La registrazione ottica di attività elettrica in Guinea-maiale Reti enterici utilizzando tensione sensibile Coloranti

Questo video dimostra la dissezione e la successiva acquisizione di immagini di preparati del sistema nervoso enterico stimolati elettricamente, utilizzando il colorante sensibile alla tensione natale styre D four A-N-E-P-P-D-H-Q. Viene prelevato un piccolo segmento intestinale da un criceto morto e dissezionato per esporre prima la sottomucosa e infine il plesso mienterico, al fine di effettuare registrazioni ottiche. Dopo aver acquisito un'immagine iniziale ad alta risoluzione, vengono posizionati degli elettrodi su un tessuto montato precedentemente colorato con D for A-N-E-P-P-D-H-Q.

Le variazioni ottiche che indicano l'attività elettrica vengono registrate con la videocamera ad alta velocità. Durante l'acquisizione ad alta velocità, viene applicata una stimolazione elettrica. L'immagine ad alta risoluzione viene quindi sovrapposta alla mappa dei pixel della videocamera ad alta velocità per l'analisi mediante neuro plex.

Ciao, sono Brian Salzberg, direttore del Laboratorio di Ottica Cellulare, o loco, come ci piace chiamarlo, presso il Dipartimento di Neuroscienze dell'Università della Pennsylvania. Mi chiamo Analia Obide. Sono anch'io membro del laboratorio di Ottica Cellulare.

Oggi vi mostreremo un procedimento per registrare l'attività elettrica da reti neuronali intatte di mammiferi utilizzando coloranti sensibili al voltaggio. Utilizziamo questo procedimento per studiare la connettività neuronale all'interno e tra le due reti che compongono il sistema nervoso enterico, noto anche come secondo cervello o cervello dell'intestino. Cominciamo dunque.

Iniziare la preparazione dei plessi sottomucosi e mienterici escindendo l'intestino tenue di un criceto Hartley del peso di 150-200 grammi o di due-tre settimane di età, precedentemente anestetizzato mediante inalazione di isoflurano e decapitato. Rimuovere quindi il contenuto intestinale lavando la cavità con una soluzione M1 99 DM ossigenata e riscaldata. Tagliare un segmento intestinale lungo otto-dieci centimetri, avendo cura di preservarne la polarità.

Trasferirla in una capsula di Petri in vetro da 10 centimetri rivestita con sard, contenente M1 99 DM a temperatura ambiente. Posizionare la capsula su un microscopio stereoscopico con illuminazione a campo scuro. Quindi, utilizzando delle forbici, aprire il margine mesenterico e usare spilli da insetto per montare il segmento intestinale con la mucosa rivolta verso l'alto.

È estremamente importante mantenere una tensione uniforme in modo che, dopo essere stato fissato, il tessuto presenti una forma rettangolare con le file di villi mucosali allineate regolarmente, tenendo pinze fini di Dumont con punte dritte in una posizione quasi orizzontale. Staccare la mucosa afferrando i villi a un'estremità del segmento intestinale e tirando lungo l'asse longitudinale del tessuto. Continuare a separare strisce di mucosa per esporre la sottomucosa contenente i gangli sottomucosi e la vascolarizzazione sottomucosa.

Successivamente, utilizzando forbici molto fini, effettuare un taglio nel livello sottomucoso seguendo l'orientamento delle fibre muscolari circolari. Poi sollevare delicatamente la sottomucosa con la pinzetta fine mentre si spinge verso il basso il muscolo circolare, utilizzando le forbici per tagliare lungo i margini longitudinali.

Separare la sottomucosa dal resto del preparato man mano che procede la dissezione. Effettuare ora un secondo taglio seguendo l'orientamento delle fibre muscolari circolari, a una distanza di 1,5-3 centimetri dal primo, per definire le dimensioni finali del preparato sottomucosale; il segmento sottomucosale risultante ha uno spessore di 30-50 micrometri ed ha un aspetto diafano. Trasferirlo in una nuova capsula di Petri contenente M1 99 DM fresco e fissarlo delicatamente e senza tensione.

Quindi posizionare la piastra in una camera ossigenata a temperatura ambiente per un uso successivo. Il segmento intestinale originale dovrebbe ora essere privo di mucosa e sottomucosa e il muscolo circolare deve essere esposto. Questo segmento viene ora utilizzato per ottenere una preparazione del plesso mienterico al fine di esporre il plesso mienterico.

Eliminare il più possibile lo strato di muscolo circolare utilizzando pinzette fini a punta dritta per staccare i fasci di fibre da ciascun lato del preparato. Il plesso mienterico esposto non può essere separato dallo strato muscolare longitudinale e dalla CI sottostante. Trasferire il preparato del plesso mienterico in una nuova capsula di Petri rivestita con sard contenente M1 99 M ossigenato. Quindi fissare leggermente il campione che contiene muscolo vivo. Alcuni minuti prima dell'esperimento ottico, trasferire il preparato in una nuova capsula di Petri più piccola, rivestita con syl guard e già riempita con M1 99 DM contenente due micromolar di nefedrina per prevenire la contrazione muscolare, fissandolo con cura posizionando diverse pinzette molto fini lungo il perimetro.

Assicurarsi che la tensione sia distribuita uniformemente e che il tessuto aderisca completamente e in piano alla base della griglia in silicio. Il preparato tessutale è ora pronto per esperimenti fisiologici. Preparare una soluzione stock di DAI four A-N-E-P-P-D HQ da cinque a 50 microgrammi per millilitro in M1 99 M con due micromolari di nifedipina in un vial di vetro e coprirla con foglio di alluminio.

L'etanolo della soluzione stock deve costituire meno dello 0,5% della soluzione al M1 99 DM con Nifedipina che ricopriva il preparato e sostituirlo con la soluzione di colorante preparata. Utilizzando un volume sufficiente del colorante per coprire completamente il tessuto, incubare a temperatura ambiente per 10-30 minuti; al termine dell'incubazione, lavare il preparato con M1 99 M più NEFE ossigenato, sostituendo completamente il contenuto della camera.

La registrazione ottica dell'attività neuronale in preparati stimolati elettricamente viene effettuata utilizzando un sistema costituito da un microscopio epi a fluorescenza eretto dotato di uno splitter d'immagine, una telecamera ad alta velocità e bassa risoluzione, una telecamera in bianco e nero ad alta risoluzione, un generatore di stimoli controllato da computer e un micromanipolatore. L'intero apparato è montato su un tavolo attivo di isolamento dalle vibrazioni e circondato da pesanti tende acustiche e un tetto in Mylar per ridurre al minimo le vibrazioni aeree. Sebbene l'acquisizione delle immagini da entrambe le telecamere possa essere eseguita utilizzando un singolo computer che esegue sia Neuro Plex sia Global Lab Image Two o qualsiasi altro software di acquisizione immagini, l'allestimento qui mostrato impiega due computer, ciascuno dei quali controlla una telecamera separata per iniziare gli esperimenti ottici.

Posizionare la camera contenente il campione colorato e selezionato sul portacampioni del microscopio. Poiché D four A e EPPD HQ è un colorante impermanente della membrana che fluoresce solo in un ambiente lipidico, i neuroni sani provenienti da una preparazione enterica colorata dovrebbero apparire come palloncini vuoti a qualsiasi ingrandimento superiore a 20x durante l'osservazione. Utilizzare i filtri HQ 5 35 50 per l'eccitazione, HQ 5 72 LP per l'emissione e uno specchio dicotroico a 5 65 nanometri.

Successivamente, utilizzando i comandi del micromanipolatore, posizionare una matrice lineare multicanale di elettrodi all'estremità orale del tessuto, assicurandosi che l'elettrodo sia lontano dall'obiettivo del microscopio. Una matrice lineare composta da 10 elettrodi al tungsteno distribuiti su un'ampiezza di un centimetro è in grado di eccitare diverse vie neuronali indipendenti ed è particolarmente adatta allo studio di circuiti gangliari interconnessi. Tuttavia, per i dati rappresentativi, abbiamo utilizzato un elettrodo stimolante autocostruito a due derivazioni.

Utilizzare una cera adesiva per posizionare un elettrodo di terra all'estremità opposta della camera prima di effettuare una registrazione funzionale; acquisire un'immagine in bianco e nero ad alta risoluzione della regione da cui verrà registrata l'attività elettrica, al fine di facilitarne la visualizzazione. La scala di grigi può essere invertita in modo che la fluorescenza appaia scura. Per applicare una stimolazione elettrica mediante il generatore di stimoli controllato dal computer, programmare innanzitutto il dispositivo selezionando l'intensità, la durata, la frequenza e il numero di stimoli appropriati, nonché il ritardo rispetto all'inizio dell'acquisizione dei dati ottici.

Per assicurarsi che la stimolazione avvenga entro i limiti dell'acquisizione ottica dei dati, configurare il generatore di stimoli come dispositivo controllato da neuro plex. Successivamente, impostare i parametri di acquisizione all'interno di neuro plex indicando la frequenza dei fotogrammi, il numero di fotogrammi e il guadagno della telecamera. Per ottenere una definizione completa di un'azione, la frequenza dei fotogrammi deve essere impostata a un minimo di un chilohertz.

Dato che D four A ed E-P-P-G-H-Q mostrano una diminuzione della fluorescenza in seguito alla depolarizzazione che è linearmente correlata al cambiamento di voltaggio, invertire la visualizzazione dei segnali ottici all'interno di neuro plex in modo che i potenziali d'azione non appaiano capovolti. Iniziare l'acquisizione. Ricordare di acquisire una nuova immagine in bianco e nero ad alta risoluzione per ciascun campo visivo prima di effettuare ciascuna registrazione funzionale.

Al termine dell'acquisizione, utilizzare Neuro Plex per analizzare i risultati in modalità offline. Un'area dello schermo denominata visualizzazione della pagina mostra l'immagine grezza del preparato così come acquisita dalla telecamera ad alta velocità 80 per 80 come singolo fotogramma. Quando la modalità pagina è impostata su fotogramma assoluto, sovrapporre l'immagine ad alta risoluzione acquisita con la seconda telecamera sulla mappa dei pixel dell'immagine grezza utilizzando i comandi di visualizzazione di Neuro Plex.

Questa operazione richiede la modifica della modalità di pagina da traccia assoluta a tracce e la selezione dell'immagine sovrapposta all'interno del comando di visualizzazione. Utilizzare il mouse per selezionare singoli pixel o gruppi di pixel dall'immagine mostrata nella visualizzazione della pagina. L'output di queste regioni di interesse apparirà come tracce all'interno della finestra di visualizzazione delle tracce, rivelando l'entità delle variazioni ottiche registrate da tali pixel in funzione del tempo.

L'inversione della scala di grigi nell'immagine ad alta risoluzione migliora la visualizzazione nella modalità di tracciamento e si raccomanda vivamente di mostrare un'uscita analogica dallo stimolatore. Selezionare il canale di uscita analogico per includerlo nella finestra di visualizzazione del tracciato. Questa uscita indica il momento preciso degli stimoli applicati durante l'esperimento.

Per visualizzare i dati come filmato, utilizzare i comandi per il filmato all'interno di neuro plex per mostrare frame consecutivi all'interno di un dataset usando scale di colori pseudocromatici regolate in base al cambiamento massimo e minimo dell'intensità della fluorescenza. Un ganglio da una preparazione del plesso mienterico colorato con DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q è stato acquisito con una telecamera ad alta risoluzione e un obiettivo 60x. Durante l'acquisizione dei dati, la preparazione è stata stimolata con una serie di cinque impulsi a 40 hertz.

Con ogni impulso che presenta un'ampiezza di 15 milliampere e una durata di 0,5 millisecondi, sono state identificate quattro regioni di interesse o ROI e sono state generate tracce per visualizzare i dati ottici mediati sulle regioni selezionate nella sequenza di fotogrammi pseudocolorati. Le prime risposte ottiche associate alla depolarizzazione della membrana, indicativa dell'attività neuronale, appaiono di colore giallo fino al rosso. Questi dati indicano che l'attività evocata dalla stimolazione si verifica in regioni distinte di ciascun ganglio, trasportata principalmente dagli assoni di passaggio. Le ROI due, tre e quattro identificano singoli neuroni a diverse distanze dalla ROI uno.

La figura due illustra, con un ingrandimento di 10x, i percorsi anatomici lungo i quali l'informazione può propagarsi; le frecce indicano la direzione seguita dallo stimolo per attivare il ganglio mienterico identificato. Abbiamo appena mostrato i componenti di un apparato ottico per la registrazione dell'attività elettrica mediante coloranti sensibili al voltaggio e come, quando questa tecnologia viene applicata al sistema nervoso enterico, si aprano le possibilità di studiare la connettività funzionale all'interno e tra due reti mammifere integre sotto il campo del microscopio. Quando si utilizza la tecnologia di registrazione ottica, l'attenzione ai dettagli è estremamente importante.

Le fonti di rumore, ottiche, meccaniche ed elettriche, devono essere attentamente controllate e lo stato di salute del preparato deve essere scrupolosamente preservato. Pertanto, è essenziale padroneggiare tutti i singoli passaggi di questo protocollo per ottenere successo nella registrazione ottica. Questo è tutto.

Grazie mille per aver guardato e buona fortuna nei vostri esperimenti.