Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

La tecnologia NanoDrop combina fibre ottiche e tensione superficiale per contenere e misurare piccole quantità di campioni come acidi nucleici e proteine. Una piccola goccia di campione viene pipettata direttamente sul piedistallo inferiore. Un piedistallo ottico superiore innesta quindi il campione per formare una colonna.

Il piedistallo si sposta automaticamente per regolare la lunghezza ottimale del percorso. L'accorciamento della lunghezza del percorso elimina la necessità di eseguire diluizioni per la maggior parte dei campioni proteici, la misurazione avviene in pochi secondi e vengono visualizzati i risultati dello spettro vis. Ciao, sono Lynn Kalhorn presso i laboratori NanoDrop di Thermo Fisher Scientific.

Oggi mostreremo una procedura per determinare la concentrazione di proteine utilizzando un innovativo spettrofotometro a micro volume. Lo spettrofotometro NanoDrop 2000 C utilizza un innovativo sistema di ritenzione del campione che si basa sulla tensione superficiale dei liquidi per trattenere e misurare campioni di microvolume tra due piedistalli ottici senza l'uso di cuvette o capillari. Il campione di micros viene posizionato direttamente sopra la superficie di rilevamento e viene creata una colonna di liquido tra le estremità delle fibre ottiche mediante tensione superficiale.

Questa colonna di liquido forma un percorso ottico verticale. Una lampada flash allo xeno fornisce la sorgente luminosa e uno spettrometro che utilizza un array CCD lineare viene utilizzato per analizzare la luce che passa attraverso il campione. La rimozione dei tradizionali dispositivi di contenimento come le cuvette dal sistema presenta diversi vantaggi.

Per la misurazione sono necessarie quantità molto piccole di campione. La pulizia da uno a due microlitri richiede semplicemente di pulire le superfici ottiche con un panno da laboratorio e la lunghezza del percorso cambia automaticamente in tempo reale durante la misurazione. Inoltre, l'accorciamento della lunghezza del percorso consente la misurazione di concentrazioni più elevate, eliminando efficacemente la necessità di eseguire la diluizione per la maggior parte dei campioni proteici.

Nei casi in cui è necessario un veterinario, come gli studi cinetici, il NanoDrop 2000 C fornisce un'opzione veterinaria nello stesso spettrofotometro. Per questo protocollo, utilizzeremo l'opzione del piedistallo per micro volumi per determinare la concentrazione proteica. Il metodo della proteina A due 80 è applicabile a proteine purificate che contengono residui di triptofano, tirosina e fenilalanina o legami cisteina cisteina diss solfuro e presentano assorbanza a 280 nanometri.

Per iniziare questa procedura, selezionare l'applicazione proteina A two 80 dal menu principale. Se viene visualizzata la finestra di verifica della lunghezza d'onda, assicurarsi che il braccio sia abbassato, selezionare il tipo di campione da misurare dall'elenco a discesa. L'impostazione predefinita è consigliata per la maggior parte delle miscele proteiche sconosciute in cui un'assorbenza equivale a un milligrammo per millilitro.

Se si misura una proteina purificata precedentemente caratterizzata, è possibile inserire il coefficiente di estinzione di massa o il coefficiente di estinzione molare. Per determinare la concentrazione proteica in modo più preciso, scegli le unità di concentrazione dall'elenco a discesa adiacente alla casella con codice colore. Quindi, stabilisci uno spazio vuoto.

Utilizzando un tampone appropriato, è importante utilizzare il tampone in cui è sospesa la proteina. Il tampone utilizzato deve avere lo stesso pH e una forza ionica simile a quella della soluzione campione. A causa della variabilità della tensione superficiale tra le diverse proteine, si consiglia di caricare due microlitri di campioni per garantire la corretta formazione della colonna.

Per caricare, toccare la punta della pipetta a bassa ritenzione sulla superficie inferiore del piedistallo mentre si espelle la soluzione per evitare che la soluzione aderisca all'esterno della punta della pipetta, espellere meno dell'intera quantità di campione per evitare la fuoriuscita e l'introduzione di bolle nel campione. Una volta caricato il campione, abbassare il braccio, fare clic su vuoto. Al termine della tranciatura, rimuovere la soluzione vuota dai piedistalli inferiore e superiore.

Utilizzando un panno da laboratorio asciutto prima di prelevare un'aliquota per la misurazione, è importante assicurarsi che il campione sia omogeneo. Miscelare il campione delicatamente ma accuratamente con un leggero vortice utilizzando un numero di giri medio per evitare l'introduzione di microbolle nel fluido. Immettere un ID campione nel campo appropriato.

Caricare due microlitri del primo campione come mostrato in precedenza per il grezzo, abbassare il braccio e fare clic sulla misurazione Al termine della misurazione, pulire il campione dai piedistalli inferiore e superiore. Utilizzando un panno da laboratorio asciutto, misurare tutti gli altri campioni nello stesso modo utilizzando un'aliquota fresca di due microlitri di campione per ogni misurazione. Una normale salvietta da laboratorio priva di lanugine è spesso sufficiente per pulire i piedistalli ottici tra una misurazione e l'altra.

L'unico solvente incompatibile che non deve essere utilizzato sono le soluzioni di acido fluoridrico e i reagenti contenenti tensioattivi possono rovinare le superfici del piedistallo di misura nel tempo, impedendo la formazione della colonna di liquido del campione. Un appiattimento della gocciolina sul piedistallo inferiore è indicativo del fatto che la superficie ottica diventa inadatta al ricondizionamento. Le superfici del piedistallo le lucidano energicamente con una salvietta da laboratorio oppure il metodo preferito consiste nell'utilizzare il composto per ricondizionamento del piedistallo NanoDrop PR one come indicato.

Se il campione è una soluzione proteica non caratterizzata, un lisato cellulare o un estratto di proteina grezza, si consiglia di utilizzare uno dei metodi colorimetrici preconfigurati disponibili sul NanoDrop 2000 C. Questi metodi colorimetrici includono i saggi BCAP six 60 Bradford e Lowy. Il dosaggio del BCA sarà dimostrato qui. I reagenti necessari per il dosaggio dei BCA sono contenuti nel kit compatibile con l'agente riducente Thermos Scientific Pierce BCA, reagente A, B, C, A, reagente B e albumina sierica bovina.

Utilizzeremo il set di albumina pre-diluita di pierce poiché i nostri standard si riferiscono alla letteratura BCA di pierce per determinare quali standard di dosaggio sono appropriati per la tua circostanza. Per preparare i reagenti, equilibrare prima tutte le proteine sconosciute e gli standard proteici a temperatura ambiente e mescolare accuratamente con un leggero vortice. Utilizzare un numero di giri medio per evitare di introdurre microbolle nel fluido.

Poiché le bolle possono influire negativamente sulle letture. Preparare una quantità sufficiente di reagente di lavoro fresco per gli standard e i campioni da misurare utilizzando un rapporto di 50 a uno tra il reagente A e B.In questo esempio, prepareremo tre millilitri di reagente di lavoro per coprire i cinque standard di riferimento e i sei campioni. Il test BCA regolare copre un intervallo dinamico più ampio e utilizza un rapporto reagente/proteina di 20 a uno, mentre il test micro BCA è più sensibile e ha un intervallo dinamico più ristretto utilizzando un rapporto reagente/proteina uno a uno.

Poiché stiamo eseguendo il normale test BCA, prepareremo un rapporto di 20 a uno tra reagente di lavoro e campione. Aggiungere 190 microlitri di reagente di lavoro a ciascuna provetta con un numero sufficiente di provette per coprire tutti i campioni e gli standard. Quindi, aggiungere 10 microlitri di standard o campione a ciascuna delle provette contenenti il reagente.

Mescolare bene con un leggero vortice. Incubare le provette a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lasciare che le reazioni si equilibrino a temperatura ambiente per circa 10 minuti.

A differenza del metodo della proteina A 2 80, il metodo della proteina BCA richiede la generazione di una curva standard prima di poter misurare le concentrazioni proteiche del campione. Per generare una curva standard, inizia selezionando il metodo BCA proteico dal menu principale. Se viene visualizzata la finestra di verifica della lunghezza d'onda, assicurarsi che il braccio sia abbassato.

Immettere i valori per ogni concentrazione standard nella tabella del riquadro di destra. Il software consente il riferimento e fino a sette standard aggiuntivi. Gli standard di riferimento e/o possono essere misurati in repliche.

Stabilire un pezzo grezzo utilizzando il buffer appropriato. Il bianco per i saggi metrici a colori è generalmente deionizzato. Pipettare due microlitri d'acqua sul piedistallo inferiore e abbassare il braccio.

Fare clic su vuoto. È necessario un solo bianco per coprire tutte le misurazioni successive del riferimento e degli standard. Stabilire il riferimento pipettando un Eloqua da due microlitri di solo reagente funzionante e tampone senza proteine sul piedistallo inferiore.

Abbassa il braccio e fai clic su misura. Nella scheda standard, evidenziare lo standard desiderato e pipettare due microlitri dello standard desiderato sul piedistallo inferiore. Abbassa il braccio e fai clic su misura.

Ripetere il processo per tutti gli standard. Per visualizzare la curva standard, fare clic su Visualizza curva standard. Dopo che tutti gli standard sono stati misurati, fare clic sul pulsante dei campioni.

Immettere l'ID del campione, caricare due microlitri di campione sul piedistallo inferiore e fare clic su misura. Per ogni misurazione deve essere utilizzata un'aliquota fresca di due microlitri di campione. Al termine della misurazione, pulire il campione dai piedistalli inferiore e superiore utilizzando un panno da laboratorio asciutto.

Il risultato viene quindi ottenuto quando la concentrazione finale del campione viene calcolata automaticamente utilizzando la curva standard. Abbiamo appena mostrato due modi per determinare la concentrazione di proteine, sia con una misurazione diretta a due 80 che con un metodo di metrica del colore indiretto, ciascuno utilizzando lo spettrofotometro a micro volume NanoDrop 2000 C. Questo è tutto.

Grazie per l'attenzione.