Name: Spinal Cord Elettrofisiologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Scopri la laminectomia ventrale per isolare il midollo spinale di topo neonato e registrare l'attività neuronale con elettrodi. Questa tecnica elettrofisiologica è fondamentale per studi neuroscientifici avanzati.

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Samuel L. Pfaff è docente nei Laboratori di espressione genica presso il Salk Institute for Biological Studies e un investigatore della Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dal Christopher e Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker e Mike Sullivan in Risorse Multimediale presso il Salk Institute ha fornito assistenza con la fotografia e montaggio.

1. Preparare artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) 1. Per prima cosa preparare un 2L di uno stock di 10X aCSF senza magnesio o di calcio. Reagenti elencati in millimolare. I numeri di catalogo si riferiscono alla Sigma / Aldrich. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> 2 litri 10X aCSF (senza Mg o Ca) </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> mM </td><td> g/2L </td><td> Catalogo </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 40 </td><td> 5,96 </td><td> P-9333 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 1280 </td><td> 149,61 </td><td> S-7653 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 210 </td><td> 35,28 </td><td> S-6297 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 5 </td><td> 1,38 </td><td> S-9638 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 300 </td><td> 108,12 </td><td> D-9434 </td></tr><tr><td colspan="4"> Aggiungere acqua distillata per 2L </td></tr></tbody></table> Ci sarà anche preparare soluzioni 1M di MgSO 4 e CaCl 2 in 50mL di acqua per consentire adeguamenti molarità da esperimento a esperimento e per assicurare il calcio rimane in soluzione. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Calcio 1M e degli stock di magnesio </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> M </td><td> g/50mL </td><td> Catalogo </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 </td><td> 7,35 </td><td> C-5080 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 1 </td><td> 12,33 </td><td> M-5921 </td></tr></tbody></table> La soluzione aCSF deve essere gasati con CarboGen (95% O2 / 5% CO2) per abbassare il pH prima di aggiungere calcio o il calcio sarà precipitato. <table border="1" cellpadding="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 litro aCSF </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 10X aCSF </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 1 ml (dissezione) 2 ml (registrazione) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungi ~ 800 mL di acqua distillata, gas con CarboGen per 2 minuti prima di aggiungere calcio </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiungere acqua distillata a 1L. </td></tr></tbody></table> Le pompe e tubi e piatti sezionare devono essere risciacquati prima e dopo l'uso. Dissezione Mentre dissezione, 1 mm di calcio aCSF deve essere continuamente gasati con CarboGen. Il aCSF può essere deviato da una bottiglia al piatto dissezione e pompato dal piatto dissezione alla bottiglia o inviato a rifiuti. Noi usiamo un elastomero (Sylgard, Dow Corning) piatto rivestito di eseguire la dissezione. Il mouse neonatale è rapidamente decapitato con forbici affilate e una incisione fatta con le forbici attraverso il torace e l'addome ventrale. L'animale viene poi svuotato. Il mouse eviscerate è risciacquata con aCSF. L'animale è poi appuntata al piatto dissezione con perni insetti inserito attraverso la arti anteriori e alla base della coda. La colonna vertebrale viene rimossa eseguendo una laminectomia ventrale. La colonna vertebrale è tenuto con una pinza piccola e una lama di piccole forbici è inserito immediatamente dorsale alla colonna vertebrale. La lamina viene tagliato da un lato e poi l'altro mentre leggero sollevamento della colonna vertebrale. Questo avviene per la lunghezza della colonna vertebrale. Il midollo spinale è stato rimosso dal taglio lungo entrambi i lati del midollo spinale per tagliare le radici dei nervi spinali e tagliare le meningi che circonda il midollo spinale. Abbiamo tagliato sui lati destro e sinistro, poi abbiamo tagliato le meningi attaccato al lato dorsale del midollo spinale per liberarlo. Il cavo isolato è poi appuntata al piatto in prossimità della presa aCSF per assicurare una buona ossigenazione se gli animali vengono sezionati aggiuntivi. Il midollo spinale isolato viene trasferito in un piatto di registrazione con un cucchiaio o una spatola. Qui profumato la preparazione con aCSF ossigenato calcio 2mm. Il midollo spinale è appuntato il piatto rivestito in elastomeri e micromanipolatori utilizzato per spostare extracellulare, tutto elettrodi aspirazione radice vicino alle radici. Quando l'elettrodo è vicino alla fine radice libero, delicata aspirazione viene applicata per disegnare la radice nel elettrodo di aspirazione. Questo processo può essere ripetuto per registrare radici contemporaneamente. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Decapitazione e l'eviscerazione. A. Rapidamente decapitare il mouse con forbici affilate. Contributi più o meno dal tronco cerebrale può essere raggiunto a seconda del livello di taglio. B. Luogo una lama delle forbici nell'apertura della cavità toracica creato dalla decapitazione. Aprire il torace e l'addome ventrale alla base della coda. Rimuovere i visceri e sciacquare con aCSF. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. La rimozione della colonna vertebrale. A. Inserire la lama delle forbici sinistra nello spazio tra la colonna vertebrale e del midollo spinale alla destra del midollo spinale e tagliare le ossa che ventrale del midollo. Quindi inserire la lama delle forbici a destra nello spazio tra la colonna vertebrale e del midollo spinale a sinistra del midollo spinale e taglio. B. Ripetere questo processo mentre si applica una leggera trazione alla colonna vertebrale. Fare attenzione a non forare il midollo spinale, tenendo le forbici con un angolo basso. <img src="/files/ftp_upload/1660/1660fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La rimozione del midollo spinale. A. Inserire la lama delle forbici sinistra nello spazio tra il midollo spinale e le ossa a destra del midollo spinale e tagliare le radici spinale e delle meningi che laterale per il cavo. Quindi inserire la lama delle forbici a destra nello spazio tra il midollo spinale e le ossa a sinistra del midollo spinale e tagliare le radici spinale e delle meningi che laterale per il cavo. B. Infine, sollevare delicatamente il midollo rostrale e tagliare le meningi collegare il cavo di dorsale per le lamine. Anche in questo caso non prendere cura di forare il midollo spinale, tenendo le forbici con un angolo basso. Non tagliare le radici troppo vicino al midollo spinale.

<ol><li>Myers, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+input+is+required+during+embryonic+development+to+mediate+proper+assembly+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits.</a> Neuron. 46, 37-49 (2005).</li>
<li>Goulding, M., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+circuits+that+generate+simple+rhythmic+behaviors+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of circuits that generate simple rhythmic behaviors in vertebrates.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 14-20 (2005).</li>
<li>Gallarda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+axial+motor+and+sensory+pathways+via+heterotypic+trans-axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling.</a> Science. 320, (2008).</li>
<li>Gosgnach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V1+spinal+neurons+regulate+the+speed+of+vertebrate+locomotor+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">V1 spinal neurons regulate the speed of vertebrate locomotor outputs.</a> Nature. 440 (7081), 215-219 (2006).</li>
<li>Lanuza, G. M., Gosgnach, S., Pierani, A., Jessell, T. M., Goulding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+spinal+interneurons+that+coordinate+left-right+locomotor+activity+necessary+for+walking+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of spinal interneurons that coordinate left-right locomotor activity necessary for walking movements.</a> Neuron. 42 (3), 375-386 (2004).</li>
<li>Jiang, Z., Carlin, K. P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+functionally+mature+mouse+spinal+cord+preparation+for+the+study+of+spinal+motor+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An in vitro functionally mature mouse spinal cord preparation for the study of spinal motor networks.</a> Brain Res. 816 (2), 493-499 (1999).</li>
<li>Ziskind-Conhaim, L., Gao, B. X., Hinckley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+dual+modulatory+actions+on+spontaneous+postsynaptic+currents+in+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol dual modulatory actions on spontaneous postsynaptic currents in spinal motoneurons.</a> J Neurophysiol. 89 (2), 806-813 (2003).</li>
<li>Tabak, J., Rinzel, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+activity-dependent+network+depression+in+the+expression+and+self-regulation+of+spontaneous+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of activity-dependent network depression in the expression and self-regulation of spontaneous activity in the developing spinal cord.</a> J Neurosci. 21 (22), 8966-8978 (2001).</li>
<li>Chub, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-sensitive+MEQ+fluorescence+in+chick+embryo+motoneurons+following+manipulations+of+chloride+and+during+spontaneous+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chloride-sensitive MEQ fluorescence in chick embryo motoneurons following manipulations of chloride and during spontaneous network activity.</a> J Neurophysiol. 95 (1), 323-330 (2006).</li>
</ol>

CURA DEGLI ANIMALI<br /&gt;<br /Esperimenti&gt; sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Salk Institute for Biological Studies AIACUC.

L&#39;isolato midollo spinale neonatale fornisce un metodo di studio trattabili sviluppo1 sistema nervoso, 2. All&#39;interno del midollo spinale lombare di roditori neonatale, centrale circuito generando modello in grado di produrre locomozione fittizia in presenza di neurotrasmettitori. Questo locomozione fittizio costituito da un aumento dell&#39;attività ritmica, scoppi, che vengono prodotte a 0,2-0,5 Hz. Queste esplosioni sono organizzati per la produzione di alternanza destra-sinistra per tutta la lunghezza del ca...

<table><tbody><tr><td>KCl</td><td></td><td>P-9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>S-7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-6297</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td>D-9434</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Forbici grandi</td><td>Fine Science Tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Puntine per insetti</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 (Dow-Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beuta tarata da 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beuta tarata da 100 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spinal cord elettrofisiologia

Spinal Cord Electrophysiology

Il midollo spinale del mouse neonatale è un modello per studiare lo sviluppo della circuiteria neuronale e del movimento motorio. Dimostriamo la dissezione del midollo spinale e la preparazione del bagno di liquido cerebrospinale di registrazione artificiali utilizzati per gli studi locomotore. Una volta sezionato, l&#39;radici nervose del midollo spinale ventrale può essere collegato a un elettrodo per la registrazione dei segnali elettrofisiologici del circuito centrale generando modello all&#39;interno del midollo lombare.

Una dimostrazione dell&#39;isolamento di midollo spinale neonatale del mouse per studi elettrofisiologici.

Spinal Cord Elettrofisiologia

Il midollo spinale di topo neonato è un modello per lo studio dello sviluppo dei circuiti neurali e del movimento locomotore. Dimostriamo che il midollo spinale...

Ok. Salve, mi chiamo Alan Meyer e sono un assistente di ricerca nel Laboratorio faf presso l'Istituto Salk. Oggi vi mostrerò come eseguire una laminectomia ventrale per isolare il midollo spinale di un topo; inoltre, vi mostrerò come collegare il midollo spinale a un elettrodo. Per registrare la sua attività neurale, dovrete preparare due soluzioni per il midollo spinale: una per la dissezione e l'altra per il bagno di registrazione.L'unica differenza tra le due soluzioni sarà la concentrazione di cloruro di calcio. Dovrai prima preparare una soluzione di 10 X-A-C-S-F. Questo richiederà i reagenti elencati di seguito.Iniziare aggiungendo 100 millilitri della soluzione 10 X-A-C-S-F in un matraccio tarato da un litro. Successivamente, riempire il matraccio con acqua, lasciando dello spazio per evitare traboccamenti. Quando si gassifica la soluzione con un gas alla concentrazione del 5%CO2 e del 95%O2.Per abbassare il pH e ossigenare la soluzione, aggiungere un millilitro di solfato di magnesio uno molare. Successivamente, aggiungere un millilitro di una soluzione di cloruro di calcio uno molare alla soluzione di dissezione e aggiungere due millilitri di cloruro di calcio uno molare alla soluzione di registrazione. Topi di età compresa tra E 16,5 e P 4 possono essere utilizzati in questi esperimenti.Iniziare la dissezione del topo decapitandolo rapidamente con forbici affilate. Successivamente, praticare un'incisione lungo la linea mediana ventrale fino a raggiungere la coda. Quindi, utilizzando pinze, eviscerare il topo e risciacquare con la soluzione A CSF.Utilizzare la soluzione salina fisiologica A contenente cloruro di calcio uno millimolare per eseguire la dissezione. Posizionare il topo nella bacinella per dissezione e fissarlo inserendo un perno in corrispondenza delle quattro zampe e un altro alla base della coda. L'obiettivo di questa fase sarà isolare il midollo spinale effettuando un taglio lungo la linea tratteggiata rossa, separando la colonna vertebrale dalla lamina che racchiude il midollo spinale.Questo ti permetterà di esporre il midollo spinale. Successivamente, segui la linea per tagliare le meningi e le radici spinali, liberando così il midollo spinale. Individua la colonna vertebrale e utilizza una mano con pinzette per afferrare saldamente la colonna vertebrale e l'altra con forbici piccole.Per rimuovere il midollo spinale, mantenere le forbici con un angolo basso. Per evitare di perforare il midollo con le punte delle forbici, procederemo ora alla dissezione del midollo spinale. Seguendo la linea rossa, tagliare le meningi e le radici spinali.Per rimuovere il midollo spinale, è possibile tagliare lungo entrambi i lati del cordone e quindi lungo la linea mediana ventrale. È importante mantenere le forbici con un angolo basso per evitare di perforare il midollo spinale. È fondamentale evitare di tagliare le radici troppo vicine al midollo spinale.Successivamente, trasferire il midollo spinale nel bagno di registrazione e collegare gli elettrodi alle radici spinali. Posizionare l'elettrodo vicino alla radice. Quindi, utilizzando un'aspirazione delicata, introdurre il nervo all'interno dell'elettrodo.Grazie per aver guardato e spero che questo video sarà utile nei vostri futuri esperimenti.

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Una dimostrazione della fabbricazione e l'uso di un elettrodo extracellulare di aspirazione utilizzata per misurare le registrazioni elettrofisiologiche delle corde roditori neonatale...

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Il video dimostra la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali utilizzando un test basato su array multi-elettrodo (MEA). Le fette del midollo spinale vengono posizionate sul MEA e possono fondersi. Le fette fuse vengono separate meccanicamente creando una lesione, inducendo i neuroni propriospinali a crescere sopra la lesione e collegare le fette. L'attività elettrica delle fette viene valutata per identificare la rigenerazione delle connessioni funzionali.

Studio della rigenerazione delle connessioni funzionali tra le fette del midollo spinale utilizzando un array multi-elettrodo

Questo video presenta registrazioni elettrofisiologiche da co-colture organotipiche di fette di midollo spinale, catturate utilizzando un array multi-elettrodo o un dispositivo MEA. Queste registrazioni valutano la rigenerazione neuronale tra le fette. L'attività elettrica sincronizzata osservata conferma il successo della rigenerazione neurale.

Registrazioni elettrofisiologiche per la valutazione delle rigenerazioni neuronali in fette di midollo spinale co-coltivate

GABAergica inibizione presinaptica è un potente meccanismo inibitorio nel midollo spinale importante per il motore e l'integrazione del segnale sensoriale in reti midollo spinale. Sottostante afferenti primari depolarizzazione può essere misurata mediante registrazione dei potenziali radice dorsale (DRP). Qui mostriamo un metodo di registrazione in vivo di DRP nei topi.

Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

L'unità respiratoria centrale si trova nel tronco encefalico. L'output motorio respiratorio spontaneo da un midollo encefalico isolato viene registrato posizionando un elettrodo sulla quarta radice ventrale. Questo approccio sperimentale è prezioso per indagini farmacologiche o per la valutazione di sfide respiratorie e manipolazioni genetiche sul comportamento motorio ritmico.

Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita

Qui vi presentiamo un protocollo che si basa su fette midollo spinale coltivate su array multi-elettrodo per studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali in vitro.

Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Questo manoscritto descrive i metodi per le registrazioni elettrofisiologiche da neuroni spinali di embrioni di zebrafish e larve. La preparazione mantiene neuroni in situ e spesso comporta la dissezione minimo. Questi metodi consentono lo studio elettrofisiologico di una varietà di neuroni spinali, dalla acquisizione iniziale eccitabilità elettrica attraverso le prime fasi larvali.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Viene delineato l'uso combinato della tecnologia microelectrode array e della stimolazione chimica indotta da 4-aminopiridina per studiare l'attività nocicettiva a livello di rete nel corno dorsale del midollo spinale.

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un patch-clamp per studiare le risposte elettriche dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale (SCS) con un'elevata risoluzione spazio-temporale, che può aiutare i ricercatori a migliorare le loro capacità di separare il midollo spinale e mantenere contemporaneamente la vitalità cellulare.

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Descriviamo un protocollo per la registrazione extracellulare multicanale spinale insieme alla registrazione della funzione cardiaca e all'analisi dei neuroni del corno dorsale spinale bloccati nel cuore. Questo metodo offre un quadro temporalmente sincronizzato per lo studio dei meccanismi spinali alla base dei cambiamenti funzionali viscerali toracici indotti dall'agopuntura.

Studio dei profili codificanti della stimolazione somatica sulle risposte neuronali bloccate cardiache nel corno dorsale spinale del ratto

Scopri la laminectomia ventrale per isolare il midollo spinale di topo neonato e registrare l'attività neuronale con elettrodi. Questa tecnica elettrofisiologica è fondamentale per studi neuroscientifici avanzati.

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