Vedi storici e dimostrazione di Fisiologia presso la NMJ del Muscolo Opener gamberi di fiume

Il muscolo della gamba opener gambero viene presentato per la sua importanza storica e la versatilità sperimentale nel fenotipo muscolare, la fisiologia e la plasticità sinaptica.

I muscoli di apertura ottenuti da una zampa di gambero che cammina, che viene automizzata dall'animale. Una volta che il muscolo è esposto, il modello di innovazione può essere rivelato da varie procedure di colorazione. Le risposte sinaptiche sotto forma di facilitazione a breve termine sono prontamente registrate dal muscolo.

Un elettrodo macro focale può essere posizionato direttamente sulle varici identificate lungo le terminazioni nervose. Vengono quindi registrate le risposte sinaptiche, che possono essere utilizzate per misurare l'efficacia sinaptica a un livello di qualità da una posizione definita sul terminale. Ciao, mi chiamo Ann Cooper del laboratorio del Dr.Robin Cooper nel Dipartimento di Biologia dell'Università del Kentucky.

Ciao, sono Robin Cooper. Io e il mio studente vi mostreremo una procedura per sezionare il muscolo apriscatole dei gamberi e usarlo per registrare le risposte sinaptiche con diversi paradigmi di stimolazione. Utilizziamo queste procedure nel nostro laboratorio per studiare l'efficacia sinaptica e la relazione tra ultrastruttura sinaptica e funzione.

Quindi iniziamo. Già nel 1879, lo zoologo H.H. Huxley scrisse un libro intitolato Il gambero, che ancora oggi è considerato una guida completa alla storia della vita, all'anatomia e alla fisiologia di questo crostaceo. In questo periodo storico, l'innovazione del muscolo di apertura nelle zampe dei gamberi veniva caratterizzata e gli studi fisiologici erano già in corso nei muscoli dei gamberi.

In effetti, gli esperimenti sui gamberi potrebbero essere i primi a dimostrare la facilitazione della giunzione neuromuscolare o NMJ. Il Dr.Riche ha pubblicato la sua ricerca principale nei suoi libri di testo di medicina, che ha usato per insegnare agli studenti di medicina la funzione muscolare. Nei decenni successivi, i gamberi sono stati descritti anatomicamente e fisiologicamente per quanto riguarda lo sviluppo della tensione e l'anatomia.

Nel 1961, Doodle e Kler dimostrarono la facilitazione nel muscolo apritore dei gamberi e mostrarono per la prima volta i fenomeni di inibizione presinaptica e riferirono sulla natura qualificata della trasmissione sinaptica. In questa NMJ nel 1971, Sherman e Edward fecero la scoperta fondamentale che l'NMJ di apertura nei gamberi mostrava una facilitazione a lungo termine o LTF. Oltre alla facilitazione a breve termine o SDF.

Da questo periodo in poi, molti ricercatori si sono concentrati sugli attributi di SDF e LTF utilizzando l'NMJ di apertura del gambero per studiare i meccanismi cellulari. Oggi, la preparazione del muscolo di apertura nei gamberi è ancora utilizzata per studiare i fondamenti della trasmissione sinaptica perché è facilmente accessibile e molto resistente rispetto a molti altri. Preparazioni sinaptiche per ottenere la zampa del gambero per la dissezione, un gambero da sei a 10 centimetri di lunghezza corporea viene indotto ad automatizzare la sua prima o seconda zampa mobile pizzicando con forza il segmento del baccello di Iscu.

Questa procedura non uccide il gambero che è tornato nella sua vasca di contenimento. Posizionare la coscia del gambero su un pezzo di carta velina sul tavolino del microscopio. Gira la gamba finché l'esterno non è rivolto verso l'alto.

Questo di solito è il lato arcuato rivolto verso l'alto. Usa una lama di rasoio affilata per incidere la cuticola fino a tagliarla. In questo modello, fare attenzione a non tagliare troppo distalmente sul taglio dorsale a ventrale dal baccello del midollo all'articolazione del baccello di rame.

Lascia la cuticola in posizione per ora con la lama del bisturi del rasoio incidi la cuticola sulla dieta corretta fino a quando non si taglia in questo schema per il segmento della dieta corretta su un lato. Dopodiché, ripeti dall'altra parte, unendo i tagli prossimali per evitare di tagliare il muscolo di apertura, mantieni la lama appoggiata al muscolo più vicino. Quando tagli la cuticola, lascia la cuticola in posizione per ora.

Quindi, immergere la coscia nella soluzione salina dei gamberi in un piatto di dissezione con il rivestimento del davanzale spesso un centimetro sul fondo. Infilare uno spillo nell'angolo cordale dorsale all'interno del taglio della finestra praticato nella meite per tenere fermo il preparato con una pinzetta fine. Sollevare leggermente la cuticola dall'estremità distale e con il rasoio tagliare le fibre del muscolo flessore lontano dalla cuticola in modo prossimale distale.

Quindi sollevare la finestra della cuticola. Una volta sollevata la cuticola, estrarre con cautela il tendine dalla cavità della gamba e tagliare l'AEM in corrispondenza dell'articolazione tra meite e CARite. Fare attenzione a tagliare solo il tendine e non il nervo principale della gamba che si trova sul lato interno del tendine.

Pizzicare il tendine dove è stato tagliato con una pinzetta ed estrarre il muscolo flessore sollevandolo in direzione cordale. Il nervo principale della gamba e il muscolo estensore sono ora esposti. Procedere al segmento della dieta corretta e tagliare alla dieta corretta per l'articolazione dipide dattilica.

Tirare il segmento ventrale della dieta corretta verso il basso e indietro trimestralmente in modo che il muscolo attaccato nella regione cordale possa essere visto. Taglia questi muscoli con il rasoio. Fare attenzione a non tagliare il ramo del nervo motore al muscolo di apertura.

Il muscolo di apertura è ora esposto alla soluzione salina. Ritorna alla regione più cordale del segmento meite dove il fascio nervoso della gamba di solito contiene due fasci nervosi separati. Sezionare il fascio dorsale con le forbici fini.

Quindi raccogliere l'estremità tagliata con una pinzetta e tirare delicatamente distalmente fino a raggiungere circa la metà della lunghezza del segmento di meite. Questo lungo ramo nervoso contiene il nervo eccitatorio di apertura. Mentre il fascio più grande di nervi contiene il motoneurone inibitorio del muscolo di apertura.

Tagliare il preparato nel segmento di meite in modo diagonale in modo che uno spillo per insetti possa essere posizionato attraverso l'aspetto dorsale della meite. Questo posiziona l'aspetto ventrale del muscolo di apertura verso l'alto in modo che sia rivolto verso l'osservatore. Quindi, rimuovi le fibre residue del muscolo più vicino che bloccano la visuale del muscolo di apertura.

Spingendo le fibre contro la cuticola e fuori dalla cavità, il nervo principale della gamba che corre lungo il muscolo di apertura e va nel lipide dattilico può essere sollevato delicatamente con le pinzette sottili e poi tagliato via. Ora i muscoli di apertura sono esposti senza alcun tessuto per entrare nell'onda. Un elettrodo intracellulare o un elettrodo macro focale per richiamare i potenziali eccitatori post-sinaptici o EPSP posizionano la preparazione del muscolo di apertura in una camera di registrazione progettata con un elettrodo di aspirazione in plastica.

Avere l'elettrodo stimolante incorporato nella camera evita di dover utilizzare un micromanipolatore per posizionare un elettrodo stimolante, fissare la preparazione nel piatto di registrazione e posizionare il ramo del nervo che contiene il nervo eccitatorio nell'elettrodo di aspirazione. Il muscolo di apertura è diviso in tre regioni generali, distale, centrale e prossimale. Sebbene l'intero muscolo di apertura sia innovato da un singolo motoneurone, i nj sono strutturalmente diversi e presentano differenze regionali specifiche nell'efficacia sinaptica.

Poiché le fibre più distali sono facilmente demarcate per coerenza tra i preparati, utilizzeremo la regione distale per questa dimostrazione per suscitare una risposta evocata. L'assone eccitatorio sarà stimolato selettivamente da uno stimolatore di erba otto otto. La regione distale del muscolo di apertura è impalato con un elettrodo intracellulare affilato riempito con tre molari di cloruro di potassio.

Un modello di axon clamp due amplificatori B e uno stadio di testa XL lu viene utilizzato per la registrazione di EPSP intracellulari. La facilitazione a breve termine o vari altri tipi di risposte desiderate, possono essere ottenute variando le condizioni di stimolo. L'STF si ottiene somministrando un treno di 10 o 20 impulsi rispettivamente a intervalli 10 o 22 al nervo eccitatorio.

La frequenza di stimolazione all'interno del treno può essere variata. L'uscita dell'erba è collegata a un'unità di isolamento dello stimolo con il cavo collegato al filo d'argento che si trova all'interno dell'elettrodo di aspirazione in plastica. L'elettrocatetere è attaccato a un filo d'argento nel bagno per registrare gli EPSP di qualità focale direttamente su regioni identificabili del terminale nervoso.

Le varicosità sinaptiche vengono visualizzate per la prima volta con un colorante fluorescente vitale quattro coloranti due A SP. Qui verrà utilizzato un elettrodo di registrazione macro patch realizzato in vetro chix. Il lume dell'elettrodo è riempito con un mezzo di balneazione salina che lavora al microscopio a fluorescenza, posizionando il lume di un elettrodo di registrazione macro patch direttamente su una singola varice isolata per evocare il terminale nervoso. Il nervo motore eccitatorio viene stimolato come dimostrato in precedenza.

Le risposte di qualità spontanee, così come quelle evocate, possono essere registrate lungo la stringa di varici visualizzate abbassando delicatamente il lume dell'elettrodo e sollevandolo. Ogni conteggio diretto delle varici degli eventi di qualità è possibile con basse frequenze di stimolazione per ogni risposta evocata. Il numero di eventi di qualità può essere determinato per una serie di risposte.

Il numero totale di eventi di qualità viene conteggiato per poi stimare il contenuto medio di qualità in base a questi conteggi diretti. Un approccio per calcolare il contenuto medio di qualità consiste nel prendere il numero totale nei tipi di eventi di qualità evocati durante la stimolazione e dividerlo per il numero totale di prove di stimolo utilizzando la seguente formula. Qui è mostrata una serie di prove ripetitive di stimolazione di 30 impulsi a 40 hertz.

Notare la facilitazione per ogni corsa e la risposta media se la stimolazione è aumentata a 60 hertz. Una facilitazione più pronunciata si osserva quando si registra con un elettrodo focale su una varicosità e si stimola a un hertz. Si osservano le risposte qal evocate.

Ti abbiamo appena mostrato come sezionare il muscolo apriscatole del gambero e usarlo per registrare le risposte sinaptiche con vari paradigmi e tecniche di stimolazione. Quando si eseguono queste procedure, è importante ricordare di trattare i neuroni con cura e di non tirarli troppo forte o di pizzicarli. Inoltre, quando si posiziona l'elettrodo macro focale sulle varici visualizzate, posizionare leggermente l'elettrodo su tali varici e sollevarlo di nuovo.

Un altro punto da ricordare è che non si vuole esporre il preparato troppo a lungo alla luce del mercurio in quanto ciò potrebbe danneggiare anche il terminale nervoso. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.