Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Questo protocollo fornisce un metodo generale per misurare la velocità di endocitosi della maggior parte delle proteine della membrana plasmatica, utilizzando reagenti permeabilizzanti della membrana riducibili. In questo procedimento, le proteine della superficie cellulare che contengono lisine extracellulari o sono marcate covalentemente vengono incubate a quattro gradi Celsius con sulfo-NHS-SS-biotina, mostrata qui in verde. Successivamente, le cellule vengono riscaldate a 37 gradi Celsius per consentire l’endocitosi delle proteine di superficie. Le cellule vengono quindi riportate a quattro gradi Celsius per arrestare il traffico di membrana e il biotino residuo sulla superficie viene rimosso mediante un agente riducente che lascia intatto il legame disolfuro.

Pertanto, le uniche proteine biotinilate che rimangono sono quelle originate sulla superficie cellulare, internalizzate e protette dalla procedura di rimozione. Infine, le cellule vengono solubilizzate e le proteine biotinilate sono isolate mediante streptavidina e cromatografia ad affinità. Ciao, sono Luke Gabriel del laboratorio di Heli Milk Ian del Dipartimento di Psichiatria della University of Massachusetts Medical School.

Oggi vi mostreremo un procedimento per misurare i tassi di endocitosi o internalizzazione utilizzando una tecnica reversibile di eluizione della biotina. Utilizziamo questo procedimento per misurare la velocità di internalizzazione del trasportatore della dopamina. Cominciamo dunque.

Un giorno prima dell'esperimento, preparare le cellule e i substrati da utilizzare il giorno successivo. I tipi di cellule e i mezzi di coltura varieranno, ma se le cellule sperimentali non sono fortemente aderenti, utilizzare un substrato appropriato per l'adesione cellulare, come piastre per colture cellulari rivestite con polilisina, su ciascuna piastra a sei pozzetti. Etichettare in totale quattro pozzetti utilizzando due piastre distinte.

Per ogni proteina testata, due pozzetti sulla piastra di controllo verranno utilizzati come controlli per la proteina totale di superficie e per la rimozione. Preparare un pozzetto sulla piastra sperimentale per ciascuna condizione di internalizzazione da testare. Seminare un milione di cellule in due millilitri di coltura cellulare in modo che le cellule raggiungano circa l’80% di confluenza entro il giorno successivo.

Dopo la coltura delle cellule, preparare le seguenti soluzioni e conservarle a quattro gradi Celsius per l'uso al secondo giorno. Il PBS 2+ viene preparato a partire da soluzione salina tamponata al fosfato a pH 7,4 e integrato con cloruro di magnesio 1,5 millimolare e cloruro di calcio 0,2 millimolare. La soluzione di arresto della tonicità viene preparata utilizzando il PBS 2+ integrato con glicina 100 millimolare. Il buffer NT viene preparato con cloruro di sodio 150 millimolare, EDTA 1 millimolare, BSA 0,2% e tris 20 millimolare a un pH di 8,6. Il buffer RIPA viene preparato utilizzando tris 10 millimolare a pH 7,4, cloruro di sodio 150 millimolare, EDTA 1 millimolare, SDS 0,1%, Triton X-101% e colato di sodio 1%.

Successivamente, preparare una soluzione madre di biotina SULF N-H-S-S-S sciogliendola in SULFOXIDE o DMSO fino a una concentrazione di 200 milligrammi per millilitro. Preparare aliquote da 500 microlitri e conservare a meno 20 gradi Celsius. Le aliquote possono subire diversi cicli di congelamento e scongelamento dopo questo tris.

Una soluzione madre di cloridrato di carbossietilfosfina o TCEP viene preparata a una concentrazione di 500 millimolari, disciolta in 50 millimolari di tris e il pH viene regolato a 7,4. Poiché il TCEP è altamente acido, il pH della soluzione dovrà essere aggiustato a 7,4, coprire il TCEP e avvolgere con pellicola prima di conservare a meno 20 gradi Celsius. Nel secondo giorno, preparare PBS due più supplementato con 0,18% di glucosio e 0,2% di albumina sierica bovina priva di proteasi IgG o PBS due più GBSA, preriscaldare a 37 gradi Celsius in un bagnomaria.

Scongelare la soluzione stock di biotina SFO N-H-S-S-S a temperatura ambiente. Preparare una soluzione fresca di biotina zolfo N-H-S-S-S immediatamente prima dell'uso vortexando vigorosamente la soluzione per solubilizzare il DMSO.

Posizionare entrambe le piastre in un bagno di ghiaccio all'interno di una stanza fredda e risciacquare ogni pozzetto tre volte con due millilitri di PBS ghiacciato contenente ioni due più, mantenendo le piastre leggermente inclinate per garantire un completo drenaggio del buffer. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 0,75 millilitri per pozzetto della soluzione fresca di solf-NHS-SSS biotina a ciascun pozzetto. Incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius sul bagno di ghiaccio, agitando vigorosamente su un agitatore orbitale poco prima della fine dell'incubazione.

Preparare un’altra soluzione fresca di biotina SUHO N-H-S-S-S e a 15 minuti sostituire la soluzione vecchia con quella fresca. Incubare per ulteriori 15 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione vigorosa su un agitatore orbitale; dopo la seconda incubazione, lavare le cellule tre volte rapidamente con due millilitri di soluzione di arresto per bloccare tutte le molecole di biotina NHS non reagite. Successivamente, incubare in due millilitri di soluzione di arresto per 15 minuti.

Sostituire con soluzione di arresto fresca a 15 minuti e incubare per ulteriori 15 minuti. Mantenere le piastre a quattro gradi Celsius con agitazione delicata su un agitatore a piattaforma durante ogni incubazione, mentre la piastra di controllo rimane nella soluzione di arresto sul bancone della stanza fredda. Rimuovere la piastra sperimentale dalla stanza fredda e posizionarla sul bagno di ghiaccio in questo momento.

Se si stanno testando trattamenti farmacologici, aggiungere concentrazioni adeguate di farmaco al PBS preriscaldato contenente due più GBSA. In questo caso utilizziamo come veicolo etanolo oppure acetato di quattro palle mira a uno MICROMOLARE o PMA per attivare la via di PKC. Lavare ogni pozzetto della piastra sperimentale tre volte con due millilitri di PBS preriscaldato contenente due più GBSA, aggiungendo i trattamenti farmacologici appropriati dopo l'ultimo lavaggio.

Aggiungere due millilitri delle corrispondenti soluzioni di PBS due più GBSA e riempire le pozzette vuote con mezzo preriscaldato per garantire una temperatura uniforme su tutta la piastra. Trasferire le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per 10 minuti immediatamente prima della fine dell'incubazione. Preparare una soluzione di stripping fresca utilizzando una soluzione di TCEP 50 millimolare nel buffer NT e conservarla sul ghiaccio.

Preparare una quantità sufficiente pari a un millilitro per pozzetto. Dopo l'incubazione di 10 minuti, trasferire rapidamente la piastra sperimentale in un bagno di ghiaccio e riportarla in ambiente freddo. Lavare rapidamente i pozzetti sperimentali tre volte con due millilitri per pozzetto di tampone NT freddo di ghiaccio per arrestare l'endocitosi.

Quindi lavare il pozzetto di controllo della rimozione tre volte con due millilitri di tampone NT freddo di ghiaccio. Lasciare i pozzetti di controllo totali nella soluzione di arresto. Aggiungere un millilitro di soluzione di rimozione in ciascun pozzetto sperimentale e di controllo della rimozione e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.

Quattro gradi Celsius con agitazione delicata prima della fine dell'incubazione. Preparare nuovamente lo stesso volume di soluzione di stripping fresca come in precedenza. Dopo 15 minuti, sostituire la soluzione di stripping vecchia con soluzione fresca e incubare per altri 15 minuti a quattro gradi Celsius con agitazione delicata per lisare le cellule inizialmente.

Lavare tutti i pozzetti esposti alla soluzione di stripping tre volte con due millilitri di tampone NT. Quindi lavare tutti i pozzetti, inclusi i controlli totali, tre volte con due millilitri di PBS freddo. Aggiungere due più seguito dall'ultimo lavaggio 300 microlitri di tampone RIPPA contenente inibitori di proteasi freschi a ciascun pozzetto; lisare le cellule agitando per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire il lisato in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione per 10 minuti a 18.000 ×g a 4 gradi Celsius. Utilizzare un saggio proteico compatibile con le condizioni di lisi, ad esempio il saggio proteico BCA di Pierce, per determinare la concentrazione proteica del lisato rispetto a una curva standard di albumina sierica bovina. Successivamente, preparare i lisati per la cromatografia a streptavidina e per la cromatografia ad affinità.

Riempire provette microcentrifuga da 1,5 millilitro con quantità equivalenti di proteina da ciascun campione. In questo esperimento, stiamo isolando proteine biotinilate da lisati cellulari di 50 microgrammi. Aggiungere buffer RIPA contenente inibitori delle proteasi fino a un volume finale di 200 microlitri per ogni campione.

Successivamente, vortexare energicamente le perle strep avid e agro prima dell'uso; utilizzando una pipetta da 200 microlitri con la punta tagliata, trasferire 20 microlitri di perle strep avid e agro in ogni provetta. Vortexare le provette e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su un rotatore per provette il giorno successivo. Raccogliere le perle centrifugando i campioni a 18.000 G per due minuti a temperatura ambiente, aspirare il lisato avendo cura di non avvicinarsi al pellet di perle con l'aspiratore e aggiungere 0,75 millilitri di soluzione a temperatura ambiente.

Riprendere il buffer in ogni provetta e vortexare alla massima velocità per lavare le perle. Centrifugare a 18.000 ×g per due minuti a temperatura ambiente per raccogliere le perle e ripetere questo ciclo di lavaggio, vortex e centrifugazione altre due volte, per un totale di tre lavaggi dopo l'ultimo lavaggio.

Aspirare il maggior quantitativo possibile di tampone senza disturbare il pellet di perle. Successivamente, aggiungere da 20 a 25 microlitri di tampone riducente 2x a ogni provetta. L'agente riducente scinderà il legame disolfuro N-H-S-S-S della biotina, liberando le proteine isolate in soluzione.

Poiché la maggior parte delle proteine di membrana non tollera il riscaldamento a ebollizione, incubare i tubi su un agitatore rotante per 30 minuti a temperatura ambiente dopo la riduzione e la denaturazione delle proteine. Utilizzando un gel SDS-PAGE standard, trasferire le proteine su una membrana per l'immunoblotting e incubare con un anticorpo appropriato. In questo esperimento, utilizziamo l'anticorpo anti-DAT da ratto proveniente da Chemicon numero 3609 in una diluizione 1:2000, rilevando le bande immunoreattive mediante un sistema di documentazione gel con camera CCD, assicurandosi che non vi siano pixel saturi. In questo esperimento, utilizziamo un sistema di imaging BioRad VersaDoc con software Quantity One per quantificare la densità di ciascuna banda.

Un blocco immuno rappresentativo della procedura di rimozione reversibile sul trasportatore della dopamina è mostrato qui. Il segnale più intenso corrisponde alla quantità totale di proteina di superficie prima dell'internalizzazione, visibile nella corsia totale o T. Il controllo di rimozione, o S, idealmente dovrebbe essere quasi nullo e indicare un'elevata efficienza di rimozione. L'efficienza di rimozione viene calcolata utilizzando le misurazioni della densità delle bande nella seguente formula.

Questa striscia in questo esperimento aveva un'efficienza del 99,8%; strisce con efficienza maggiore o uguale al 90% sono ottimali e i risultati al di sotto di questo valore devono essere scartati. Questo esempio di striscia porosa mostra una banda visibile nella corsia della striscia con un'efficienza del 34%. In questo caso, le bande di intensità inferiore sono le corsie di internalizzazione provenienti dalla piastra sperimentale. Le cellule sono state trattate con soluzione veicolare o con un micromolare di PMA durante un periodo di internalizzazione di 10 minuti, e sono stati misurati i tassi di internalizzazione del trasportatore della dopamina.

Il tasso di internalizzazione viene calcolato utilizzando le misurazioni della densità delle bande come segue, come mostrato in questo grafico: il 10,4% del DAT di superficie viene internalizzato in 10 minuti in condizioni trattate con veicolo. Tuttavia, il trattamento con PMA aumenta i tassi di internalizzazione del DAT al 23,2% del DAT totale di superficie. È stato quindi illustrato come misurare i tassi di internalizzazione delle proteine della membrana plasmatica mediante una tecnica di biotinilazione reversibile.

È importante ricordare due cose: preparare frescamente il reagente di biotinilazione e il TCP immediatamente prima dell'uso. Se si riscontra una notevole perdita di cellule durante il protocollo, utilizzare un substrato di adesione cellulare sulle proprie piastre. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.