Denaturazione gel elettroforesi gradiente (DGGE)

Ok. Ciao, mi chiamo Celeste Peterson e sono un ricercatore presso l'Università di Harvard, dove studio le comunità microbiche di biofilm. Sto analizzando le comunità batteriche esaminando la loro sequenza di 60 N e come questa sequenza varia nel tempo e nello spazio. Per fare ciò, utilizzo la DDGE.

Questa non è una corsa di acrilamide normale del mio gel, deve essere mantenuta a 60 gradi durante l'esecuzione e il tampone deve essere pompato continuamente. Riscalderemo quindi il tampone per circa un'ora finché non raggiungerà i 60 gradi, dopodiché potremo eseguire l'elettroforesi. Ora laverò questa piastra con una soluzione diluita di uc, rimuovendo le impurità, e accenderò la lampada.

Qualsiasi cosa del genere può causare irregolarità. È importante rimuovere tutta l'acqua. Quindi, quando assemblo il gel, posiziono quel chip all'esterno del gel.

Quindi il gel sarà tra questi due pezzi di vetro e il chip sarà all'esterno e non influirà sul gel interposto. Ora assemblerò il gel in queste pinze e poi le stringerò insieme serrandole ruotando verso destra. Come per ogni gel, è importante assicurarsi che la base sia perfettamente allineata.

Per evitare la formazione di bolle, ora ruotiamo il gel e lo posizioniamo qui per sigillarlo con la guarnizione. È quindi importante che, durante questa operazione, il gel sia perfettamente allineato con la guarnizione. I pomelli laterali entrano in posizione e si preme verso il basso per creare la chiusura ermetica.

Questa è quindi una siringa da 30 mil. Questa parte e questa parte sono incluse nel kit bio red e si agganciano così. Serve semplicemente a rimuovere l'acqua in eccesso dai tubi.

Posizionare quindi il tubo sul gel per caricare il gel. Innanzitutto inserire un adattatore nel tubo e poi un ago con quell'adattatore piccolo, posizionandolo esattamente al centro del gel, in modo che si trovi leggermente al di sotto del vetro inferiore. Successivamente, questo adattatore a filo viene inserito nel tubo lungo e sarà collegato a due siringhe uguali contenenti rispettivamente la soluzione ad alta e a bassa densità.

Queste sono quindi soluzioni pre-preparate. Nella soluzione blu, ho aggiunto un colorante che indica semplicemente che si tratta della soluzione più denaturante, mentre questa è la soluzione di gradiente meno denaturante, quella a bassa densità. Contengono già tutti gli ingredienti necessari.

E ora preparerò, in realtà raddoppierò la quantità settimanale. Una volta ottenuta la consistenza desiderata, avrete circa cinque-sette minuti per riempire il gel prima che il colon si sollevi. Ora riempiamo la siringa con la soluzione.

Quindi lo riempirò con circa 15 la soluzione. Poi, per eliminare eventuali bolle d'aria, lo capovolgerò e premerò delicatamente finché la bolla d'aria in cima non sarà sparita. Ora questa piccola vite andrà in questa scanalatura.

Questo adattatore si allineerà con questa morsetto qui, e verrà fissato saldamente con una morsetto a C. Successivamente, questo tubo verrà collegato alla siringa. La stessa operazione viene eseguita sull'altro lato con la matrice ad alta densità quando è il momento di effettuare la somministrazione.

Perciò girerò questa manopola con un movimento costante in senso orario. Inizialmente uscirà prima la soluzione blu, poiché è quella più densa, e formerà la parte inferiore del gel. Successivamente, dopo un breve intervallo, la soluzione trasparente comincerà a riempire il gel e si formerà il gradiente.

Un momento, inclinatelo leggermente e non appena avete finito di versare il gel, lavate immediatamente i vostri tubi perché polimerizzeranno. È il gruppo lì. Poi premete verso il basso. Quindi questo piccolo, e sull'altro lato farò la stessa cosa. Ok.

Ciao, mi chiamo Celeste Peterson e sono un ricercatore presso l'Università di Harvard che studia le comunità microbiche. Sto analizzando le comunità batteriche esaminando la loro sequenza 16S rRNA e come questa sequenza varia nel tempo e nello spazio. Per fare ciò, utilizzo la DDGE.

La DGE, o elettroforesi in gel denaturante, si basa sull'uso di un gradiente in cui il DNA, man mano che migra lungo il gradiente, si denatura. Di conseguenza, diverse specie di 16S si arrestano in punti diversi del gradiente.

E così finisce per diventare un'impronta delle diverse specie di sexiness presenti nella comunità. Pertanto, l'obiettivo del mio esperimento è determinare quali organismi sono presenti nella comunità e come questa composizione cambi nel tempo e nello spazio. Posso eseguire un gel di sexiness DDD e quindi ritagliare le bande per identificare le specie rappresentate in ciascuna comunità.

Uno dei problemi principali quando si esegue un gel DDG è determinare il gradiente più adatto. Questo richiede semplicemente alcune prove per stabilire, per una specifica comunità, il tipo di gradiente più indicato. Quello che sto usando oggi è un gradiente dal 35 al 55% di urea.

Uno dei principali problemi che può verificarsi con questa tecnica è la comparsa di strisce diffuse nelle corsie. Per quanto riguarda questo aspetto, per qualche motivo, una delle soluzioni migliori consiste nell'elettroforesi per un tempo molto lungo, dopo il quale le strisce diffuse scompaiono. Oggi la sto utilizzando semplicemente per comunità batteriche generali, ma questa tecnica può essere impiegata anche per una specifica famiglia di batteri al fine di osservarne le variazioni nel tempo, e in questi casi i gel tendono ad essere molto nitidi.

È inoltre possibile analizzare le mutazioni in singoli geni mediante DDGE.