, inserendo il suo muso in un cono nasale.Un dispositivo di fissaggio della testa può essere utilizzato per l'imaging della testa e un supporto per il corpo può essere utilizzato per l'imaging del corpo. Mantenere gli occhi dell'animale umidi con un unguento lubrificante oculare sterile.L'animale deve essere mantenuto a una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius durante l'esperimento, all'interno di un sistema di circolazione di acqua calda. Un sistema di monitoraggio animale viene utilizzato sia per controllare la temperatura corporea, la respirazione e il ciclo cardiaco, sia per sincronizzare la respirazione e la sincronizzazione cardiaca con le acquisizioni delle immagini. Successivamente, posizionare un campione standard di agar accanto all'animale per monitorare bruschi cambiamenti del segnale.Questo campione agricolo standard è particolarmente utile per l'acquisizione di immagini multi-slice e multi-temporale. Quando si rileva un cambiamento imprevisto del segnale in una sezione delle immagini acquisite, la sezione può essere eliminata. Una volta che l'animale è al sicuro e tutti i componenti di monitoraggio sono posizionati, posizionare il supporto per l'animale al centro di una bobina a radiofrequenza o bobina RF.Spostare la bobina RF nella stanza del magnete e inserirla nel sistema di circolazione di acqua calda posizionato all'interno del magnete. Iniziare ora l'acquisizione dei dati di risonanza magnetica. Durante il periodo di acquisizione delle immagini, regolare il flussimetro tra 0,4 e 0,8 millilitri al minuto e ridurre il vaporizzatore di isoflurano al 1,2-1,5%. Il gas espirato proveniente dal cono nasale del topo viene aspirato in un sistema di vuoto interno.Per ottimizzare la ricezione del segnale, regolare la bobina RF alla frequenza di risonanza del protone H¹ e adattare l'impedenza caratteristica della bobina a 50 ohm. Utilizzando il pannello di taratura nello scanner MR, la maggior parte degli scanner MRI per uso umano non richiede un processo separato di adattamento dell'impedenza, tranne nelle procedure di spettroscopia RM (MRS). Iniziare lo shimming utilizzando una singola sequenza a impulsi.Il processo di shimminazione ottimizza l'omogeneità del campo magnetico nella regione di interesse. Ogni scanner ha un proprio metodo per eseguire il processo di shimminazione, inclusi processi automatici di shimminazione rapida, come la mappatura rapida e la shimminazione del gradiente. Al termine della shimminazione, ottimizzare l'impulso RF.Massimizzando il profilo dell'immagine unidimensionale, è possibile variare le potenze degli impulsi RF mantenendo costante la durata dell'impulso e garantendo un ritardo di riciclo sufficientemente lungo. Il TR dovrebbe essere approssimativamente da tre a cinque volte il valore di T1 del tessuto; acquisire immagini preliminari lungo tre orientamenti ortogonali per ottenere immagini assiali, coronali e sagittali.Una sequenza di acquisizione immagini rapida può essere utilizzata per acquisire le immagini preliminari. Le immagini acquisite verranno utilizzate per pianificare l'effettiva acquisizione, determinando i piani di imaging. Durante l'acquisizione effettiva, viene utilizzata una sequenza a eco di spin.Due misurazioni possono essere effettuate utilizzando un'immagine a eco multiplo o un'immagine a eco singolo con diversi valori di T. Una volta completato l'esperimento di risonanza magnetica, esaminiamo la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo, o MRS, per il muscolo scheletrico dell'arto posteriore del topo, a riposo e con produzione mitocondriale massimale. La produzione di ATP può essere determinata mediante MRS misurando le variazioni del fosfocreatina durante e immediatamente dopo l'ischemia.Cominciare costruendo una cuffia per indurre un'ischemia reversibile. Prendere un pezzo di tubo in PVC largo circa cinque-sette millimetri con un diametro interno di 12-15 millimetri. Praticare un piccolo foro attraverso la parete, quindi tagliare un pezzo di un palloncino in modo che sia aperto su entrambe le estremità.I palloncini di qualità in elio funzionano meglio. Inserire questo pezzo attraverso il tubo in PVC e avvolgerlo nuovamente all'indietro. Fissare i capi insieme sulla parete esterna del tubo in PVC.Successivamente, utilizzare un film termoretraibile per sigillare le estremità del palloncino intorno al tubo. Si otterrà un manicotto con una parete esterna solida e una parete interna gonfiabile. Tagliare una sezione di film termoretraibile e del palloncino nella zona del foro filettato.Avendo cura di lasciare abbondante materiale tra il foro e il bordo del pezzo in PVC, inserire un tratto di 1,5 centimetri di metallo non ferroso nel foro del PVC. Questo permetterà di gonfiare la cuffia. Sigillare la zona con una resina epossidica a presa rapida (5 minuti).Ora fissare il manicotto accanto alla bobina RF nella sonda MRS e collegarlo a un manometro esterno per il segnale del polso. Posizionare quindi un topo anestetizzato supino sul supporto per topo all'interno della sonda MRS.Posizionare il palloncino riempito di liquido sul lato ventrale del mouse e fissarlo con le cinghie di supporto per il mouse. Inserire il mouse e il supporto corporeo nella sonda MRS. Far passare una delle zampe posteriori attraverso il manicotto ischemico e la bobina MRS.La gamba deve essere posizionata al centro della bobina il più possibile. Questa disposizione permette di posizionare orizzontalmente il corpo dell'animale. All'interno di un magnete con foro verticale, inserire il corpo della sonda nel magnete, sintonizzare, adattare e shimare per ottimizzare il rapporto segnale-rumore della spettroscopia di risonanza magnetica (MRS), come descritto per la risonanza magnetica (MRI), con l'eccezione che nella MRS l'impulso a radiofrequenza viene ottimizzato massimizzando l'ampiezza dello spettro.Ora utilizzare la spettroscopia MRS con P 31 ad alto rapporto segnale-rumore, completamente rilassata, o FRS per determinare i rapporti tra fosfato inorganico e fosfocreatina rispetto a TP in condizioni completamente rilassate. Per eseguire un esperimento ischemico, raccogliere innanzitutto gli spettri a riposo per circa cinque minuti. Indurre quindi l'ischemia gonfiando il manicotto a 270-300 millimetri di mercurio per 10-12 minuti.Rilasciare il manicotto e raccogliere gli spettri di recupero per cinque minuti. Gli esperimenti possono essere ripetuti nei giorni successivi. Ora mostreremo alcuni risultati rappresentativi di MRI e MRS in vivo.Il topo nudo presenta un tumore cerebrale D 2 82 in xenotrapianto sul dorso ed è stato sottoposto a imaging mediante una sequenza convenzionale a eco di spin con diversi effetti di rilassamento. Nell'immagine pesata in T uno, il tumore appare con un'intensità simile a quella del tessuto adiacente. Mentre nell'immagine corrispondente in T due il tumore è chiaramente visibile come una regione iperintensa.L'acquisizione multieco consente il calcolo di una mappa T2 contenente informazioni quantitative sulla variazione del tempo T2 nel corpo dell'animale. Le variazioni regionali di T2 nella zona del tumore possono essere monitorate longitudinalmente sull'immagine sovrapposta. Qui viene mostrato uno spettro di risonanza magnetica del fosforo-31 (P31 MRS) completamente rilassato proveniente dall'arto posteriore di un topo.Questo spettro rappresenta 16 fis sommati. L'ordine dei picchi da sinistra a destra rappresenta i seguenti metaboliti muscolari: fosfato inorganico pi, fosfo, creatina, PCR e i fosfati di ATP gamma, alfa e beta. Spettri MRS di P-31 raccolti durante l'esperimento dinamico di ischemia e ri-perfusione mostrano che durante l'ischemia la PCR diminuisce e il PI aumenta. La velocità di riduzione della PCR durante l'ischemia è pari alla produzione mitocondriale di ATP a riposo.Il recupero della PCR dopo l'ischemia può essere utilizzato per calcolare la produzione massima di ATP mitocondriale. Abbiamo appena mostrato come acquisire immagini in vivo di topi e misurare il metabolismo muscolare in vivo nei topi mediante spettroscopia di risonanza magnetica e imaging a risonanza magnetica. Per la spettroscopia di risonanza magnetica, abbiamo realizzato una sonda RF personalizzata che permette di mantenere il corpo del topo in posizione orizzontale all'interno di un magnete con foro verticale.Pertanto, questi esperimenti possono essere eseguiti su qualsiasi sistema verticale con ampio diametro. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni operative, come un migliore accordo e sintonizzazione della bobina RF e un miglioramento del flusso del campo magnetico. È inoltre fondamentale monitorare le condizioni dell'animale mediante un sistema di monitoraggio per mantenere uno stato fisiologico stabile e prevenire eventuali misurazioni artefattuali.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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