Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Per mappare i siti di legame delle proteine nucleari ribo sui pre mRNA, iniziare con la piastrellatura attraverso la regione designata del prem NNA di interesse in finestre di 30 nucleotidi e sintetizzare gli oligo piastrellati su un array. Gli oligo vengono bolliti dall'array e precipitati con un RNP di interesse. Il pool iniziale totale è etichettato con SCI tre e il pool associato è etichettato con SCI cinque ed entrambi vengono applicati all'array di rilevamento.

L'array viene quindi scansionato e il software di estrazione delle caratteristiche viene utilizzato per interpretare i risultati. Sali. Ciao, sono Kate Watkins del laboratorio del fratello Will Fair nel Dipartimento MCB della Brown University. Oggi vi mostrerò una procedura rapida ed economica per determinare la posizione precisa di un complesso proteico di RNA su prem RA in laboratorio, risintetizzare prem A come un pool di oligonucleotidi sovrapposti.

Questo pool può quindi essere separato in una frazione legata e non legata mediante coimmunoprecipitazione e quindi analizzato da un microarray. Sebbene questa procedura abbia molte applicazioni, la utilizziamo per studiare molteplici fattori di splicing e il loro ruolo e lo splicing alternativo. Quindi iniziamo.

Per iniziare questa procedura, utilizzare il browser del genoma uc SC per scaricare particolari geni, giunzioni di splicing o altre aree di interesse da cui progettare il pool A prem. Seleziona le finestre di interesse, quindi affiancale computazionalmente con una lunghezza di lettura di 30 nucleotidi e una sovrapposizione di 20 nucleotidi in modo che ogni oligo venga spostato di 10 nucleotidi rispetto al precedente. Ora che gli oligo lunghi 30 nucleotidi sono definiti, affiancati ciascuno con sequenze di primer universali.

Invia gli oligo ad Agilent per la stampa su un microarray di oligonucleotidi personalizzato. Una volta arrivato il microarray, iniziare a recuperare gli oligo di DNA dalla sua superficie posizionando il vetrino di copertura dell'array in una camera di ibridazione dell'array e pipettando delicatamente 500 microlitri di acqua deionizzata sul vetrino. Posizionare il vetrino per microarray rivolto verso il basso sopra il vetrino di copertura in modo che le etichette su ciascun vetrino siano rivolte l'una verso l'altra e fare attenzione a evitare bolle d'aria che possono interrompere il processo di recupero degli oligo.

Chiudere la camera di ibridazione e ruotarla per una notte a 99 gradi Celsius in un forno di ibridazione Il giorno seguente, rimuovere con cura l'array dalla camera e aspirare l'acqua, che ora contiene gli oligo liberati dalla superficie dell'array. Posizionare la pozza di oligo rilasciata in un tubo einor da 1,5 millilitri e sonicare per rompere potenziali grumi al 50% di ampiezza tre volte per impulsi da tre a cinque secondi ogni volta. Successivamente, amplificare la piscina mediante PCR a basso ciclo utilizzando primer universali con un promotore T aggiunto all'estremità.

Il numero di cicli necessari può variare a seconda dell'efficienza del recupero dell'oligo. Evitare l'amplificazione eccessiva, che è visibile come una banda spalmata su un gel di acrilammide. Infine, usa il kit di script mega short di Amon per trascrivere l'RNA.

Terminare la reazione di trascrizione mediante estrazione di fenil cloroformio dell'RNA, seguita dalla precipitazione dell'etanolo utilizzando acetato di sodio e anche glico blu come vettore. Resus sospendere il pellet di RNA in 105 microlitri di tampone TE. Per determinare con precisione la concentrazione dell'RNA.

Utilizzare il verde ribo per generare una curva standard. Quindi misurare utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. Il pool di RNA è ora pronto per la co-immunoprecipitazione per iniziare il pull down.

Per prima cosa, preparare le microsfere magnetiche combinando le perle di proteina A e proteina G in un rapporto di uno a uno fino a un volume finale di 50 microlitri per reazione. Concentrare le perle in un punto utilizzando un supporto di separazione magnetico per rimuovere il surnatante. Quindi lavare due volte con un uguale volume di freddo, un XPBS dopo il secondo lavaggio.

Di conseguenza, sospendere le perle in un volume uguale di freddo un XPBS e aggiungere due nanogrammi dell'anticorpo perion. Questa quantità può variare a seconda dell'anticorpo, quindi potrebbe essere necessaria una sperimentazione per trovare le condizioni ottimali per legare l'anticorpo alle perline. Incubare la miscela per una notte a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante.

Al mattino, aggiungere due microgrammi per reazione di RNA totale di lievito sonicato per bloccare il legame aspecifico e ruotare per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius. Una volta terminata la fase di blocco, utilizzare nuovamente la rastrelliera magnetica per rimuovere il surnatante. Quindi lavare le perle due volte con un XPBS freddo, lasciando il PBS del secondo lavaggio nell'aliquot del tubo, 50 microlitri della miscela di perline in nuovi tubi.

Una provetta per ogni reazione di co-IP. Le perline sono ora pronte per il coip. Successivamente, preparare la miscela master combinando il pool di oligo di RNA con l'estratto di cellule nucleari.

Come fonte di RNP, prelevare un'aliquota da 50 microlitri della miscela master come protezione totale del campione I primer, che sono versioni RNA dei primer universali, possono essere aggiunti per prevenire il legame delle proteine alla sequenza del primer o l'introduzione di una struttura secondaria all'RNA. Per avviare la co-immunoprecipitazione, rimuovere il surnatante dalle aliquote delle perle e risospendere le perle in 120 microlitri della miscela master rimanente. Agitare le reazioni a quattro gradi Celsius per una o due ore.

Al termine dell'incubazione, un piccolo Eloqua, comprese le perle, può essere rimosso da ciascun coip. Per ulteriori test sull'efficienza o la specificità del legame, posizionare il resto delle reazioni sul magnete e rimuovere il surnatante. Segue uno o due lavaggi con un XPDS freddo.

L'RNA legato all'anticorpo sulle perle attraverso l'RNP è il campione IP. Risospendere le perle IP in 50 microlitri di SDS all'1% in tampone XTE 0,1 e riscaldare i campioni a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Per eluire l'RNA, rimuovere il surnatante, che ora contiene l'RNA che era precedentemente legato alle perle e pulire mediante estrazione di fenil cloroformio, seguita da una precipitazione di etanolo, risospendere il pellet in 50 microlitri di tampone 0,1 XT.

Quindi, trascrivere i campioni utilizzando i primer universali inversi. Quindi la PCR amplifica i campioni con i primer universali, uno dei quali dovrebbe contenere un promotore T sette. Il numero di cicli necessari per amplificare la piscina dipenderà dall'efficienza del coip.

Utilizzando il kit di script mega shorts di ambion, trascrivi nuovamente i campioni, ma questa volta aggiungi due microlitri di allele amminico UTP invece del T sette UTP fornito con il kit. L'allele amminico UTP verrà utilizzato in seguito per marcare l'RNA con gli occhi laterali. Al termine della trascrizione.

L'estratto di fenil cloroformio e l'etanolo precipitano i campioni. Non utilizzare glico blu o acetato di ammonio, che potrebbero interferire con l'ibridazione dei campioni nell'array. Resus sospendere il pellet in 4,5 microlitri di carbonato di sodio molare 0,1.

Per etichettare prima i campioni, aggiungere 2,5 microlitri di acqua priva di nucleasi al campione totale. Aggiungere tre microlitri di S3 e al campione IP tre microlitri di SCI cinque. Incubare al buio per un'ora.

A temperatura ambiente, terminare la reazione aggiungendo sei microlitri di quattro molari di ossidril lammina HCL a ciascun campione, mescolare accuratamente e centrifugare. Incubare brevemente per 15 minuti A temperatura ambiente, purificare i campioni etichettati mediante estrazione con fenil cloroformio, seguita da precipitazione con etanolo. La maggior parte del colore viene tirato verso il basso nella fase organica con i nucleotidi liberi, quindi i pellet potrebbero non essere visibilmente colorati.

Resus sospendere ogni pellet in 50 microlitri da 0,1 XTE. Seguire le istruzioni del kit di ibridazione dell'array Agilent per preparare il campione di microarray con la seguente eccezione. Non frammentare l'RNA Dopo aver aggiunto il tampone di frammentazione, aggiungere immediatamente il tampone di ibridazione per fermare la frammentazione.

Posizionare i campioni sull'array e ibridarli a 50 gradi Celsius per tre ore mentre l'array è in rotazione. Preparare le seguenti soluzioni da 50 millilitri in provette coniche da 50 millilitri. Un tubo di due tamponi SC in eccesso, due tubi di un tampone marino in eccesso e un tubo di acqua deionizzata.

Dopo l'incubazione di tre ore, sbloccare con cautela il sandwich di vetrini dell'array e posizionarlo nei due tamponi XSSC. Usando un paio di pinzette. Separare delicatamente l'array dalla guida del coperchio.

Rimuovere delicatamente il vetrino del coperchio, facendo attenzione a non toccare l'array. Quando il cursore viene estratto, chiudere il conico e capovolgerlo delicatamente per 60 secondi. Utilizzando le pinzette, trasferire l'array all'unica soluzione XSSC.

Tappare il tubo e capovolgerlo delicatamente per un minuto. Quindi trasferire l'array nella seconda soluzione XSSC e di nuovo, capovolgere delicatamente per un altro minuto. Infine, trasferire l'array nel tubo di acqua deionizzata e capovolgere delicatamente per 30 secondi.

Asciugare l'array posizionando i bordi della diapositiva su una salvietta kim. Continua a ruotare l'array sulla salvietta, facendo attenzione a non interrompere il lato contenente gli oligo. Posizionare l'array in un tubo conico vuoto e procedere alla scansione dell'array.

Procedere con la scansione dell'array. Ecco un array rappresentativo. Ogni funzione o oligo è colorata in verde per il pool totale non arricchito o in rosso per il pool arricchito con IP.

Il segnale di ciascuna funzione viene normalizzato all'intensità totale di quel canale. L'output finale è il rapporto logaritmico del canale rosso rispetto al canale verde. Per ogni caratteristica dell'array, il punteggio medio per ogni coordinata genomica viene mappato alla posizione specificata.

Un'illustrazione di questa fase di media è data per tre oligo sovrapposti da 30 nucleotidi con punteggi di due, quattro e 0,5, dove è mostrato il punteggio medio di arricchimento per ogni finestra di 10 nucleotidi. Ecco un esempio di schema di legame per la proteina legante PTB tracciata poliperina al gene CLTA, le caratteristiche del gene sono fornite lungo il fondo e i punteggi di arricchimento medio logaritmico per la S legata al PTP sono rappresentati da barre verticali rosso scuro. Le barre rosso chiaro mostrano le aree non arricchite per il legame PTP.

Vi ho appena mostrato come creare in modo rapido ed efficiente un pool di oligonucleotidi che si affianca in diverse regioni di interesse, come gli assoni affettati in modo alternativo. Analizziamo le nostre piscine tramite microarray, ma è anche possibile sequenziarle mediante illuminato, sequenziamento Lexi o sequenziamento Sanger più tradizionale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che la creazione del pool è aperta a modifiche sia a livello di RNA che di proteine.

A livello di RNA, possiamo introdurre regioni autologhe, mutazioni di malattia, polimorfismi o mutazioni casuali nella sequenza oligonucleotidica. A livello proteico, il fattore di legame dell'RNA può essere modificato mediante fosforilazione o altre modifiche post-traduzionali. Inoltre, l'ambiente di legame può essere manipolato per aumentare o diminuire i livelli di fattori aggiuntivi che competono o interagiscono con la proteina legante l'RNA di interesse.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.