Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

In questo video viene dimostrato un protocollo per la visualizzazione della replicazione del DNA mediante microscopia ottica in campo ampio di DNA lambda linearizzato e chimicamente modificato. Il DNA viene fissato su una lamellina di vetro funzionalizzata. L'estremità libera del DNA è marcata con una microsfera e il DNA viene allungato mediante flusso laminare.

Quando la replicazione viene avviata, il filamento guida inizia ad allungarsi e il filamento ritardato si accorcia a causa dell'avvolgimento. L'elevata differenza di lunghezza tra DNA a doppio filamento e DNA a singolo filamento a basse forze consente un'osservazione diretta delle conversioni del DNA durante la replicazione. La lunghezza del costrutto di DNA viene monitorata tracciando la posizione della microsfera, il che permette di determinare con precisione la velocità e il processo di replicazione del DNA.

Ciao, sono Ari Ulrich dei laboratori di Anto one Vanian e Charles Richardson del Dipartimento di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare della Harvard Medical School. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'analisi dell'attività di replicazione del DNA a livello singola molecola. Utilizziamo questo procedimento nei nostri laboratori per studiare le attività enzimatiche che avvengono durante la sintesi del DNA.

Iniziamo. All'inizio di questa procedura, il DNA fagico Lambda di batteri linearizzato viene modificato mediante oligonucleotidi a ginocchio per formare una forca di replicazione, un braccio della forca complementare al Lambda, un braccio della forca biotinilato e un primer per la forca. Il braccio della forca biotinilato contiene un biotina t legata al suo estremo 5', che consente l'ancoraggio del template di DNA alla superficie della cella di flusso.

Il DNA lambda viene ulteriormente modificato mediante ibridazione con un altro oligonucleotide che contiene una digenina e un gruppo funzionale che agisce come marcatore immuno ad alta affinità per l'ancoraggio di una perlina. Per generare la forcella di replicazione, procurarsi il DNA lambda insieme a diversi oligonucleotidi le cui sequenze sono riportate nel protocollo scritto allegato a questo video. Questi oligonucleotidi includono un braccio della forcella biotinilato, un braccio della forcella complementare al lambda, un primer della forcella e un'estremità digenina complementare al lambda; fosforilare quindi le estremità 5' del braccio della forcella complementare al lambda e dell'estremità complementare al lambda contenente digenina utilizzando la chinasi polinucleotidica T4.

Successivamente, mescolare il braccio complementare della forcella di lambda fosforilato, il braccio della forcella biotinilato, l'innesco della forcella e il DNA di lambda in un rapporto molare di 10 a 10 a 100 a uno. Nel buffer della DNA Ligasi T4, riscaldare la miscela a 65 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddare lentamente a temperatura ambiente spegnendo il blocco termico, per consentire un corretto appaiamento degli oligonucleotidi e della DNA Ligasi T4 alla miscela, quindi incubare per due ore. A temperatura ambiente, la DNA Ligasi T4 catalizzerà la chiusura delle fratture tra gli oligonucleotidi e il lambda.

Il DNA viene infine legato al digene complementare lambda e al termine del modello di replicazione del DNA aggiungendo il digene complementare lambda fosforilato e il termine in tampone T4 Ligasi, quindi si incuba la miscela per 30 minuti a 45 gradi Celsius e successivamente si raffredda lentamente a temperatura ambiente spegnendo il blocco termico. Si procede legando il digene complementare lambda fosforilato e il termine al modello di replicazione del DNA aggiungendo la T4 DNA ligasi alla miscela e si incuba per due ore a temperatura ambiente. Il modello di replicazione del DNA finale è ora pronto per l'uso. Per attaccare le perle magnetiche attivate con fiocchetto al modello di replicazione del DNA, queste devono essere funzionalizzate con un frammento FAB specifico per la digoxigenina.

Per iniziare questo processo, risospendere la soluzione madre di perle e trasferire 400 microlitri in una provetta einor. Posizionare la provetta in un separatore magnetico e incubare fino a quando la soluzione diventa limpida. Quindi rimuovere il soprannatante per pipettaggio. Per attivare i gruppi toal al fine dell'accoppiamento con l'anticorpo, aggiungere un millilitro di buffer boid e mescolare delicatamente mediante pipettaggio.

Di nuovo, rimuovere il soprannatante con l'aiuto di un separatore magnetico. Successivamente, aggiungere 240 microlitri di frammento FAB e risospendere le perle in 400 microlitri di tampone borato. Mescolare accuratamente e lasciare incubare su un agitatore rotante per 16-24 ore a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, separare le perle utilizzando il separatore magnetico ed eliminare il soprannatante. Lavare le perle con un millilitro di buffer di lavaggio e incubare per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere il buffer utilizzando il separatore magnetico. Questo lavaggio viene ripetuto due volte.

Per bloccare i gruppi tosil liberi, aggiungere un millilitro di BSA contenente buffer tris e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere il buffer dalle perle utilizzando un separatore magnetico, lavare due volte con buffer ed eseguire l'aliquotatura. Per l'uso, il DNA da replicare viene fissato a coprilette di vetro funzionalizzati con Amil lane.

Il gruppo ossi della Amil lane si lega al vetro lasciando un'ammina disponibile per il legame con molecole di peg biotinilato. Questo rivestimento contribuisce a ridurre il legame non specifico alla superficie. Per pulire accuratamente i coprioggetti di vetro, posizionarli in barattoli per colorazione e riempire i barattoli con etanolo, quindi sottoporli a sonificazione.

Sciacquare i barattoli per 30 minuti e riempirli con sonificazione in idrossido di potassio 1 M per 30 minuti, quindi ripetere entrambi i lavaggi. Per la prima reazione di funzionalizzazione, è necessario rimuovere ogni traccia di acqua. Riempire i barattoli per colorazione con acetone e sonificare per 10 minuti.

Svuotare i barattoli e riempirli nuovamente con acetone. Procedere aggiungendo il reagente sine nei barattoli e agitare per due minuti. Quindi interrompere la reazione con un grande eccesso di acqua.

Quindi asciugare le lamelle riscaldandole a 110 gradi Celsius in forno per 30 minuti. Successivamente, preparare la miscela di peg a circa lo 0,2% in peso per volume. Il peg biotinilato, insieme a un distanziatore di lamella di vetro, permetterà la separazione delle lamelle; pipettare 100 microlitri su una lamella silanizzata asciutta.

Posizionare un secondo vetrino coprioggetto in alto. Incubare i vetrini coprioggetto nella soluzione di PEG per tre ore. Successivamente, separare ogni coppia di vetrini coprioggetto e lavare abbondantemente con acqua.

Attenzione a mantenere i coprioggetti con il lato funzionalizzato rivolto verso l'alto, poiché solo un lato sarà rivestito con peg. Infine, asciugare i coprioggetti con aria compressa e conservarli sotto vuoto in un essiccatore; le superfici rimangono stabili per almeno un mese. Pertanto, è possibile preparare dozzine di coprioggetti in un unico lotto e utilizzarli secondo necessità.

Ora che i coprioggetti sono pronti, è possibile assemblare la camera di flusso per l'esperimento a singola molecola. L'esperimento a singola molecola viene eseguito utilizzando una semplice camera di flusso costruita con un coprioggetto funzionalizzato, nastro bifacciale, un vetrino in quarzo e tubicini. Una camera di flusso viene preparata per ciascun esperimento a singola molecola.

Iniziare mescolando cinque millilitri di buffer di blocco e 20 millilitri di buffer di lavoro e posizionare la miscela in un desiccante per rimuovere eventuali bolle d'aria nei passaggi successivi. Successivamente, distribuire 100 microlitri di una soluzione lavorativa di strp din in PBS sulla superficie del coverslip funzionalizzato con peg, quindi incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per permettere al strp din di legarsi alla biotina superficiale. Nel frattempo, tagliare un pezzo di nastro biadesivo in modo che corrisponda alle dimensioni del vetrino di quarzo e segnare sulla pellicola la posizione dei fori per i tubicini.

Delimitare la camera di flusso disegnando un canale centrale largo tre millimetri e dei rettangoli contenenti entrambi i fori. Le camere di flusso possono essere progettate con due canali di ingresso e due canali di uscita a forma di Y. Ora tagliare il nastro segnato lungo il contorno disegnato, effettuando tagli dritti e puliti per assicurarsi che nessun adesivo sporga all'interno del canale.

Pulire accuratamente la lamina di quarzo utilizzando acetone per rimuovere l'adesivo residuo dalla costruzione della cella a flusso usata in esperimenti precedenti. Individuare il migliore allineamento del contorno del canale. Rimuovere un lato del supporto adesivo e posizionare con attenzione il nastro sulla lamina.

Attenzione ad allineare correttamente il nastro in modo che i fori di ingresso e di uscita rimangano liberi. Successivamente, preparare i pezzi di tubo tagliati di lunghezza adeguata da un tubo con diametro interno di 0,76 millimetri per l'ingresso e l'uscita della cella di flusso. Tagliare l'estremità del tubo con un angolo di circa 30 gradi in modo che il tubo non si appiattisca contro il fondo della camera.

Sospendere il tubo su portaprovetta per facilitare il collegamento alla cella di flusso nei passaggi successivi. A questo punto, l'incubazione del vetrino dovrebbe essere terminata. Risciacquare accuratamente il vetrino con acqua ed asciugarlo utilizzando aria compressa.

Attenzione a non capovolgere il vetrino poiché solo un lato è funzionalizzato con peg. Completare il montaggio della camera di flusso rimuovendo l'altra parte del supporto adesivo e posizionando il vetrino di quarzo sul vetrino. Premere leggermente sul vetrino per espellere qualsiasi aria intrappolata nell'adesivo. Questo aiuterà a prevenire la formazione di bolle d'aria nel canale di flusso.

Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e fissarlo con la resina epossidica. Lasciare asciugare per alcuni minuti.

Una volta asciutto, utilizzare un ago da 21 gauge per aspirare parte del buffer di blocco DGA attraverso una delle provette, al fine di bloccare la superficie della camera. Eseguire alcuni risciacqui per rimuovere le bolle d'aria e lasciare incubare la camera per almeno 30 minuti prima di procedere con l'esperimento di replicazione a singola molecola. Una volta preparate le perle funzionalizzate con il DNA stampo e la camera a flusso, è possibile eseguire un esperimento a singola molecola.

Per iniziare, posizionare la camera di flusso sul palco del microscopio. Tenere la camera ferma con le clip del palco e assicurarsi che il canale di flusso sia allineato con la telecamera CCD. Collegare la sorgente d'aria precedentemente costruita alla pompa a siringa e ai tubi di uscita della camera di flusso.

Utilizzando tubi connettori di diametro maggiore, posizionare i tubi di ingresso della cella a flusso nel buffer di blocco e aspirare con la siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria dai tubi; agitare delicatamente i tubi di uscita per eliminare le bolle d'aria intrappolate nella cella a flusso. Una volta rimosse tutte le bolle d'aria, tappare uno dei tubi di ingresso con un ago e sigillare uno dei tubi di uscita piegandolo di 180 gradi e fissandolo con nastro adesivo. Prima di aggiungere il DNA alla cella, diluire il template di DNA stock a 10 picomolar in un millilitro di DGA in buffer di blocco 1x. Far fluire il template nella camera a velocità di flusso moderata per consentire un'adeguata copertura superficiale del DNA.

Diluire la soluzione madre di perle a una concentrazione compresa tra due e quattro volte 10 alla sesta perle per millilitro. In un millilitro di DGAs, aggiungere un x di tampone bloccante. Quindi vortexare la miscela e sottoporla a sonificazione per 20 secondi.

Far scorrere la soluzione diluita di perline nella camera. Una volta aggiunte le perline, interrompere il flusso e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio. Chiudere quindi entrambi i tubi di uscita.

Ogni modifica ai tubi senza che la camera sia chiusa provocherà fluttuazioni di pressione che eserciteranno una forte forza sulle perle e romperanno le molecole di DNA ancorate. Chiudere il tubo di ingresso utilizzato per caricare le perle con un ago, usando il secondo tubo di ingresso. Iniziare a lavare la cella a flusso con DGAs una soluzione x di buffer bloccante, lavando accuratamente.

Agitare la piastra battendo leggermente per rimuovere eventuali perline attaccate in modo non specifico alla superficie e verificarne la presenza. Le perline sono legate al DNA. Provare a invertire la direzione del flusso.

Dopo aver sufficientemente rimosso le perle libere, spegnere il flusso e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio. Preparare una nuova miscela di reazione contenente le proteine di replicazione come indicato nel protocollo testuale. Chiudere il tubo dell'uscita aperta e passare il serbatoio di ingresso alla miscela di reazione appena preparata.

Aprire lentamente l'uscita per evitare variazioni rapide di pressione durante la reazione enzimatica. Inizialmente, far scorrere la soluzione proteica nella camera a una velocità di flusso moderata per consentire un legame efficiente al DNA. Arrestare il flusso e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio.

Chiudere i tubi di uscita e sostituire il tubo contenente la miscela di reazione. Utilizzando il tubo contenente il buffer di lavaggio DGA, lavare la camera per rimuovere le proteine libere dopo il lavaggio. Spegnere nuovamente il flusso e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio.

Chiudere i tubi di uscita e sostituire il tubo contenente il buffer di lavaggio. Con il tubo contenente il buffer di replicazione T7, il buffer di replicazione T7 contiene cloruro di magnesio che innesca l'inizio della reazione di replicazione. Utilizzare una portata di 0,012 millilitri al minuto, corrispondente a una forza di trascinamento di tre pico Newton sui legami di DNA, usando le condizioni descritte in questo protocollo.

Posizionare un magnete permanente al neodimio sopra la cella a flusso prima dell'acquisizione delle immagini per prevenire interazioni non specifiche tra le microsfere e la superficie. Posizionare un illuminatore a fibra ottica con un angolo di incidenza compreso tra 10 gradi e parallelo al piano del microscopio vicino al campo visivo del microscopio, utilizzando un obiettivo 10x e una telecamera CCD. L'illuminazione in campo scuro viene utilizzata per aumentare il contrasto nell'immagine delle microsfere focalizzando una microsfera legata.

Iniziare l'acquisizione dei dati per 20-30 minuti a una velocità di acquisizione lenta. In un esperimento riuscito, è possibile osservare contemporaneamente 100 perline. L'esperimento dovrebbe produrre numerose tracce che mostrano la sintesi del DNA del filamento guida.

Per misurare le velocità e la processività dello svolgimento del DNA e della polimerizzazione, è necessario determinare con precisione le posizioni delle perle. Adattare queste posizioni con funzioni gaussiane bidimensionali. Visualizzare la traiettoria tracciando la posizione della perla in ogni fotogramma mediante software di tracciamento.

Quindi tracciare la posizione delle perle in funzione del tempo utilizzando un qualsiasi software grafico per ottenere i dati di velocità. Interpolare i grafici con una regressione lineare e calcolare la pendenza per il movimento processivo. Determinare la lunghezza totale del DNA dall'inizio alla fine di un evento di accorciamento.

Combina tutte le singole misurazioni e traccia le distribuzioni di velocità e produttività, adattando i dati rispettivamente con funzioni gaussiane ed esponenziali semplici. Ti abbiamo appena mostrato come misurare le velocità e la processività della replicazione del DNA a livello di singola molecola. Quando si esegue questa procedura, è importante assicurarsi che la forza e la certezza delle scommesse dovute al flusso laminare non influiscano sull'attività enzimatica delle proteine di replicazione.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buon divertimento nei vostri esperimenti.