La registrazione ottica di attività elettrica in Guinea-maiale Reti enterici utilizzando tensione sensibile Coloranti

Questo video mostra la dissezione e la successiva imaging di preparati del sistema nervoso enterico stimolati elettricamente utilizzando il colorante sensibile alla tensione del perineo per tiro natale D four A-N-E-P-P-D-H-Q. Un piccolo segmento dell'intestino viene prelevato da un porcellino d'India eutanasia e sezionato per esporre prima la sottomucosa e, infine, il plesso mienterico per le registrazioni ottiche. Gli elettrodi vengono posizionati su un tessuto montato colorato con D per A-N-E-P-P-D-H-Q dopo l'acquisizione di un'immagine iniziale ad alta risoluzione.

Le variazioni ottiche che indicano l'attività elettrica vengono registrate con la telecamera ad alta velocità. Durante l'acquisizione ad alta velocità, viene applicata la stimolazione elettrica. L'immagine ad alta risoluzione viene quindi sovrapposta alla mappa dei pixel della telecamera ad alta velocità per l'analisi tramite neuro plex.

Ciao, sono Brian Salzberg, direttore del Laboratorio di Ottica Cellulare o loco, come ci piace chiamarlo nel Dipartimento di Neuroscienze dell'Università della Pennsylvania. Mi chiamo Analia Obide. Sono inoltre membro del laboratorio di Ottica cellulare.

Oggi vi mostreremo una procedura per registrare l'attività elettrica da reti neuronali di mammiferi intatti utilizzando coloranti sensibili alla tensione. Utilizziamo questa procedura per studiare la connettività neuronale all'interno e tra le due reti che compongono il sistema nervoso enterico, noto anche come secondo cervello o cervello dell'intestino. Quindi iniziamo.

Iniziare a preparare il sottomuco e le preparazioni del plesso enterico asportando l'intestino tenue di un porcellino d'India Hartley di 150-200 grammi o di due o tre settimane che è stato anestetizzato mediante fluoro, inalazione e decapitato. Quindi rimuovere il contenuto dell'intestino sciacquando il lume con una soluzione calda ossigenata M1 99 DM. Taglia un segmento intestinale da otto a 10 centimetri di lunghezza e assicurati di preservare la polarità.

Trasferirlo in un piatto di vetro da 10 centimetri rivestito di sarda a temperatura ambiente M1 99 DM.Posizionare il piatto su un microscopio da dissezione con illuminazione a campo scuro. Poi usando le forbici. Aprire il bordo mesenterico e utilizzare perni per insetti per montare il segmento intestinale con la mucosa rivolta verso l'alto.

È estremamente importante mantenere una tensione uniforme in modo che dopo l'appuntamento, il tessuto mostri una forma rettangolare con le file di mucoso vii regolarmente allineate, tenendo sottili pinze dumont con punte diritte in posizione quasi orizzontale. Sbucciare la mucosa afferrando il VII a un'estremità del segmento intestinale e tirando lungo l'asse longitudinale del tessuto. Continuare a separare i nastri di mucosa per esporre la sottomucosa contenente i sottomuco, i gangli e il sistema vascolare sottomucoso.

Successivamente, utilizzando forbici molto sottili, praticare un taglio nello strato sottomucoso seguendo l'orientamento delle fibre muscolari circolari. Quindi sollevare la sottomucosa molto delicatamente con la pinza fine mentre si spinge il muscolo circolare. Stendere lo strato con le forbici e tagliare lungo i bordi longitudinali.

Liberare la sottomucosa dal resto della preparazione man mano che la separazione procede. Ora fai un secondo taglio seguendo l'orientamento delle fibre muscolari circolari a una distanza da 1,5 a tre centimetri dalla prima per definire la dimensione finale della preparazione sottomucosa, il segmento sottomucoso risultante ha uno spessore da 30 a 50 micrometri e mostra un aspetto sottile. Trasferirlo in un'altra pirofila contenente M1 99 DM fresco e fissarlo delicatamente e senza tensione.

Quindi posizionare il piatto in una camera ossigenata a temperatura ambiente per un uso successivo. Il segmento intestinale originale dovrebbe ora essere privato della mucosa e della sottomucosa e il muscolo circolare dovrebbe essere esposto. Questo segmento viene ora utilizzato per produrre una preparazione del plesso mienterico per esporre il plesso mienterico.

Eliminare il più possibile lo strato muscolare circolare utilizzando una pinza fine a punta dritta per estrarre i fasci di fibre da ciascun lato della preparazione. Il plesso mienterico esposto non può essere separato dallo strato longitudinale del muscolo e dal sottostante CI.Trasferire la preparazione del plesso mienterico in un nuovo piatto rivestito di sarda contenente ossigenato M1 99 M.Quindi appuntare liberamente il campione che contiene il muscolo vivo. Pochi minuti prima dell'esperimento ottico, trasferire la preparazione in un nuovo piatto più piccolo rivestito di syl guard già riempito con M1 99 DM contenente due nefe micromolari per prevenire la contrazione muscolare e montato saldamente posizionando con cura più perni molto sottili attorno al perimetro.

Assicurarsi che la tensione sia distribuita uniformemente e che il fazzoletto sia completamente piatto contro il fondo della protezione del sill. La preparazione del tessuto è ora pronta per gli esperimenti fisiologici. Preparare una soluzione in piedi da cinque a 50 microgrammi per millilitro di DAI four A-N-E-P-P-D HQ in M1 99 M con due nifedipina micromolare in un flaconcino di vetro e coprirla con un foglio di alluminio.

L'etanolo della soluzione madre deve contenere meno dello 0,5% della soluzione per M1 99 DM con nifedipina che copriva il preparato e sostituirlo con la soluzione colorante preparata. Utilizzando un volume sufficiente della scala per coprire completamente il tessuto, incubare a temperatura ambiente per 10-30 minuti dopo l'incubazione. Lavare il preparato con M1 99 M plus NEFE ossigenato sostituendo l'intero contenuto della camera.

La registrazione ottica dell'attività neuronale nelle preparazioni stimolate elettricamente viene eseguita utilizzando un sistema costituito da un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di uno splitter di immagini, una telecamera di precisione ad alta velocità a bassa risoluzione, una telecamera in bianco e nero ad alta risoluzione, un generatore di stimoli controllato da computer e un manipolatore di microm. L'intero apparato è montato su un tavolo di isolamento a vibrazione attiva ed è circondato da pesanti tende acustiche e da un tetto in Mylar per ridurre al minimo le vibrazioni trasmesse dall'aria. Sebbene l'acquisizione delle immagini da entrambe le telecamere possa essere eseguita utilizzando un singolo computer che esegue sia Neuro plex che Global Lab image two o qualsiasi altro software di acquisizione delle immagini, la configurazione mostrata qui impiega due computer che controllano ciascuno una telecamera separata per iniziare gli esperimenti ottici.

Posizionare la camera contenente il campione pannato colorato sul tavolino del microscopio. Poiché D 4 A e EPPD HQ è un colorante impermanente di membrana che diventa fluorescente solo quando si trova in un ambiente lipidico, i neuroni sani di una preparazione enterica colorata dovrebbero avere l'aspetto di palloncini vuoti sotto qualsiasi ingrandimento superiore a 20 x quando osservati. Utilizzando i filtri HQ 5 35 50 per l'eccitazione HQ 5 72 LP a quattro emissioni e uno specchio diico 5 65 nanometri.

Successivamente, utilizzando il micro manipolatore controlla la posizione, un elettrodo a matrice lineare multi barilotto all'estremità orale del tessuto, assicurandosi che l'elettrodo sia lontano dall'obiettivo del microscopio. Un array di matrici lineari contenente 10 elettrodi di tungsteno distribuiti su un intervallo di un centimetro è in grado di eccitare diversi percorsi neuronali indipendenti ed è adatto per lo studio di circuiti gangliari di interconnessione. Per i dati rappresentativi, tuttavia, abbiamo utilizzato un elettrodo stimolante a due conduttori fatto in casa.

appiccicosa per posizionare un elettrodo di terra all'estremità opposta della camera prima di effettuare una registrazione funzionale, acquisire un'immagine in bianco e nero ad alta risoluzione della regione da cui verrà registrata l'attività elettrica per aiutare la visualizzazione. L'abilità del grigio può essere invertita in modo che la fluorescenza appaia scura. Per applicare la stimolazione di corrente utilizzando il generatore di stimoli controllato dal computer, programmare prima il dispositivo selezionando l'intensità, la durata, la frequenza e il numero di stimoli appropriati, nonché il ritardo rispetto all'inizio dell'acquisizione ottica dei dati.

Per assicurarsi che la stimolazione avvenga entro i limiti dell'acquisizione ottica dei dati, configurare il generatore di stimolo come un dispositivo controllato da un plesso neuronale. Quindi, imposta i parametri di acquisizione all'interno del neuro plex indicando la frequenza dei fotogrammi, il numero di fotogrammi e il guadagno della fotocamera. Per ottenere la definizione completa di un'azione, la frequenza dei fotogrammi potenziali deve essere impostata su un minimo di un kilohertz.

Poiché D four A e E-P-P-G-H-Q mostrano una diminuzione della fluorescenza dopo la depolarizzazione che è linearmente correlata al cambiamento di tensione, invertire la visualizzazione dei segnali ottici all'interno del plesso neuronale in modo che i potenziali d'azione non appaiano capovolti. Inizia l'acquisizione. Ricordarsi di acquisire una nuova immagine in bianco e nero ad alta risoluzione di ogni campo visivo prima di eseguire ciascuna delle registrazioni funzionali.

Una volta completata l'acquisizione, utilizzare neuro plex per analizzare i risultati offline. Un'area dello schermo chiamata visualizzazione della pagina mostra l'immagine grezza della preparazione catturata dalla fotocamera ad alta velocità 80 per 80 come un singolo fotogramma. Quando la modalità pagina è absolute frame, sovrapponi l'immagine ad alta risoluzione acquisita con la seconda fotocamera sulla mappa pixel dell'immagine grezza utilizzando i comandi di visualizzazione del neuro plex.

Ciò richiede il cambio della modalità pagina da traccia assoluta a tracce e la selezione dell'immagine sovrapposta dall'interno del comando di visualizzazione. Utilizzare il mouse per selezionare singoli pixel o gruppi di pixel dall'immagine mostrata nella visualizzazione della pagina. Gli output di queste regioni di interesse appariranno come tracce all'interno della finestra di visualizzazione della traccia rivelando l'entità dei cambiamenti ottici registrati da quei pixel in funzione del tempo.

L'inversione della scala di grigi nell'immagine ad alta risoluzione migliora la visualizzazione sulla visualizzazione della pagina in modalità traccia ed è fortemente incoraggiata la visualizzazione di un'uscita analogica dallo stimolatore. Selezionare il canale di uscita analogico da includere nella finestra di visualizzazione della traccia. Questo output indica la tempistica precisa degli stimoli applicati durante l'esperimento.

Per visualizzare i dati come un filmato, utilizzare i comandi filmato all'interno di neuro plex per visualizzare fotogrammi consecutivi all'interno di un set di dati utilizzando pseudo scale di colori regolate al massimo e al minimo cambiamento dell'intensità della fluorescenza. Un ganglio di una preparazione del plesso mienterico colorato con DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q è stato ripreso con la fotocamera ad alta risoluzione e un obiettivo 60x. Durante l'acquisizione dei dati, la preparazione è stata stimolata con un treno di cinque impulsi a 40 hertz.

Con ogni impulso avente un'ampiezza di 15 milliampere e una durata di 0,5 millisecondi, sono state identificate quattro regioni di interesse o R OIS e sono state generate tracce per visualizzare i dati ottici mediati sulle regioni selezionate nella sequenza di fotogrammi pseudocolore della prima risposta ottica, le regioni di depolarizzazione della membrana che indicano che l'attività neuronale appare dal giallo al rosso. Questi dati indicano che l'attività di stimolazione EV si verifica in regioni discrete di ciascun ganglio, per lo più trasportate dagli assoni di passaggio. Le ROI due, tre e quattro identificano i singoli neuroni a varie distanze dalla ROI uno.

La seconda figura illustra con un ingrandimento di 10 x le vie anatomiche lungo le quali l'informazione può propagarsi, le frecce indicano la direzione seguita dallo stimolo per attivare il ganglio mienterico identificato. Abbiamo appena mostrato i componenti di una configurazione ottica per la registrazione dell'attività elettrica con coloranti sensibili alla tensione e come, quando questa tecnologia viene applicata al sistema internervoso, apre la possibilità di studiare la connettività funzionale all'interno e tra due reti di mammiferi intatti sotto il campo del microscopio. Quando si utilizza la tecnologia di registrazione ottica, l'attenzione ai dettagli è estremamente importante.

Le fonti di rumore, ottiche, meccaniche ed elettriche devono essere attentamente controllate e la salute del preparato deve essere meticolosamente preservata. Pertanto, la padronanza di tutte le singole fasi di questo protocollo è essenziale per raggiungere il successo nella registrazione ottica. Quindi questo è tutto.

Grazie mille per l'osservazione e buona fortuna per i vostri esperimenti.