Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

Le drosofile sono geneticamente attraenti per le indagini sullo sviluppo e la funzione del cuore e l'attività del pacemaker sottostante. Questa procedura mostra come preparare sia le larve intatte che quelle sezionate e come monitorare la frequenza cardiaca. La preparazione sezionata consente inoltre di registrare potenziali extracellulari o intracellulari per accedere ulteriormente alla funzione dei canali ionici.

Ciao, sono Robin Cooper, un membro della facoltà del Dipartimento di Biologia dell'Università del Kentucky. Oggi i miei studenti, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward e Easter Boku vi mostreranno varie procedure per monitorare la frequenza cardiaca nelle larve di Drosophila. Il seguente metodo sfrenato è chiamato formicaio perché le larve sono visualizzate all'interno di un piano focale.

Per una migliore visualizzazione delle larve, utilizzare un microscopio da dissezione con un obiettivo di base due x e un obiettivo a tubo 0,5 x per la migliore risoluzione spaziale e ingrandimento su un rettangolo di un centimetro per 0,5 centimetri. Fotografie e video possono essere registrati attraverso una fotocamera su una montatura oculare. Per iniziare questo metodo, inserire una larva con un sottile strato di cibo tra due vetrini.

Le guide sono tenute a una distanza da 1 a 1,5 millimetri l'una dall'altra con distanziatori in plastica su tutti e quattro i lati. Inclinare il preparato tra i 20 e i 45 gradi per alcuni minuti per incoraggiare le larve a tenere la testa rivolta verso il basso. Regolare lo specchio del microscopio per il miglior contrasto del cuore o delle due trachee per osservare il battito cardiaco.

Il metodo della colla è un supporto permanente per trattenere le larve su un vetrino. Per iniziare il metodo della colla, posizionare un vetrino coprioggetti pulito sopra un vetrino. Metti una piccola goccia di super colla su un angolo del vetrino coprioggetto.

Quindi, sciacquare le larve con acqua. Per rimuovere il cibo in eccesso, assorbire il liquido con un fazzoletto o l'angolo di un tovagliolo di carta. Una volta che la larva è stata accuratamente risciacquata, raccoglierla delicatamente con una pinzetta pulita e posizionarla sul vetrino lontano dal vetrino coprioggetti al microscopio, orientare le larve sullo stomaco.

Lo stomaco avrà deboli solchi orizzontali che lo costeggiano con sottili peli neri. La parte posteriore delle larve dovrebbe essere rivolta verso l'alto e presenta due strisce da corsa, che sono la trachea. Utilizzando un secondo set di pinzette dedicate esclusivamente alla manipolazione della colla, prelevare una piccola quantità dalla goccia alla fine della barbottina e posizionarla nell'angolo sul lato opposto.

Usa una piccola quantità quanto basta per coprire la testa delle pinzette. Raccogli l'animale e posizionalo sulla colla assicurandoti che rimanga. Stomaco rivolto verso il basso e bocca nera.

I ganci devono essere in corrispondenza o vicino al bordo del vetrino di copertura, ai ganci della bocca e alla spirale marrone. Non toccare la colla. Premere delicatamente sulle larve per appiattirle.

Per applicare una sostanza in esame, è meglio dispensare piccole goccioline con una siringa vicino alla testa della larva. Osservare la frequenza cardiaca contando il numero di volte in cui le spirali pulsano in un minuto. Per osservazioni più lunghe, le larve possono essere alimentate sul posto e inumidite per prevenire la disidratazione per creare una piastra di dissezione utilizzabile al microscopio, utilizzare un bisturi per praticare un foro, due centimetri di diametro al centro di un pezzo di nastro magnetico e attaccarlo a un vetrino.

Utilizzare perni da dissezione che sono stati piegati e incollati a graffette per facilitare il pinning. Durante la dissezione, posizionare un terzo intatto di larve stellate sulla piastra di dissezione. Il lato dorsale verso l'alto della trachea dovrebbe essere visibile attraverso la cuticola.

Posiziona due spilli nelle larve su entrambi i lati dei ganci della bocca e altri due spilli su entrambi i lati delle spirali. Quindi, aggiungi soluzione salina per mantenere umide le larve. Quindi praticare un'incisione orizzontale all'estremità della coccola, seguita da un taglio longitudinale che dovrebbe continuare accanto alle spirali verso la testa dell'animale.

Sollevare un perno dorsale e agganciarlo sotto la cuticola. Usa lo spillo per allargare. Aprire la cavità del corpo.

Ripeti con gli altri tre spilli. Una volta che l'animale è stato bloccato, rimuovere le budella facendo attenzione a non danneggiare la trachea o il cuore. Alcune strutture, tra cui il cervello e alcuni corpi adiposi, sono attaccate al cuore e lo danneggeranno quando vengono rimosse.

Lasciare che il preparato si rilassi in un bagno salino HL per tre o cinque minuti dopo la dissezione, in questo preparato vengono eseguite registrazioni intracellulari e sul campo mentre gli agenti farmacologici vengono applicati direttamente sul cuore. Il tempo totale per questa fase di dissezione è compreso tra tre e sei minuti. Per eseguire la stimolazione elettrica, gli elettrodi focali devono prima essere realizzati per fare in modo che un elettrodo focale faccia passare un elettrodo di vetro su un elemento riscaldante per lucidare a fuoco e per fare una curva graduale di circa 45 gradi, montare un elettrodo focale riempito con soluzione salina HL tre a temperatura ambiente nel manipolatore con la punta rivolta verso il basso.

Assicurarsi che il filo dello stimolatore tocchi la soluzione fisiologica all'interno dell'elettrodo e che lo stimolatore sia spento. Fissare una nuova preparazione per la dissezione cardiaca al microscopio. Posizionare il cavo di messa a terra nella soluzione salina.

Facendo attenzione a non toccare i perni o disturbare la preparazione. Mantenere la messa a fuoco sull'elettrodo mentre si utilizza il manipolatore per spostarlo verso il basso nella soluzione salina. Una volta nella soluzione salina, posizionare la punta dell'elettrodo con il lume piatto contro il cuore e toccarlo leggermente.

Una volta posizionato l'elettrodo, impostare la frequenza dello stimolatore a due hertz con la tensione al minimo. Accendi lo stimolatore. Sintonizzare la frequenza a circa tre hertz e aumentare lentamente la tensione fino a quando il battito cardiaco accelera per adattarsi al ritmo dello stimolatore.

Il ritmo può ora essere manipolato attraverso lo stimolatore. I composti possono essere aggiunti per vedere se influenzano la contrazione o la conduzione elettrica. Per eseguire registrazioni del potenziale di campo, riempire un elettrodo di registrazione macro patch con un mezzo di balneazione e montarlo in un manipolatore su un microscopio composto.

Collegare l'elettrodo a un amplifier e impianto di registrazione. Utilizzare il manipolatore per abbassare il lume dell'elettrodo sul cuore di una preparazione di dissezione fissata al microscopio. Toccare molto delicatamente il cuore con la punta dell'elettrodo.

Le registrazioni sul campo possono ora essere effettuate per registrare i potenziali di campo da un'altra regione del cuore. Sollevare delicatamente la punta dell'elettrodo e spostarla in una nuova area con il manipolatore, quindi ridurre le registrazioni del potenziale del campo della punta. Consentono un monitoraggio preciso della frequenza e della durata dei segnali elettrici nel cuore per misurare i potenziali transmembrana dei miociti larvali.

Innanzitutto, assicurati che il lume di un elettrodo affilato riempito con tre molari di cloruro di potassio sia piatto contro il cuore a un angolo di circa 45 gradi dalla verticale. Una volta posizionato correttamente, toccare delicatamente il cuore con la punta dell'elettrodo e picchiettare la punta in una cella. L'elettrodo può essere riutilizzato se non è rotto.

Le registrazioni intracellulari permettono di misurare le basi ioniche del potenziale d'azione e le forme caratteristiche dei potenziali per esaminare gli effetti delle mutazioni dei canali ionici o dei modulatori dei canali. Quindi vi abbiamo appena mostrato come fare registrazioni cardiache e come prendere i potenziali intracellulari e di campo. È possibile utilizzare queste tecniche per esaminare le alterazioni cardiache, nonché le manipolazioni farmacologiche e le alterazioni genetiche.

Quando si esegue questa procedura, è importante non tirare una struttura correlata al cuore o premere troppo forte con l'elettrodo focale. Anche con il metodo della colla, fare attenzione a non incollare la bocca o la chiusura sferica. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i loro esperimenti.