Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Questo video mostra un protocollo per la visualizzazione della replicazione del DNA mediante microscopia ottica a campo largo lambda linearizzata e chimicamente modificata. Il DNA è attaccato a un vetrino di vetro funzionalizzato. L'estremità libera del DNA viene marcata con perline e il DNA viene allungato mediante flusso laminare.

Quando viene avviata la replicazione, il filamento principale inizia ad allungarsi e il filamento in ritardo si accorcia a causa dell'avvolgimento. La grande differenza di lunghezza tra il DNA a doppio filamento e il DNA a singolo filamento a basse forze consente un'osservazione diretta delle conversioni del DNA durante la replicazione. La lunghezza del costrutto di DNA viene monitorata tracciando la posizione della perlina, che consente di determinare con precisione la velocità e il processo di replicazione del DNA.

Ciao, sono Ari Ulrich dei Laboratori di Anto One Vanian e Charles Richardson presso il Dipartimento di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare della Harvard Medical School. Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging della replicazione del DNA a livello molecolare singolo. Utilizziamo questa procedura nei nostri laboratori per studiare le attività enzimatiche che avvengono durante la sintesi del DNA.

Quindi iniziamo all'inizio di questa procedura. Il DNA Lambda del fago dei batteri linearizzati viene modificato da un oligonucleotide in ginocchio per formare una forcella di replicazione, un braccio della forcella complementare lambda, un braccio della forcella biotinilato e un primer della forcella. L'avambraccio della forcella biotinilato contiene una biotina t attaccata alla sua estremità primaria cinque, che consente di legare il modello di DNA alla superficie della cellula di flusso.

Il DNA lambda viene ulteriormente modificato mediante ricottura, un altro oligonucleotide che contiene un diggen e una porzione che funge da tag immunologico ad alta affinità per l'attacco di una perlina. Per generare la forcella di replicazione, ottenere il DNA lambda oltre a diversi oligonucleotidi le cui sequenze possono essere trovate nel protocollo scritto che accompagna questo video. Questi oligonucleotidi includono un braccio della forcella biotinilato, un braccio della forcella complementare lambda, un primer della forcella e un diggen complementare lambda e l'estremità fosforilare le cinque estremità primarie del braccio della forcella complementare lambda e l'estremità digo genin complementare lambda utilizzando la chinasi polinucleotidica T quattro.

Quindi mescolare il braccio della forcella complementare lambda fosforilato, il braccio della forcella biotinilato, il primer della forcella e il DNA lambda nel rapporto molare da 10 a 10 a 100 a uno. Nel tampone T 4 DNA Ligasi riscaldare la miscela a 65 gradi Celsius per cinque minuti e raffreddare lentamente a temperatura ambiente spegnendo il blocco termico per consentire la corretta ricottura degli oligonucleotidi e della T 4 DNA ligasi nella miscela e incubare per due ore. A temperatura ambiente, la T 4 DNA ligasi catalizzerà la sigillatura delle tacche tra gli oligonucleotidi e la lambda.

Il DNA infine anil il diggen complementare lambda e termina al modello di replicazione del DNA aggiungendo il diggen complementare lambda fosforilato e termina nel tampone T quattro Ligasi, incubare la miscela per 30 minuti a 45 gradi Celsius e di nuovo, raffreddare lentamente a temperatura ambiente spegnendo il blocco di calore, legare il Lambda complementare fosforilato ossigeno dig e terminare al modello di replicazione del DNA aggiungendo T quattro DNA ligasi alla miscela e Incubare per due ore a temperatura ambiente. Il modello finale di replicazione del DNA è ora pronto per l'uso. Per attaccare le microsfere magnetiche attivate dalla nappa al modello di replicazione del DNA, devono essere funzionalizzate con un frammento FAB specifico per digo genin.

Per iniziare questo processo, risospendere la soluzione madre di perle e trasferire 400 microlitri in una provetta einor. Posizionare la provetta in un separatore magnetico e incubare fino a quando la soluzione non si chiarisce. Quindi rimuovere il surnatante mediante pipettaggio Per attivare i gruppi toal per l'accoppiamento degli anticorpi, aggiungere un millilitro di tampone boid e mescolare delicatamente mediante pipettaggio.

Anche in questo caso, rimuovere il surnatante con l'aiuto di un separatore magnetico. Quindi, aggiungere 240 microlitri di frammento FAB e risospendere le perle in 400 microlitri di tampone borato. Mescolare accuratamente e lasciare incubare su un rotatore per 16-24 ore a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, separare le perle utilizzando il separatore magnetico e rimuovere il surnatante. Lavare le perle con un millilitro di tampone di lavaggio e incubare per cinque minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il tampone utilizzando il separatore magnetico. Questo lavaggio viene ripetuto due volte.

Per bloccare i gruppi tosil liberi, aggiungere un millilitro di BSA contenente tampone tris e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone dalle perle utilizzando un separatore magnetico lavare due volte con tampone e aliquota. Per l'uso, il DNA da replicare è attaccato a vetrini di vetro funzionalizzati con Amil lane.

L'ossigruppo dell'amil si lega al vetro lasciando un'ammina disponibile per il legame con le molecole di peg biotinilate. Questo rivestimento aiuta a ridurre il legame non specifico con la superficie. Per pulire a fondo i vetrini di copertura, metterli in barattoli per colorare e riempire i barattoli con sonicato di etanolo.

Per 30 minuti, sciacquare i barattoli e riempirli con un idrossido di potassio molare sonicato per 30 minuti e ripetere entrambi i lavaggi. Per la prima reazione di funzionalizzazione, è necessario rimuovere tutte le tracce di acqua. Riempi i barattoli di colorazione con acetone e sonica per 10 minuti.

Svuotare i barattoli e riempirli nuovamente con acetone. Procedere con l'aggiunta del reagente sinusoidale ai barattoli e agitare per due minuti. Quindi spegnere con un abbondante eccesso di acqua.

Asciugate poi i vetrini di copertura cuocendoli a 110 gradi in forno per 30 minuti. Successivamente, preparare la miscela di peg a circa lo 0,2% in peso per volume. Il piolo biotinilato, compreso un distanziatore in vetro, consentirà la separazione dei vetrini, pipettare 100 microlitri su un vetrino di copertura siloizzato a secco.

Posizionare un secondo vetrino coprioggetto sopra. Incubare i vetrini coprioggetti nella soluzione PEG per tre ore. Quindi separare ogni paio di vetrini coprioggetti e lavare abbondantemente con acqua.

Fare attenzione a mantenere i vetrini funzionalizzati con il lato rivolto verso l'alto in quanto solo un lato sarà rivestito con il piolo. Infine, asciugare i vetrini coprioggetto con aria compressa e conservarli sottovuoto In un essiccatoio, le superfici rimangono stabili per almeno un mese. In questo modo è possibile realizzare decine di vetrini coprioggetto in un lotto e utilizzarli secondo necessità.

Ora che i vetrini coprioggetti sono pronti, è possibile assemblare la camera di flusso per l'esperimento della singola molecola. L'esperimento della singola molecola viene eseguito utilizzando una semplice camera di flusso costruita con un vetrino di copertura funzionalizzato, nastro biadesivo, un vetrino da un litro e un tubo. Viene preparata una camera di flusso per ogni singolo esperimento di molecola.

Iniziare mescolando cinque millilitri di tampone bloccante e 20 millilitri di tampone di lavoro e mettendo la miscela in un essiccante per rimuovere eventuali bolle d'aria per i passaggi successivi. Successivamente, distribuire 100 microlitri di una soluzione di lavoro di strp din in PBS sulla superficie del pestello funzionalizzato Incubare il vetrino coprioggetti per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire a strp din di legare la biotina superficiale. Nel frattempo, taglia un pezzo di nastro biadesivo in modo che corrisponda alle dimensioni del vetrino al quarzo, segna la posizione dei fori del tubo sul nastro.

Delinea la camera di flusso disegnando un canale centrale largo tre millimetri e rettangoli contenenti entrambi i fori. Le camere di flusso possono essere progettate con due canali di ingresso e due canali di uscita a forma di Y. Ora taglia il nastro segnato lungo il contorno disegnato, facendo tagli dritti e netti per essere sicuro che l'adesivo non sporga nel canale.

Pulire accuratamente il vetrino di quarzo utilizzando acetone per rimuovere l'adesivo dalla struttura della cella di flusso utilizzata negli esperimenti precedenti. Trova il miglior allineamento del contorno del canale. Rimuovere un lato del supporto adesivo e posizionare con cura il nastro sul vetrino del campo.

Fare attenzione ad allineare correttamente il nastro poiché i fori di ingresso e uscita devono rimanere non ostruiti. Quindi, preparare le lunghezze di taglio del tubo di 0,76 millimetri di diametro interno per l'ingresso e l'uscita della cella di flusso. Tagliare l'estremità del tubo con un angolo di circa 30 gradi in modo che il tubo non prema contro il fondo della camera.

Sospendere il tubo su rack per provette per un facile fissaggio alla cella di flusso nei passaggi successivi. A questo punto, l'incubazione del vetrino coprioggetto dovrebbe essere terminata. Sciacquare il coperchio, farlo scivolare accuratamente con acqua e asciugarlo con aria compressa.

Fare attenzione a non capovolgere il vetrino coprioggetto in quanto solo un lato è funzionalizzato con il piolo. Completare l'assemblaggio della camera di flusso rimuovendo l'altro lato del supporto del nastro e posizionando il vetrino al quarzo sul vetrino coprioggetti Premere leggermente sul vetrino coprioggetti per espellere l'aria intrappolata nell'adesivo. Ciò contribuirà a prevenire l'ingresso di bolle d'aria nel canale di flusso.

Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e sigillare in posizione con la resina epossidica. Lasciate asciugare per qualche minuto.

Una volta asciutto, utilizzare un ago calibro 21 per tirare parte del tampone di blocco DGA attraverso una delle provette in modo da bloccare la superficie della camera. Sciacquare un paio di volte per rimuovere le bolle d'aria e lasciare incubare la camera per almeno 30 minuti prima di passare all'esperimento di replicazione di una singola molecola. Una volta che le perle funzionalizzate del modello di DNA e la camera di flusso sono state preparate, è possibile eseguire un esperimento su una singola molecola.

Per iniziare, posizionare la cella di flusso sul tavolino del microscopio. Tenere la camera in posizione con le clip del tavolino e assicurarsi che il canale di flusso sia posizionato in allineamento con la telecamera CCD. Collegare alla molla d'aria precedentemente costruita alla pompa a siringa e ai tubi di uscita della cella di flusso.

Utilizzando un tubo del connettore di diametro maggiore, posizionare i tubi di ingresso della cella di flusso nel tampone di blocco e tirare indietro la siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria dai tubi, muovere delicatamente i tubi di uscita per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate nella cella di flusso. Una volta rimosse tutte le bolle d'aria, tappare uno dei tubi di ingresso con un ago e sigillare uno dei tubi di uscita piegandolo di 180 gradi e fissandolo con nastro adesivo Prima di aggiungere il DNA alla cellula, diluire il modello di DNA stock a 10 picomulari in un millilitro di DGA un tampone bloccante. Far fluire il modello nella camera a una velocità di flusso moderata per consentire una buona copertura superficiale del DNA.

Diluire la soluzione madre di perle da due a quattro volte 10 delle seste perle per millilitro. In un millilitro di DGA un tampone di blocco. Quindi agitare la miscela e sonicare per 20 secondi.

Far fluire la soluzione di perline diluita nella camera. Una volta aggiunte le perline, chiudere il flusso e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio. Quindi chiudere entrambi i tubi di uscita.

Qualsiasi modifica ai tubi senza la camera chiusa causerà fluttuazioni di pressione che eserciteranno una forte forza sulle perle e taglieranno le molecole di DNA legate. Tappare il tubo di ingresso che è stato utilizzato per caricare le perline con un ago utilizzando il secondo tubo di ingresso. Iniziare a lavare la cella di flusso con DGA una x soluzione di tampone bloccante lavare ampiamente.

Agitare il tavolino picchiettando per rimuovere eventuali perline che non sono specificamente attaccate alla superficie per controllarlo. Le perle sono legate al DNA. Prova a cambiare la direzione del flusso.

Una volta che le perle libere sono state rimosse a sufficienza, chiudere il flusso e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio. Preparare una miscela di reazione fresca contenente proteine di replicazione come indicato nel protocollo di testo. Chiudere il tubo di uscita aperto e commutare il serbatoio di ingresso sulla miscela di reazione appena preparata.

Apertura lenta dell'uscita per evitare rapidi sbalzi di pressione per procedere con la reazione enzimatica. Innanzitutto, far fluire la soluzione proteica nella camera a una velocità di flusso moderata per consentire un legame efficiente al DNA. Chiudere il flusso e lasciare che la camera raggiunga l'equilibrio.

Chiudere i tubi di uscita e sostituire il tubo contenente la miscela di reazione. Con il tubo costituito da tampone di lavaggio DGA, lavare la camera per rimuovere le proteine libere dopo il lavaggio. Ancora una volta, spegni il flusso e lascia che la camera raggiunga l'equilibrio.

Chiudere i tubi di uscita e sostituire il tubo contenente il tampone di lavaggio. Con la provetta contenente il tampone di replicazione T sette, il tampone di replicazione T sette contiene cloruro di magnesio che innesca l'inizio della reazione di replicazione. Utilizzare una portata di 0,012 millilitri al minuto che corrisponda a una forza di trascinamento di tre pico Newin sui cavi del DNA utilizzando le condizioni descritte in questo protocollo.

Posizionare un magnete permanente in terre rare sopra la cella di flusso prima dell'imaging per evitare interazioni non specifiche tra le perle e la superficie. Posizionare un illuminatore a fibra con un angolo di incidenza compreso tra 10 gradi e parallelo al tavolino del microscopio vicino al campo visivo del microscopio con un obiettivo 10x e una telecamera CCD. L'illuminazione in campo scuro viene utilizzata per aumentare il contrasto nella messa a fuoco dell'imaging del cordone utilizzando un cordone legato.

Inizia l'acquisizione dei dati per 20-30 minuti a una frequenza di fotogrammi lenta. In un esperimento riuscito, si possono osservare contemporaneamente 100 perline. L'esperimento dovrebbe produrre numerose tracce che mostrano la sintesi del DNA del filamento principale.

Al fine di misurare i tassi e il processo di svolgimento e polimerizzazione del DNA, è necessario determinare le posizioni precise delle perle per raggiungere questo obiettivo. Adatta queste posizioni con funzioni gaussiane bidimensionali. Visualizza la traiettoria tracciando la posizione del tallone in ogni fotogramma utilizzando il software di tracciamento.

Quindi tracciare la posizione del cordone in funzione del tempo utilizzando qualsiasi software grafico per ottenere i dati di velocità. Adatta i grafici con una regressione lineare e calcola la pendenza per il processivo. Determinare la lunghezza totale del DNA dall'inizio alla fine di un evento di accorciamento.

Combina tutte le singole misurazioni e traccia le distribuzioni di velocità e produttività per adattare i dati utilizzando rispettivamente le funzioni gaussiane e le singole funzioni esponenziali. Vi abbiamo appena mostrato come misurare i tassi e i processi di replicazione del DNA a livello di singola molecola. Quando si esegue questa procedura, è importante assicurarsi che la forza e la certezza delle scommesse del flusso della lamina non influenzino le attività enzimatiche delle proteine di replicazione.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e divertiti con i tuoi esperimenti.