Name: Vedi storici e dimostrazione di Fisiologia presso la NMJ del Muscolo Opener gamberi di fiume (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Scopri la fisiologia sinaptica nel muscolo opener di gambero di fiume. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche per studiare la trasmissione neuromuscolare e la plasticità sinaptica in vivo.

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vedi storici e dimostrazione di fisiologia presso la nmj del muscolo opener gamberi di fiume

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Qui vi presentiamo alcune delle principali scoperte importanti fatte con l&#39;apertura neuromuscolare (NMJ) preparazione di crostacei e dimostrano che c&#39;è ancora molto da imparare da questa preparazione modello. Nella comprensione della storia si può capire perché ancora oggi questo NMJ offre ancora un parco giochi ricco di rivolgere domande riguardanti la funzione di pre-e post-sinaptica e la plasticità. La vitalità e la facilità di accesso al terminale per intracellulare e extracellulare elettrofisiologia e di imaging sono vantaggi significativi. I meccanismi alla base della modulazione della cinetica vescicolare e la fusione entro i terminali ad alta e bassa resa sono mendicare per le indagini. La preparazione offre anche un sistema verificabile modello di calcolo per le valutazioni e le manipolazioni di esaminare le variabili chiave nei modelli teorici della funzione sinaptica, per esempio la dinamica di calcio durante la facilitazione a breve termine. La complessità sinaptica della zona attiva e la natura statistica di rilascio quantale è anche uno spazio aperto per la ricerca futura sia sperimentale e computazionale.

Il muscolo della gamba opener gambero viene presentato per la sua importanza storica e la versatilità sperimentale nel fenotipo muscolare, la fisiologia e la plasticità sinaptica.

Vedi storici e dimostrazione di Fisiologia presso la NMJ del Muscolo Opener gamberi di fiume

Presentiamo qui alcune delle scoperte fondamentali realizzate con la preparazione della giunzione neuromuscolare (NMJ) dei crostacei e illustriamo che esiste...

I muscoli apripiede ottenuti dalla gamba camminatrice di un gambero, che vengono automatizzati dall'animale. Una volta esposto il muscolo, il pattern di innervazione può essere rivelato mediante diverse procedure di colorazione. Le risposte sinaptiche sotto forma di facilitazione a breve termine vengono facilmente registrate dal muscolo.Un elettrodo macro a macchia focale può essere posizionato direttamente sopra le varicosità identificate lungo i terminali nervosi. Vengono quindi registrate risposte sinaptiche, che possono essere utilizzate per misurare l'efficacia sinaptica a un livello qualitativo da una posizione definita sul terminale. Ciao, mi chiamo Ann Cooper del laboratorio del Dott. Robin Cooper del Dipartimento di Biologia dell'Università del Kentucky.Ciao, sono Robin Cooper. Io e il mio studente vi mostreremo una procedura per dissezionare il muscolo dilatatore del gambero e utilizzarlo per registrare le risposte sinaptiche mediante diversi paradigmi di stimolazione. Utilizziamo queste procedure nel nostro laboratorio per studiare l'efficacia sinaptica e la relazione tra ultrastruttura sinaptica e funzione.Iniziamo. Nel 1879, lo zoologo TH Huxley scrisse un libro intitolato The Crayfish, che ancora oggi è considerato una guida completa alla storia naturale, all'anatomia e alla fisiologia di questo crostaceo. In quel periodo storico, si stava caratterizzando l'innovazione del muscolo apriore nelle zampe del gambero, e studi fisiologici erano già in corso sui muscoli del gambero.In effetti, gli esperimenti sui gamberi di fiume potrebbero essere stati i primi a dimostrare la facilitazione alla giunzione neuromuscolare o NMJ. Il dottor Riche pubblicò la sua ricerca principale nei suoi testi medici, che utilizzava per insegnare agli studenti di medicina la funzione muscolare. Nel corso delle successive decadi, le giunzioni neuromuscolari dei gamberi di fiume furono descritte dal punto di vista anatomico e fisiologico in relazione allo sviluppo della tensione e all'anatomia.Nel 1961, Doodle e Kler dimostrarono la facilitazione nel muscolo apriore dell'astice e mostrarono per la prima volta i fenomeni di inibizione presinaptica e riferirono sulla natura qualitativa della trasmissione sinaptica. In questa giunzione neuromuscolare, nel 1971, Sherman e Edward compirono la scoperta fondamentale che la giunzione neuromuscolare apriore nell'astice presentava una facilitazione a lungo termine o LTF, oltre alla facilitazione a breve termine o SDF.A partire da questo periodo, molti ricercatori si sono concentrati sugli attributi di SDF e LTF utilizzando la giunzione neuromuscolare dell'apripinze del gambero per studiare i meccanismi cellulari. Oggi, il preparato del muscolo apripinze nel gambero viene ancora utilizzato per studiare i fondamenti della trasmissione sinaptica perché è facilmente accessibile e molto resistente rispetto a molti altri. Per ottenere preparati sinaptici, si utilizza la gamba del gambero per dissezione: un gambero lungo tra sei e dieci centimetri viene indotto a automizzare la prima o la seconda gamba ambulacrale stringendo con forza il segmento podomerale dell'Iscu.Questa procedura non uccide l'astice che è stato restituito al suo serbatoio di contenimento. Posizionare la gamba dell'astice su un pezzo di carta da filtro sul piatto del microscopio. Ruotare la gamba finché l'esterno non è rivolto verso l'alto.Questa parte è solitamente quella convessa rivolta verso l'alto. Utilizzare una lametta affilata per intagliare la cuticola fino a quando non viene appena recisa. In questo caso, prestare attenzione a non tagliare troppo in distale nel taglio da dorsale a ventrale, vicino all'articolazione tra il bulbo midollare e il bulbo pilifero.Lasciare provvisoriamente l'esocuticola al suo posto e incidere l'esocuticola con la lama del bisturi a rasoio sulla porzione corretta della dieta, tagliando appena in profondità secondo questo schema per il segmento della dieta appropriata su un lato. Successivamente, ripetere sull'altro lato, collegando i tagli prossimali per evitare di recidere il muscolo apri-chela, mantenendo la lama inclinata verso il muscolo più vicino. Quando si effettua il taglio attraverso l'esocuticola, lasciare temporaneamente l'esocuticola al suo posto.Successivamente, immergere la gamba in soluzione salina per gamberi in una capsula di Petri, con uno strato protettivo spesso un centimetro sul fondo. Inserire un perno nell'angolo dorsale del cordone all'interno dell'incisione della finestra praticata nel meite per mantenere ferma la preparazione con pinzette fini. Sollevare leggermente la cuticola dall'estremit&agrave; distale e, con il rasoio, staccare le fibre del muscolo flessore dalla cuticola in senso distale-prossimale.Quindi sollevare il lembo di cuticola. Una volta sollevata la cuticola, estrarre con attenzione il tendine dalla cavità della gamba e recidere l'AEM all'articolazione tra meite e CARite. Prestare attenzione a recidere solo il tendine e non il nervo principale della gamba, che si trova sul lato interno del tendine.Pinzare il tendine nel punto in cui &egrave; stato reciso con una pinzetta ed estrarre il muscolo flessore sollevandolo in direzione cordale. Il nervo principale della gamba e il muscolo estensore sono ora esposti. Procedere al segmento della dieta appropriata e recidere al livello della dieta appropriata, all'articolazione dattilo-lipidica ditea.Tirare verso il basso e all'indietro il segmento ventrale della dieta appropriata ogni tre mesi, in modo da poter visualizzare i muscoli attaccati alla regione cordale. Tagliare questi muscoli con il rasoio. Fare attenzione a non recidere il ramo nervoso motore che innerva il muscolo apriore.Il muscolo apriore è ora esposto alla soluzione salina. Tornare alla regione più cordale del segmento meite, dove il fascio nervoso della gamba contiene solitamente due fasci nervosi separati. Recidere il fascio dorsale con forbici fini.Quindi afferrare l'estremità tagliata con una pinzetta ed estrarre delicatamente in direzione distale fino a raggiungere circa metà della lunghezza del segmento meite. Questo lungo ramo nervoso contiene il nervo eccitatore dell'apri. Mentre il fascio nervoso più grande contiene il neurone motore inibitorio del muscolo apri.Tagliare il preparato nel segmento meite in modo diagonale, in modo che un ago da insetti possa essere inserito attraverso l'aspetto dorsale del meite. Questo posiziona l'aspetto ventrale del muscolo apriore verso l'alto, in modo che sia rivolto verso l'osservatore. Successivamente, rimuovere le fibre residue del muscolo chiuditore che ostruiscono la vista del muscolo apriore.Premendo le fibre contro la cuticola e fuori dalla cavità, il nervo principale della gamba che corre lungo il muscolo apriore ed entra nel lipide del dattilo può essere delicatamente sollevato con pinzette fini e quindi reciso. Ora il muscolo apriore è esposto senza alcun tessuto che possa ostacolare. Un elettrodo intracellulare o un elettrodo focale di tipo macro-patch per registrare i potenziali postsinaptici eccitatori o EPSP viene posizionato sul preparato del muscolo apriore all'interno di una camera di registrazione appositamente progettata con un elettrodo a suggello in plastica.Il fatto di avere un elettrodo stimolante integrato nella camera evita la necessità di utilizzare un micromanipolatore per posizionare un elettrodo stimolante nel preparato all'interno della vaschetta di registrazione e per posizionare il ramo del nervo contenente il nervo eccitatorio all'interno dell'elettrodo a suggione. Il muscolo apertore è suddiviso in tre regioni generali: distale, centrale e prossimale. Sebbene l'intero muscolo apertore sia innervato da un singolo neurone motore, le giunzioni neuromuscolari presentano differenze strutturali e specificità regionali nelle differenze di efficacia sinaptica.Dato che le fibre più distali sono facilmente delimitabili per garantire coerenza tra i diversi preparati, utilizzeremo la regione distale per questa dimostrazione al fine di ottenere una risposta evocata. L'assone eccitatorio verrà stimolato selettivamente mediante uno stimolatore grass eight eight. La regione distale del muscolo opener viene impalata con un elettrodo intracellulare affilato riempito con cloruro di potassio tre molare.Per la registrazione degli EPSP intracellulari si utilizza un amplificatore modello axon clamp due B e una testa amplificatrice A uno XL lu. La facilitazione a breve termine o vari altri tipi di risposte desiderati possono essere ottenuti variando le condizioni di stimolazione. La STF si ottiene somministrando una serie di 10 o 20 impulsi a intervalli rispettivamente di 10 o 22° al nervo eccitatorio.La frequenza della stimolazione all'interno della serie può essere variata. L'uscita dell'erba è collegata a un'unità di isolamento dello stimolo con il cavo collegato al filo d'argento presente all'interno dell'elettrodo a sifone di plastica. Il cavo è fissato a un filo d'argento nel bagno per registrare direttamente i potenziali postsinaptici eccitatori focali su regioni identificabili del terminale nervoso.Le varicosità sinaptiche vengono innanzitutto visualizzate mediante un colorante fluorescente vitale, il four dye two A SP. Qui verrà utilizzato un elettrodo di registrazione macro-patch realizzato in vetro chix. Il lume dell'elettrodo viene riempito con un mezzo salino di immersione; lavorando al microscopio a fluorescenza, si posiziona il lume di un elettrodo di registrazione macro-patch direttamente sopra una singola varicosità isolata per stimolare il terminale nervoso. Il nervo motore eccitatorio viene stimolato come dimostrato in precedenza.Le risposte qual spontanee, così come quelle evocate, possono essere registrate lungo la serie di varicosità visualizzate abbassando delicatamente il lume dell'elettrodo e sollevandolo successivamente. Su ciascuna varicosità è possibile effettuare un conteggio diretto degli eventi qual utilizzando basse frequenze di stimolazione per ogni risposta evocata. Il numero di eventi qual può essere determinato per una serie di risposte.Il numero totale di eventi qual viene conteggiato al fine di stimare il contenuto medio di qual sulla base di questi conteggi diretti. Un approccio per calcolare il contenuto medio di qual consiste nel prendere il numero totale dei tipi di eventi qual evocati durante la stimolazione e dividerlo per il numero totale di prove di stimolo utilizzando la seguente formula. Qui viene mostrato un insieme di prove ripetitive di stimolazione con 30 impulsi a 40 hertz.Si noti la facilitazione per ogni esecuzione e la risposta media se la stimolazione è aumentata a 60 hertz. Una facilitazione più pronunciata viene osservata durante la registrazione con un elettrodo focale posizionato su una varicosità e stimolando a un hertz. Vengono osservate le risposte qal evocate.Abbiamo appena mostrato come dissezionare il muscolo dilatatore del gambero e utilizzarlo per registrare risposte sinaptiche mediante diversi paradigmi e tecniche di stimolazione. Quando si eseguono queste procedure, è importante ricordare di maneggiare i neuroni con cura, evitando di tirarli eccessivamente o di schiacciarli. Inoltre, quando si posiziona l'elettrodo patch macro focale sulle varicosità visualizzate, è necessario appoggiare delicatamente l'elettrodo su tali varicosità e quindi sollevarlo con cautela.Un altro punto da ricordare è che non si deve esporre la preparazione troppo a lungo alla luce al mercurio, poiché ciò potrebbe danneggiare anche il terminale nervoso. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Scopri la fisiologia sinaptica nel muscolo opener di gambero di fiume. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche per studiare la trasmissione neuromuscolare e la plasticità sinaptica in vivo.

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