Misurare la tensione indotta a membrana con Di-8-ANEPPS
19 novembre 2009
Campo elettrico esterno induce una tensione sulla membrana di una cellula, chiamata potenziale di membrana indotta (ΔΦ). Usando il potenziometrica tintura di-8-ANEPPS, è possibile misurare la ΔΦ modo non invasivo. Questo video mostra il protocollo per la misurazione ΔΦ utilizzo di-8-ANEPPS.
Per un biologo, una cellula è il mattone fondamentale della vita che contiene un certo numero di organelli diversi, ognuno dei quali svolge compiti specifici e insieme permette alla cellula di eseguire le sue funzioni vitali dal punto di vista elettrico. Tuttavia, la struttura interna non è molto importante, e la cellula può essere considerata come un citoplasma conduttivo racchiuso da una membrana isolante e circondato da un ambiente esterno conduttivo. Un piccolo squilibrio nelle concentrazioni ioniche, con gli ioni in eccesso che si accumulano vicino alla membrana, determina il potenziale di membrana a riposo.
Posizionare una cellula in un campo elettrico provoca una ridistribuzione locale delle cariche su entrambi i lati della membrana. Il risultato è una tensione di membrana indotta, che si sovrappone alla tensione di riposo e scompare dopo che il campo viene spento. Con forme cellulari semplici, la tensione di membrana indotta può essere calcolata analiticamente per una cellula sferica.
È data dall'equazione di Schwan, secondo cui la tensione è proporzionale all'intensità del campo e alle dimensioni della cellula, e segue la funzione coseno lungo la membrana. Per forme cellulari più complesse, la tensione indotta può discostarsi notevolmente dalla funzione coseno e deve essere determinata numericamente mediante un computer potente oppure sperimentalmente utilizzando un colorante metrico del potenziale. Uno dei coloranti metrici del potenziale comunemente utilizzati a questo scopo è il dietil AIPs.
Un colorante rapido con spettri di eccitazione e di emissione dipendenti dal potenziale di membrana, AIPs diventa fortemente fluorescente quando si lega alla membrana, con una variazione dell'intensità di fluorescenza proporzionale alla variazione del potenziale di membrana. Questo video mostra il protocollo per misurare il potenziale di membrana indotto utilizzando D AIPs. In questo esempio, vengono utilizzate cellule ovariche di criceto cinese, piastrate in camere a 100.000 cellule per camera.
Nel coltura HAMF 12, integrare il mezzo con siero fetale di vitello, L-glutammina e antibiotici; incubare le cellule nel loro mezzo di coltura per due-quattro ore per ottenere cellule aderenti di forma sferica, oppure per 16-20 ore per ottenere singole cellule aderenti con forme più complesse. Preparare una soluzione madre di 10 milioni di MO di diet aaps disciolta in DMSO nel flaconcino originale. Alcune linee cellulari potrebbero richiedere l'aggiunta di onic per facilitare l'incorporazione del colorante nella membrana. Trasferire un millilitro di spinners, modifica del mezzo essenziale minimo (SMEM), in un tubo EOL aggiungendo 2,5 microlitri di onic al 20% e tre microlitri di diet aaps 10 millimolare.
Questo produce una soluzione di carico contenente circa 30 micromolar di diet aaps e lo 0,05% di onic. Sostituire il mezzo di coltura nella camera con la soluzione di carico. Trasferire la camera in frigorifero per 10 minuti a quattro gradi Celsius a questa temperatura.
L'internalizzazione del colorante attraverso la membrana plasmatica è in gran parte inibita dopo la colorazione; lavare accuratamente più volte il colorante in eccesso con SMEM puro. Infine, lasciare 1,5 millilitri di SMEM nella camera. Le cellule vengono osservate utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di obiettivo ad immersione in olio, un monocromatore e una telecamera CCD.
Nel software di acquisizione, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 419 nanometri e scegliere un filtro a banda passante regolato approssimativamente a 605 nanometri, anche se non applicato in questo caso. Diet aaps consente anche misurazioni raziometriche del potenziale di membrana. Posizionare la camera con le cellule sul palchetto del microscopio, posizionare gli elettrodi nella parte inferiore della camera e collegarli al generatore di impulsi.
In questo esempio, viene generato un impulso quadrato con un'ampiezza di 35 volt e una durata di 50 millisecondi. Utilizzando un alimentatore a tensione continua e un interruttore controllato da microprocessore, l'impulso viene applicato a una coppia di elettrodi, creando un campo elettrico tra di essi e inducendo una tensione sulla membrana. La somministrazione dell'impulso deve essere sincronizzata con l'acquisizione dell'immagine.
Individuare le cellule di interesse, applicare un singolo impulso elettrico o una sequenza di impulsi per ogni impulso. Acquisire due immagini di fluorescenza: l'immagine di controllo immediatamente prima dell'impulso e l'immagine dell'impulso durante l'impulso stesso, a causa della bassa risposta del colorante. I cambiamenti nella fluorescenza sono difficili da distinguere e diventano evidenti solo dopo l'elaborazione; aprire quindi le immagini per ogni impulso.
Sottrarre il fondo sia nell'immagine di controllo che nell'immagine dell'impulso. Selezionare una cellula e impostare la regione di interesse in modo che corrisponda alla membrana. Misurare la fluorescenza lungo questa regione nelle immagini di controllo e dell'impulso e trasferire i valori in un foglio di calcolo per ogni impulso.
Sottrarre i dati del controllo dai dati dell'impulso e dividere il risultato per i dati del controllo per ottenere le variazioni relative della fluorescenza. Se viene applicata una sequenza di impulsi, i valori di variazione relativa determinati per ciascun impulso possono essere mediati. Per ottenere una misurazione più affidabile, trasformare le variazioni relative della fluorescenza nella tensione di membrana indotta.
Utilizzando una curva di calibrazione, è possibile ottenere una stima approssimativa di questa curva dalla letteratura, ma per una maggiore accuratezza, essa deve essere misurata per ogni configurazione specifica. Riportare in grafico la tensione in funzione della lunghezza relativa dell'arco. La curva può essere anche resa liscia utilizzando un filtro adeguato per cellule sferiche.
L'andamento risultante è simile a un coseno, in accordo con l'equazione di Schwan. Per forme cellulari più complesse, la stessa procedura produce distribuzioni spaziali più intricate del potenziale di membrana.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la misurazione della tensione di membrana indotta (ΔΦ) nelle cellule mediante l'uso del colorante potenziometrico di-8-ANEPPS. La tensione indotta si verifica quando una cellula viene posta in un campo elettrico, determinando una ridistribuzione delle cariche attraverso la membrana.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Elettrofisiologia
- Biologia cellulare
- Dinamica delle membrane
Sfondo
- Le cellule sono strutture conduttive racchiuse da una membrana isolante.
- Il potenziale di membrana a riposo è influenzato dagli squilibri nelle concentrazioni ioniche.
- Il potenziale di membrana indotto può essere calcolato o misurato sperimentalmente.
- Di-8-ANEPPS è un colorante utilizzato per la misurazione non invasiva delle variazioni del potenziale di membrana.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo per misurare il potenziale di membrana indotto nelle cellule.
- Illustrare l'uso del di-8-ANEPPS nella microscopia a fluorescenza.
- Fornire un protocollo dettagliato da seguire per i ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di colture cellulari in mezzi specifici.
- Caricamento delle cellule con il colorante di-8-ANEPPS.
- Applicazione di impulsi elettrici per indurre una tensione di membrana.
- Acquisizione di immagini di fluorescenza per misurare le variazioni della tensione di membrana.
Risultati principali
- Il protocollo consente la misurazione della tensione di membrana indotta in diverse forme cellulari.
- Le variazioni dell'intensità della fluorescenza si correlano ai livelli di tensione indotta.
- La elaborazione dei dati permette una determinazione accurata della tensione di membrana.
- I risultati sono in accordo con le previsioni teoriche per cellule sferiche.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio affidabile per lo studio della dinamica del potenziale di membrana.
- Il Di-8-ANEPPS è efficace per misurazioni non invasive in cellule vive.
- Un'ulteriore calibrazione potrebbe migliorare l'accuratezza delle misurazioni in diversi apparati sperimentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione del potenziale di membrana indotto fornisce un'analisi non invasiva dell'elettrofisiologia cellulare, consentendo la validazione degli obiettivi nella modulazione dei canali ionici e nei percorsi associati alla membrana. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando le variazioni biofisiche indotte dal composto a risultati funzionali in cellule vive. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nella fase iniziale della scoperta quantificando la dinamica del potenziale di membrana come biomarcatore traslazionale per modelli di cellule neuronali, cardiache ed eccitabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche che coinvolgono il flusso ionico e la modulazione del potenziale di membrana.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target mediante la correlazione tra variazioni della fluorescenza del colorante e modifiche elettrofisiologiche indotte dai composti.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nell'identificazione dei composti promettenti grazie a letture quantitative in tempo reale della tensione di membrana.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening successivo mediante protocolli standardizzati di carico del colorante e di acquisizione delle immagini.
- Output quantitativo: Genera variazioni dell'intensità di fluorescenza proporzionali al potenziale di membrana, consentendo l'analisi dose-risposta.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su diversi tipi cellulari e parametri di impulso per una valutazione costante dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Si applica a modelli di cellule eccitabili in cui il potenziale di membrana funge da biomarcatore traduttivo per fenotipi neuronali e cardiaci.
- Continuità Preclinica: Collega l'elettrofisiologia della fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso spostamenti misurabili e riproducibili del potenziale di membrana.
- Decisioni Basate sul Rischio: Guida i criteri di avanzamento identificando composti che inducono variazioni significative e riproducibili del potenziale di membrana.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per campagne di screening di modulatori dei canali ionici e della membrana.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando come i composti alterano la tensione di membrana indotta in risposta a impulsi di campo elettrico.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso letture riproducibili di fluorescenza che riflettono variazioni in tempo reale della tensione di membrana.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative mediante variazioni relative della fluorescenza convertite in tensione indotta utilizzando curve di calibrazione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica impiegando la tensione di membrana come biomarcatore in sistemi cellulari eccitabili rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità elettrofisiologica riutilizzabile in diversi progetti che richiedono letture del potenziale di membrana.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nell'interazione con il bersaglio, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella modulazione dei canali ionici.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle misurazioni del potenziale di membrana basate su coloranti tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci riguardo al proseguimento o meno dei progetti, maggiore efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi incentrati sull'elettrofisiologia.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su soglie quantitative del potenziale di membrana.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza, elettrofisiologia e protocolli di manipolazione dei coloranti.
- Necessita di strumentazione comprendente microscopio a fluorescenza con monocromatore, telecamera CCD, generatore di impulsi e camere per elettrodi.
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per il caricamento del colorante, i passaggi di lavaggio e le condizioni di acquisizione delle immagini, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento per forme cellulari diverse, poiché la distribuzione del potenziale indotto varia in base alla geometria secondo l'equazione di Schwan.
- Comprende limitazioni pratiche come il fotoblesamento del colorante, la necessità di calibrazione per ogni configurazione e la sincronizzazione tra l'erogazione dell'impulso e l'acquisizione delle immagini.
