Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

La prima cosa che facciamo è prendere una T 25 confluenta di umsl. Quindi la laverò con PBS e aggiungerò alcune gocce di TR, lasciando agire per alcuni minuti. Posso vedere che le cellule si stanno staccando dalla piastra. È praticamente pronta.

Ok, ora procederò a raccogliere le cellule oculari trattate con tripsina e sarà utile agitare leggermente il contenitore per disperdere le cellule oculari trattate con tripsina, rompendo così le colonie cellulari, e quindi trasferirle sulla piastra UN. Questa rimarrà nell'incubatrice per circa 30-45 minuti. Ora centrifugerò semplicemente queste cellule per raccoglierle e provvederò a rimuovere il soprannatante.

Quindi, tra qualche minuto ricostituirò il campione in modo da poter effettuare il conteggio. Ho ricostituito il campione, ora ho effettuato il conteggio ed estraggo un'aliquote che diluirò a 50 ml, ottenendo così la concentrazione appropriata per avere cento cellule per goccia, al fine di verificare che le cellule siano in buone condizioni. Ora abbiamo un serbatoio.

Dare a questi un leggero movimento rotatorio ancora, quindi versarli nel nostro serbatoio. Ok, quindi è già programmato. Ecco fatto.

Ora è piuttosto dritto. Giratelo e mettetelo da parte. Ogni paio di piastre, inclinatelo leggermente in modo che il liquido si muova un po' all'interno.

Ok, quindi sono cinque piastre. Ora le metto semplicemente nell'incubatrice. Queste sono le gocce sospese che abbiamo preparato due giorni fa.

Pertanto, per raccogliere, si agitano semplicemente le piastre per raccogliere le gocce. Raccoglierò tutto, cercando di farlo delicatamente per non alterare troppo gli EV, e preleverò cinque o sei porzioni di PBS per lavare semplicemente le piastre. Successivamente, lasceremo riposare il tutto per almeno 10 minuti, durante i quali gli EV si depositeranno per gravità.

Dopo aver verificato visivamente che i vostri EBS si sono depositati, rimuovete la maggior parte del supernatante, ma non tutto, perché non volete disturbare il campione. Ok. Ok, quindi a questo punto li si agita fino al sesto giorno. Questi sono corpi embrionali preparati sei giorni fa da cellule staminali embrionali murine e solitamente, per raccoglierli, si agita leggermente le piastre.

Quando si agita delicatamente le piastre, gli eds tendono a raccogliersi al centro della piastra, rendendo più semplice il loro posizionamento. A questo punto si lasciano sedimentare gli eds per gravità sul fondo del tubo, quindi si rimuove il mezzo e si effettua un lavaggio con 10 mil, da 10 a 12 mil di PBS. Ok, ora lasciamo riposare questi, un attimo.

Ora rimuoverò semplicemente il P. Aggiungiamo 250 microlitri della nostra miscela enzimatica e aggiungiamo un millilitro, quindi li poniamo in un bagno d'acqua a 37 gradi. Di tanto in tanto, forse un paio di volte, passerò a dar loro una leggera scossa per mescolarli, poiché gli Ed si sono depositati. Ora abbiamo questo buffer di dissociazione cellulare privo di enzimi che otteniamo semplicemente da gpro.

Aggiungeremo circa otto millilitri di questo prodotto a ogni provetta. Poi procederemo con un pipet da cinque millilitri, eseguendo diverse aspirazioni e dispersioni: man mano che si ripete l'operazione, la sospensione diventerà molto torbida. Questo è un indicatore visivo del fatto che le cellule si stanno disperdendo nel mezzo, rendendolo appunto molto torbido. Ora procederò al conteggio cellulare mediante esclusione del tripano; se si intende effettuare un'infezione o calcolare un MOI, è molto importante eseguire il conteggio.

Quindi preparerò semplicemente un grande lotto di virus, più mezzo, più cellule alla concentrazione appropriata, più solfato di proteina. E poi mi assicuro nuovamente che le cellule non si depositino; sono sempre molto attento a questo aspetto. Inoltre uso un volume ridotto e cerco di fare attenzione a non provocare troppi schizzi durante la centrifugazione a 2.500 g.

Quindi sto raccogliendo le nostre cellule del giorno 10, che ho conservato tutti i lavaggi. In precedenza utilizzavo il PI per l'ioduro di propidio, ma il sette non è altrettanto brillante. E quindi non si sovrappone a molti canali, risultando molto più pulito.

Ora otteniamo semplicemente la variabile, ed è un buon modo per prevenire la perdita nell'ago a causa del volume. Sono Shannon McKinney Freeman. Sono ricercatrice postdottorato presso il laboratorio di George Families Life Attorney all'Ospedale Pediatrico di Boston.

Oggi illustreremo come ottenere una popolazione di cellule trapiantabili da cellule staminali embrionali di topo, trapiantabili e con attività ematopoietica. Perché eseguiamo questo esperimento? Sappiamo che, utilizzando questo sistema, possiamo ottenere – innanzitutto, il protocollo definitivo è stato sviluppato proprio allo scopo di ricavare una popolazione di cellule da cellule staminali embrionali – cellule dotate di attività di cellule staminali ematopoietiche, nel senso che sono in grado di salvare topi da una radiazione letale, di ricostruire il loro sistema ematopoietico per un lungo periodo, per tutta la durata della vita dell'organismo e in tutte le linee cellulari del sangue periferico.

Per questo motivo è stato sviluppato il protocollo. Ora stiamo conducendo ulteriori esperimenti per comprendere il fenotipo della popolazione di cellule all'interno di questa popolazione espansa che deriviamo e che effettivamente media l'attività delle cellule staminali ematiche. Poiché non lo sappiamo: sappiamo che la popolazione è molto eterogenea e sappiamo che la cellula che effettivamente salva i topi è estremamente rara all'interno di questa popolazione cellulare.

Stiamo quindi cercando di definirne fondamentalmente il fenotipo, in modo da poterlo purificare da queste cellule molto eterogenee. Successivamente, siamo particolarmente interessati a comprendere come si confronti funzionalmente con una cellula staminale ematopoietica autentica, che potrebbe essere ottenuta dal midollo osseo intero. Possiede una capacità di ricostruzione equivalente dal punto di vista dello sviluppo? Sembra riflettere una cellula staminale ematopoietica del midollo osseo adulto?

O forse potrebbe assomigliare di più a una cellula staminale ematopoietica. Potreste trovare uno sviluppo precoce, ad esempio, nel GM o nel fegato fetale. Ecco cosa stiamo cercando di comprendere, e vogliamo rispondere a queste domande perché, in ultima analisi, vorremmo applicare queste informazioni a un protocollo che possa guidare lavori simili che siamo interessati a condurre con cellule staminali embrionali umane.

E riteniamo che le informazioni che otteniamo con il sistema matematico, beh, gioveranno notevolmente a quegli esperimenti futuri. Credo ci siano un paio di aspetti. Prima di tutto, è semplicemente un buon modello in vitro, un buon modello sperimentale dello sviluppo.

Stiamo quindi cercando di comprendere, innanzitutto, lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. Si tratta di un sistema ideale, molto semplice, per esprimere in modo ectopico geni e osservare come questi influenzino lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. Questo approccio risulta pertanto molto utile dal punto di vista della ricerca di base.

Ma in definitiva vogliamo sviluppare una qualche forma di terapia cellulare che potrebbe essere utilizzata clinicamente per ottenere, appunto, cellule staminali metaboliche trapiantabili da cellule umane. Tuttavia, ciò probabilmente richiederà ancora molto tempo. In realtà abbiamo scoperto che la parte più difficile non è tanto l'isolamento delle cellule stesse, ma grazie a esperimenti accurati abbiamo individuato un periodo in cui avevamo difficoltà a far sì che le cellule ricostituissero gli animali riceventi.

E quello che alla fine abbiamo scoperto è che dovevamo prestare molta attenzione all'ablazione dei riceventi perché queste cellule non sono in grado di farlo. Di solito, quando si esegue un trapianto in topi con cellule staminali emopoietiche provenienti dal midollo osseo, si somministrano 10 o 11 gray di radiazioni per ablatare i topi, e le cellule emopoietiche del midollo osseo sono abbastanza capaci da salvare gli animali da tale trattamento. Tuttavia, si è scoperto che questa popolazione di cellule che espandiamo non è in grado di salvare gli animali da un dosaggio così elevato di radiazioni ionizzanti.

Quindi ciò che abbiamo dovuto fare è stato regolare con molta attenzione la dose di irradiazione, prestando particolare attenzione alle dimensioni degli animali, poiché abbiamo osservato che se gli animali erano troppo grandi e si utilizzava la stessa dose, non venivano efficacemente ablazionati. Tuttavia, ancora una volta, se non si irradia a sufficienza gli animali, le cellule non sono in grado di competere con ospiti più resistenti.

Quindi, in realtà, una volta capito che questa era una variabile fondamentale, che rendeva difficile osservare l'attività ab di queste cellule, abbiamo essenzialmente titolato la dose di irradiazione e abbiamo anche capito che l'età e il peso dell'animale sono molto significativi; è stato allora che i nostri esperimenti hanno cominciato a dare risultati molto riproducibili. Quello che abbiamo scoperto è che, se si utilizzano animali di circa 20 grammi, tra 15 e 20 grammi, e li si abla con 9,25 gray, questa sembra essere la dose ideale, che fornisce a queste cellule il vantaggio necessario per ricostituire i topi. Sì, e credo che questa fosse una delle variabili più importanti.

L'altro, altro, altro aspetto significativo riguarda il numero di cellule che si stanno iniettando. Abbiamo anche effettuato la titolazione utilizzando queste particolari condizioni per irradiare il nostro organismo modello. Abbiamo inoltre titolato il numero di queste cellule non frazionate, di questo pool eterogeneo di cellule che stavamo iniettando nei topi.

E abbiamo fondamentalmente scoperto che è necessaria una dose minima di circa 2 milioni a 5 milioni di cellule per salvare gli animali. Se si inietta una quantità inferiore, gli animali non vengono salvati. E credo che questo indichi la rarità, probabilmente, della cellula che effettivamente media il salvataggio all'interno di questo compartimento eterogeneo.

Pertanto, ritengo che le variabili più importanti siano il numero di cellule che si iniettano e l'aver cura che, qualunque modello di trapianto si stia utilizzando, il tubo o la lama vengano applicati in misura sufficiente a fornire alle cellule il vantaggio necessario per la ricostituzione, ma non in modo eccessivo al punto da renderle incapaci di riprendersi. Questi aspetti sono state le variabili principali.