Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

I plasmidi WRN vengono digeriti con l'endonucleasi di restrizione cell one e MLU one e i frammenti sono purificati da un gel. Questi vettori di espressione digeriti con cell one a MLU one frammenti WN vengono quindi ligati nei siti da cell one a MLU one del vettore per lievito. Il plasmide multicopia contiene inoltre un marcatore selettivo TRP one.

I costrutti W Rrn vengono trasformati nei lieviti seguendo protocolli standard e i trasformanti vengono selezionati su terreno sintetico completo con glucosio privo di triptofano. Singoli trasformanti vengono quindi seminati per striscia su terreno sintetico completo con glucosio privo di triptofano e le piastre vengono incubate a partire dalla piastra maestra. Per analizzare il ripristino del fenotipo di crescita lenta nei SGS trasformati con WRN, tre trasformanti con i migliori ceppi doppi mutanti vengono seminati per striscia su piastre contenenti glucosio o galattosio.

Per analizzare l'effetto dell'espressione di WRN sulla sensibilità a HU e MMS, viene eseguita una piastratura per determinare la distribuzione del ciclo cellulare nelle cellule di lievito che esprimono WRN. Viene effettuata la colorazione con DAPI. L'espressione di WRN in un ospite eterologo viene analizzata mediante Western Blood Analysis.

Ciao, sono Robert Broch della sezione sui casi di DNA hela nel laboratorio di gerontologia molecolare presso l'Istituto Nazionale sull'Invecchiamento, uno degli istituti dei National Institutes of Health. Ciao, sono Monica Agarwal, anch'io della sezione sui casi di DNA Heli nel laboratorio di genetologia molecolare presso i National Institutes on Aging. Comprendere i ruoli delle proteine umane coinvolte nella riparazione del DNA e dei percorsi genetici rappresenta una sfida accessibile per molti ricercatori.

Gli studi genetici nei sistemi mammiferi sono stati limitati a causa della mancanza di strumenti facilmente disponibili, tra cui linee cellulari genetiche mutanti, sistemi di espressione regolatori e marcatori selettivi appropriati. Oggi vi mostreremo procedure che utilizzano il lievito come sistema modello per indagare le funzioni molecolari e cellulari di un enzima svolgitore del DNA noto come elicasi nella prevenzione dell'invecchiamento precoce. Utilizziamo queste procedure nel nostro laboratorio per caratterizzare geneticamente il ruolo del prodotto del gene umano burner, che risulta difettoso nella riparazione del DNA e nel mantenimento della stabilità genomica nell'invecchiamento precoce.

Sindrome di Werner Werner è uno dei cinque casi di elicasa della famiglia req umana presenti in est. Esiste un solo sgs denominato per studiare il ruolo di Werner umano nella risposta allo stress replicativo. Abbiamo esaminato l'effetto dell'espressione di Werner in un ceppo mutante est su diversi parametri biologici.

Iniziamo. Poiché utilizzeremo il lievito come ospite eterologo, il primo passo consisterà nel clonare il gene umano Werner o la sua variante in un vettore per lieviti. I plasmidi Werner sono stati digeriti con l'endonucleasi di restrizione Sal I e Mlu I e i frammenti purificati sono stati successivamente ligati nei siti Sal I e Mlu I del vettore di espressione per lieviti, sotto il controllo di un promotore inducibile da galattosio.

Il plasmide multicopia contiene inoltre un marcatore selezionabile TRP1. Questi plasmidi per l'espressione di Werner vengono quindi trasformati nelle appropriate ceppi di lievito prototrofi per il triptofano utilizzati in questo studio. I trasformanti vengono selezionati seminando il sospensione su terreno sintetico completo con glucosio.

In assenza di triptofano, incubare le piastre a 30 gradi Celsius per tre o quattro giorni fino alla comparsa delle colonie. Una volta cresciute le colonie, effettuare un'isolazione su media sintetico completo con glucosio dei singoli trasformanti e incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni. I ceppi mutanti di lievito che esprimono il gene umano weer e le sue varianti vengono quindi analizzati per fenotipi cellulari mediante le tecniche illustrate nelle sezioni seguenti.

I tre mutanti principali mostrano un grave difetto di crescita. Tuttavia, una mutazione nel gene SGS1 sopprime il fenotipo di crescita lenta del triplo mutante per esaminare l'effetto dell'espressione di Werner sulla crescita di ceppi di tipo selvaggio SGS1 o SGS1 triplo mutante, seminare i ceppi corrispondenti con il vettore o con il plasmide di espressione di Werner su piastre di terreno sintetico completo privo di triptofano e contenente il 2% di glucosio o il 2% di galattosio come controllo positivo. L'effetto dell'espressione di SGS1 è stato determinato incubando le piastre a 30 gradi per due giorni.

Le ceppi di tipo selvaggio e il ceppo mutante sgs1 trasformato con vettore o con Werner non mostrano alcuna differenza nel loro andamento di crescita. Tuttavia, il ceppo doppio mutante sgs1 top3 trasformato con Werner cresce significativamente più lentamente rispetto al doppio mutante sgs1 top3 trasformato con vettore, al fine di valutare i requisiti funzionali di Werner per il ripristino del fenotipo di crescita lenta. Sullo sfondo sgs1 top3, si effettuano delle striature di ceppi sgs1 top3 trasformati con mutanti del dominio catalitico di Werner su piastre sintetiche complete prive di triptofano e contenenti il 2% di glucosio o il 2% di galattosio; dopo due giorni si osserva la crescita.

L'incubazione della mutante esonucleasi Werner indicata come E 84 A ripristina il fenotipo di crescita lenta come Werner, dimostrando così che l'attività esonucleasica non è richiesta per il ripristino del fenotipo di crescita lenta nei primi tre casi. La mutante elicasi Werner cresce bene, dimostrando quindi che l'attività elicasiche di Werner è necessaria per il ripristino del fenotipo di crescita lenta nei primi tre casi. Per determinare la capacità di Werner di influenzare la velocità di crescita di sgs.

Un ceppo tra i primi tre a livelli più bassi di espressione proteica trascina sgs uno dei tre ceppi migliori trasformati con il vettore Werner o sgs uno su piastre sintetiche complete prive di triptofano, ma contenenti concentrazioni crescenti di galattosio. Incubare tutte le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni. Il mutante Warner e l'esonucleasi Warner ripristinano il fenotipo della pendenza nei primi tre ceppi a tutti i livelli di galattosio.

Tuttavia, i mutanti della elicasi Warner non presentano questa caratteristica. È stato dimostrato che il doppio mutante SGS uno top three è meno sensibile rispetto al mutante singolo top three all'agente alchilante del DNA metil metanosolfonato o MMS o all'inibitore della replicazione idrossiurea o HU. Per determinare l'effetto dell'espressione di Warner sulla sensibilità a MMS e HE dei ceppi SGS uno o S GS uno top three, coltivare ceppi di lievito trasformati con vettore o con Warner in un mezzo sintetico completo contenente raffinosio e privo di triptofano, a 30 gradi Celsius come controllo.

Utilizzare una ceppa parentale di tipo selvaggio trasformata con un vettore per reinoculare tutte le colture in un mezzo sintetico completo contenente raffinosio e privo di triptofano, e coltivare a 30 gradi Celsius fino alla fase iniziale di crescita logaritmica. Quando le colture raggiungono la fase iniziale logaritmica, preparare delle diluizioni seriali decadiametriche fino a 10.000 volte di queste ceppi utilizzando un mezzo sintetico completo privo di triptofano; depositare quattro microlitri di ogni diluizione su piastre di mezzo sintetico completo con GAL, prive di triptofano e contenenti 10 millimoli di HU oppure 0,0025% di MMS; incubare le piastre a 30 gradi Celsius per quattro giorni. Un doppio mutante SGS1Δ top3Δ che è stato trasformato con sgs di tipo selvaggio.

Uno è ritardato nella fase tardiva SG2 del ciclo cellulare, risultando in una morfologia a forma di manubrio. Al contrario, i lieviti di tipo selvaggio completano la divisione cellulare, lasciando un numero minore di cellule con morfologia a manubrio per studiare la distribuzione nel ciclo cellulare della ceppia sgs uno top tre trasformata Werner. Coltivare innanzitutto colture in crescita logaritmica delle seguenti ceppie in mezzo sintetico completo RAF privo di triptofano a 30 gradi Celsius durante la notte.

SGS uno dei tre migliori trasformati con il vettore Werner o SGS uno e il vettore trasformato nella ceppa parentale selvatica, reinoculare le colture a un OD di 0,05. Una volta reinoculate, far crescere le colture fino a un OD di 0,5 e raccoglierle mediante centrifugazione. L'espressione di Werner viene quindi indotta aggiungendo galattosio al 2%. Lasciare crescere le colture a 30 gradi Celsius per sei ore.

Dopo sei ore, raccogliere le colture e pellettizzare le cellule mediante centrifugazione. Trasferire le colture in provette da microcentrifuga dopo la centrifugazione, lavare le cellule una volta con PBS. Successivamente, fissare le cellule in etanolo al 70% per 20 minuti a temperatura ambiente; dopo aver lavato le cellule fissate due volte con PBS, risospendere le cellule in 1x PBS.

Posizionare la sospensione cellulare su un vetrino e aggiungere il vector shield. Usare un mezzo di montaggio con DAPI alla concentrazione di un microgrammo per millilitro. Esaminare i vetrini al microscopio XI Saxo vert alla ricerca di cellule con nuclei a forma di manubrio, caratteristici delle cellule di lievito nella fase SG2 del ciclo cellulare.

Per determinare l'espressione della proteina di Werner o della sua variante in ceppi di lievito SGS uno o SGS uno top three trasformati, iniziare col coltivare i ceppi per sei ore in un mezzo contenente galattosio per indurre l'espressione della proteina di Werner. Dopo aver raccolto le cellule mediante centrifugazione, lavarle con PBS e risospendere.

Un tampone di lisi alcalina. Far bollire le cellule per cinque minuti, quindi chiarificare mediante centrifugazione e neutralizzare con acido cloridrico uno molare. Questi lisati sono ora pronti per l'elettroforesi in gel di poliacrilammide SDS all'8-16% per determinare il livello di espressione della proteina Warner in presenza di concentrazioni variabili di galattosio.

Prima di tutto, indurre le colture con concentrazioni variabili di galattosio per sei ore. Successivamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere in tampone contenente inibitori delle proteasi. Aggiungere al mix perle di vetro di dimensioni comprese tra 425 e 600 micron e rompere le cellule mediante vortex ad alta velocità per un minuto, seguito da raffreddamento su ghiaccio per un minuto.

Ripetere per un totale di otto volte. Successivamente, centrifugare l'omogenato risultante per cinque minuti a 15.000 G e raccogliere la frazione soprannatante. Dopo aver misurato la quantità di proteina nelle frazioni di lisato mediante il metodo di Bradford, risolvere concentrazioni uguali di proteina su gel di poliacrilamide SDS all'8-16%. L'espressione di Werner viene quindi determinata mediante Western blot nell'espressione di Werner nei sgs.

Un topo tre ripristina il fenotipo di crescita lenta del topo tre, come mostrato in queste fotografie. Quando ceppi di sgs uno topo tre trasformati con il vettore Werner o sgs uno vengono seminati su una piastra SC priva di triptofano contenente il 2% di glucosio o il 2% di galattosio, l'espressione indotta da galattosio di Werner causa una crescita più lenta del ceppo sgs uno topo tre.

Al contrario, la crescita del ceppo parentale di tipo selvatico o del ceppo SGS uno trasformato con Werner non è influenzata, indicando che la crescita lenta conferita da Werner è specifica per lo sfondo SGS uno top three. Quando i ceppi SGS uno top three trasformati con varianti di Werner sono stati seminati su piastre SC contenenti triptofano e o 2% di glucosio o 2% di galattosio.

La forma priva di attività esonucleasica di Werner è stata comunque in grado di ripristinare il fenotipo di crescita lenta. Questo dimostra che l'attività elicasicasi ATPasica di Werner, ma non quella esonucleasica, è necessaria per ripristinare il fenotipo di crescita lenta di top three. In un contesto SGS one top three, Werner ha ripristinato il fenotipo di crescita lenta di SGS one top three lungo tutto l'intervallo di concentrazione di GAL.

Questi risultati indicano che il ripristino del fenotipo di crescita lenta nel ceppo mutante sgs one top three avviene a bassi livelli di espressione della proteina Werner. Quando colture in crescita logaritmica di ceppi sgs, one top three trasformati con Werner o le sue varianti sono state inoculate in diluizione seriale decimale su piastre SC contenenti triptofano e glucosio o galattosio, in presenza di MMS o HU, abbiamo osservato che l'espressione di Werner aumenta la sensibilità al MMS e all'HU del ceppo SGS one top three. Inoltre, questo effetto sulla sensibilità a MMS e HU nel ceppo SGS one top three richiede l'attività elicasi dell'ATP di Werner, ma non l'attività di esonucleasi.

Infine, l'espressione di Werner ripristina anche il caratteristico ritardo di due SG del top three, come indicato dall'elevata popolazione di grandi cellule fuse. Nelle cellule mutanti sgs uno top three che esprimono Werner. In confronto con le cellule sgs, quelle del top three trasformate con vettore sono state colorate con Dabi.

Per visualizzare i nuclei e le frecce che indicano nuclei non divisi espressione di Werner. Negli sgs trasformati, una delle tre cellule superiori è stata indotta aggiungendo concentrazioni di galattosio indicate e le cellule sono state raccolte sei ore dopo l'induzione. Quantità uguali di lisato totale di cellule sono state caricate su gel di poliacrilamide SDS all'8-16%, seguiti da rilevamento tramite immunoblotting con anticorpo anti-Warner.

Abbiamo mostrato come indagare i fenotipi cellulari associati a specifici ceppi mutanti di lievito per chiarire le funzioni cellulari e molecolari del gene umano learner mediate dalle sue attività catalitiche e interazioni proteiche. Il lievito può essere utilizzato come organismo modello per studiare le funzioni del gene in percorsi ben definiti. Nell'eseguire queste procedure, è fondamentale selezionare un ceppo mutante di lievito appropriato per distinguere il ruolo del gene in esame all'interno di percorsi specifici.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.