Name: Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Impara l'iniezione retro-orbitale in zebrafish adulti per studi di trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Questa tecnica consente di analizzare la dinamica delle cellule del sangue in vivo con microscopia a fluorescenza.

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Questo lavoro è supportato da Howard Hughes Medical Institute e una borsa di studio del NIH per lo studio della ematopoiesi embrionale.

Parte 1. Preparazione del materiale di iniezione <ol><li> Tg (globina: GFP) celle: </li><li> Bleed pesce adulto donatore utilizzando punta della pipetta 10ul rivestito in eparina (1unit/ul) a pescare puntura dietro branchia. </li><li> Aspirare globuli rossi e dispensare nel buffer di cella (0.9x PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep). </li><li> Cellula sospensione filtro su mesh 40uM e determinare la concentrazione di cellule utilizzando emocitometro come precedentemente descritto da LeBlanc et al. </li><li> Spin down e risospendere in buffer cella a concentrazione desiderata in modo tale che il volume di iniezione finale non è più di 5UL. Qui iniettare 1,5-2000000 cellule / destinatario. </li><li> Per le, destrano Texas Red ®, sciogliere il colorante in DPBS per una concentrazione di iniezione finale di 10-12 mg / mL. Piano per iniettare 4 uL per pesce. </li></ol> Parte 2. Iniezione <ol><li> Anestetizzare pesce in tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml pesci d'acqua). </li><li> Lavare Hamilton siringa 3-4 volte prima dell'iniezione utilizzando etanolo al 70%. Lavare 3-4 volte con DPBS 0.9x. </li><li> Luogo pesce lato dorsale e rivolta a destra sulla spugna umida. </li><li> Tenere la siringa Hamilton con la mano destra e con il dito indice sullo stantuffo. Delicatamente stabilizzare il corpo del pesce con la mano sinistra. </li><li> La posizione della lancetta con lo smusso rivolto verso l'alto in modo tale che se l'occhio del pesce s fosse un orologio, l'ago sarebbe indicando la posizione 7:00 e con un angolo di 45 gradi per il pesce (figura 1). </li><li> Inserire delicatamente l'ago 1-2 mm in posizione 07:00 e lentamente spingere il pistone. </li><li> Permettono di recuperare il pesce in acqua dolce E3. </li><li> Lavare ago, come descritto sopra, tra le iniezioni di reagenti diversi. </li><li> Flick soluzione cellula per risospendere le cellule ogni pochi minuti per evitare grumi di cellule. </li><li> Mantenere il flusso di pesce per 1 settimana con cambi d'acqua ogni giorno per evitare l'infezione. Noi mantenere i pesci in acqua terapia intensiva per questo periodo (cappotto stress da 10 ml + 5 ml + pemafix melafix 5mL per 38 litri di acqua E3). </li></ol> Parte 3. Rappresentante Risultati Quando eseguito correttamente, è possibile visualizzare materiale iniettato se è stato etichettato in qualche modo. Per esempio, Tg (globina: GFP) globuli rossi dovrebbe essere visto sotto un microscopio a fluorescenza dissezione circola nei vasi dei pesci destinatario casper subito dopo l'iniezione, come illustrato in figura 2. Allo stesso modo, l'iniezione di un destrano 70kDa, coniugato con Texas Red ® possono essere visualizzati nel sistema vascolare del pesce trasparente immediatamente successivo retro-orbitale di iniezione (figura 3). Cellule renali fluorescenti da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore può anche essere iniettato retro-orbitalmente in pesci irradiati destinatario casper. Queste cellule finalmente a casa per il midollo destinatario (figura 4a) e può quindi andare a ripopolare il rene dopo diverse settimane (figura 4b). Se l'iniezione è troppo bassa o l'angolo dell'ago bypassa il retro-orbitale cavità dei seni venosi, materiale iniettato può essere visualizzata pooling intorno all'occhio o che scorre fuori di esso. In alternativa, se l'iniezione è troppo profondo, pesce possibile che si verifichino danni ai tessuti o sanguinamento eccessivo, anche se può ancora recuperare. Quando eseguito correttamente, la mortalità dopo retro-orbitale di iniezione deve essere inferiore al 5% del totale pesce iniettato e il successo di consegna alla circolazione sanguigna dovrebbe essere superiore al 90% del totale pesce iniettato. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1"> Figura 1: Illustrazione di retro-orbitale tecnica di iniezione. L'occhio destro del pesce è rappresentato come un orologio analogico in cui l'orologio sette o posizione corrisponde al punto d'iniezione corretta. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 2"> Figura 2: Tg (globina: GFP) globuli rossi circolanti nei vasi della coda di un pesce adulto casper tre giorni dopo la retro-orbitale iniezione. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 3"> Figura 3: iniezione di successo di una 70kDa destrano coniugato con Texas Red ® usato come colorante fluorescente produce vascolarizzazione nei pesci adulti trasparente, Casper ed è facilmente visualizzati utilizzando standard di tutta la microscopia a fluorescenza animale. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Figura 4a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 4a"> Figura 4a: Tre giorni successivi retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, le cellule possono essere visualizzati homing al midollo reni del combustibile irraggiato pesce destinatario casper adulti. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Figura 4b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 4b"> Figura4b: Quattro settimane dopo la retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, il ripopolamento del rene destinatario con verde cellule renali di tutto midollo del donatore possono essere visualizzati in irradiati pesce destinatario casper adulti.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Retro-orbitale iniezione in zebrafish adulto offre la massima efficienza della consegna del materiale iniettato alla circolazione sanguigna con la più bassa incidenza di mortalità. A causa della natura del punto di iniezione, la puntura sembra guarire in fretta, diminuendo l&#39;insorgenza di infezioni e la quantità di perdita di sangue. Il sito può anche essere iniettato ripetutamente nel corso di un breve periodo di tempo per iniezioni giornaliere di farmaci, per esempio. Grandi quantità d...

<table><tbody><tr><td>Sale sodico di eparina da mucosa intestinale suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>Vial prepesato di 300 unità USP</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Destrano, Texas Red&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Siringa microlitrica</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10 µL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Trattamento farmacologico degli animali tutto è uno strumento essenziale in qualsiasi sistema modello per studi di genetica e chimica farmacologica. Per via endovenosa (ev) è spesso la forma più efficace e non invasiva di consegna di un agente di interesse. Nel pesce zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Iniezione IV di farmaci è stata a lungo una sfida a causa del diametro del vaso di piccole dimensioni. Questo si è dimostrato un ostacolo significativo per l&#39;iniezione di cellule durante il trapianto di cellule staminali emopoietiche. Storicamente, le iniezioni nel sangue sono state fatte direttamente al cuore. Tuttavia, questa intra-cardiaca procedura ha un tasso di mortalità molto alto, come il cuore è spesso perforato durante l&#39;iniezione di lasciare il pesce a rischio di infezione, perdita massiccia di sangue o di danno d&#39;organo fatale. Basandoci sulla nostra esperienza con il mouse, abbiamo sviluppato una nuova procedura di iniezione nel pesce zebra in cui il sito di iniezione è dietro l&#39;occhio e nel retro-orbitale del seno venoso. Questo retro-orbitale (RO), tecnica di iniezione è stato impiegato con successo in entrambi l&#39;iniezione di farmaci nei pesci adulti, nonché il trapianto di cellule del midollo intero rene. Iniezione RO ha un tasso di mortalità molto più basso rispetto ai tradizionali iniezione intra-cardiaca. I pesci che vengono iniettati retro-orbitalmente tendono a sanguinare iniezione meno seguito e sono ad un rischio molto più basso di lesioni per un organo importante come il cuore. Altre cellule, se eseguito correttamente, iniettati e / o farmaci entrare direttamente nel flusso sanguigno che permette composti di esercitare il loro effetto sul pesce intero e le cellule renali con facilità a casa per la loro nicchia. Così, questa nuova tecnica di iniezione riduce la mortalità, consentendo una distribuzione efficiente del materiale nel sangue dei pesci adulti. Qui esemplificare questa tecnica retro-orbitale iniezione di Tg (<em&gt; Globina</em&gt;: GFP) in cellule adulte<em&gt; Casper</em&gt; Pesci così come l&#39;iniezione di un colorante rosso fluorescente (destrano, Texas Red<em&gt;</em&gt;) In adulti<em&gt; Casper</em&gt; Pesce. Abbiamo poi visualizzare le iniezioni di successo al microscopio a fluorescenza intero animale.

Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Il trattamento farmacologico di animali interi è uno strumento essenziale in qualsiasi sistema modello per studi farmacologici e di genetica chimica. L'iniezione endovenosa (IV) è...

Prima di tutto, i globuli rossi del donatore vengono prelevati da pesci transgenici esprimenti la GFP nei globini, praticando una puntura al cuore dell'animale donatore ed aspirando i globuli rossi. Una volta preparate le cellule per l'iniezione, i pesci riceventi vengono iniettati per via retro-orbitale e successivamente osservati mediante microscopia a fluorescenza standard su animali interi, al fine di verificare l'avvenuta iniezione di cellule marcate fluorescentemente. Analogamente, viene preparata una destrina colorata coniugata con Texas red, che viene iniettata per via retro-orbitale, e l'animale iniettato viene quindi sottoposto a imaging per confermare l'esito positivo dell'iniezione.Ciao, sono Emily Atch del laboratorio di Leonard Zan del Dipartimento di Ematologia e Oncologia del Children's Hospital di Boston. Oggi vi mostreremo una procedura di iniezione retroorbitale in zebrafish adulti. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.Iniziamo. Dimostreremo le iniezioni retro-orbitarie di cellule transgeniche di globina GFP e di un colorante fluorescente rosso, la destrina coniugata con Texas red, in pesci Casper adulti, una razza trasparente di pesce zebra, per preparare cellule transgeniche di globina GFP. Prelieveremo le cellule del sangue dal pesce donatore adulto utilizzando una punta di pipetta da 10 microlitri rivestita di eparina, praticando una puntura dietro le branchie, aspirando i globuli rossi e trasferendoli in un buffer cellulare.Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 40 micrometri. Dopo aver determinato la concentrazione delle cellule utilizzando un emocitometro come precedentemente descritto da LeBlanc et al., centrifugare le cellule a 1500 g per cinque minuti. Ri-sospendere le cellule in tampone cellulare a una concentrazione desiderata in modo che il volume finale di iniezione non superi i cinque microlitri.In questa dimostrazione, inietteremo da 1,5 a 2 milioni di cellule per ricevente per preparare il colorante fluorescente rosso, sciogliendolo in DPBS per una concentrazione finale di iniezione di 10-12 milligrammi per millilitro. Inietteremo quattro microlitri per pesce poiché la procedura di iniezione è la stessa. Indipendentemente dal materiale iniettato, mostreremo soltanto l'iniezione del colorante fluorescente rosso.Prima di iniettare il pesce, lavare la siringa Hamilton da tre a quattro volte utilizzando etanolo al 70%. Risciacquare da tre a quattro volte con 0,9 XDPS. Dopo aver anestetizzato il pesce in Trica, posizionare il pesce con il lato dorsale verso l'alto e rivolto verso destra su una spugna umida.Tenere la siringa Hamilton caricata con la mano destra, con l'indice sulla leva del pistone, mentre con la mano sinistra si stabilizza delicatamente il corpo del pesce. Posizionare l'ago con il bisellino rivolto verso l'alto, in modo che, se l'occhio del pesce fosse un orologio, l'ago punti verso la posizione delle sette. Inserire delicatamente l'ago da uno a due millimetri nella posizione delle sette, con un angolo di 45 gradi rispetto al pesce, quindi premere lentamente il pistone.Lasciare che il pesce si riprenda in acqua E tre fresca. Tenere i pesci lontani dal flusso per una settimana con cambi d'acqua quotidiani per evitare infezioni; manteniamo i pesci in acqua ICU durante questo periodo. Quando le iniezioni retro-orbitarie vengono eseguite correttamente, è possibile visualizzare il materiale iniettato che è stato marcato.Ad esempio, globuli rossi transgenici contenenti globina GFP possono essere osservati al microscopio fluorescente da dissezione mentre circolano nel sistema vascolare della coda di un pesce Casper adulto ricevente tre giorni dopo l'iniezione; analogamente, un'iniezione riuscita di una destrina da 70 chilodalton coniugata con Texas red produce immediatamente una vascolarizzazione fluorescente. Nei pesci Casper adulti trasparenti, facilmente visualizzabili mediante microscopia fluorescente standard su organismo intero, cellule fluorescenti del midollo renale provenienti da pesci donatori transgenici con beta-actina GFP possono essere iniettate anche per via retro-orale in un pesce Casper ricevente irradiato. Queste cellule raggiungeranno infine il midollo del ricevente, come mostrato qui, tre giorni dopo l'iniezione; quattro settimane più tardi, queste cellule verdi del donatore possono proseguire nella ripopolazione del rene del ricevente.Abbiamo appena mostrato come eseguire iniezioni retro-orbitarie in zebrafish adulti. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di iniettare con l'ago a un angolo di 45 gradi rispetto al piano del pesce. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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