Tossina induzione ed estrazione di proteine ​​da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica

Questo video descrive una procedura utilizzata per indurre la sinesi della tossina in alcune specie, in questo caso per e il protocollo per l'estrazione dell'intera prote utilizzato per gli studi proteomici nel nostro laboratorio. La durata della procedura, 16 giorni, quattro giorni per la crescita fungina, 10 giorni per la sinosi delle tossine e due giorni per l'estrazione delle proteine. Dopo quattro giorni, le colonie stanno ancora crescendo attivamente verso il bordo della placca.

Il tipico micelio aereo si forma e viene raccolto utilizzando una lama steroidea sotto la scatola di flusso della lamina graffiando delicatamente la superficie della piastra. Il micelio viene tagliato in cinque piccoli pezzi e aggiunto a una fiaschetta precoce contenente 25 millilitri di terreno che induce tossine. L'induzione delle tossine è più efficiente della polvere scura.

Il pallone è rivestito in alluminio. Le colture vengono quindi agitate per 10 giorni, 150 giri al minuto a 25 gradi centigradi. Il terreno è di SAPH e contiene una soluzione di S row ad alta concentrazione.

Il letto insieme all'oscurità è noto per facilitare la sinosi delle tossine in ria. Il micelio viene quindi separato dal liquido contenente la tossina filtrando sul tessuto vicino all'infarto miocardico. Il liquido può essere utilizzato per misurare il contenuto di tossine mentre il micelio viene utilizzato per l'estrazione delle proteine.

Per evitare il trascinamento dei supporti, il mio soffitto viene lavato tre volte con acqua sterile. L'acqua in eccesso deve essere eliminata Successivamente, come l'azoto liquido, e i campioni possono essere conservati a meno 80 o utilizzati per l'estrazione delle proteine. La procedura di estrazione delle proteine si basa sull'uso di SDS e TCA e consiste in diverse fasi di lisi.

Proporrà un metodo che coinvolge più operatori da eseguire. Contemporaneamente all'estrazione delle repliche biologiche, un operatore diverso effettua ogni replica. Questa procedura prende in considerazione le differenze nella procedura di estrazione che possono essere generate dai diversi operatori che stanno elaborando le repliche.

Dovrebbe quindi mostrare una maggiore robustezza quando le repliche biologiche vengono confrontate, poiché la variabile operatore è inclusa nella replica. Allo stesso tempo, l'utilizzo di più operatori riduce i tempi di lavorazione. Il campione viene macinato in un mortaio sterile utilizzando azoto liquido fino a quando il micelio è una polvere fine.

Questo passaggio è fondamentale per la qualità e la quantità di proteine. Il micelio viene raccolto in tubi di teflon da 10 milligrammi in una proporzione di quattro decimi del volume totale dei tubi. Viene quindi aggiunto un tampone di lisi contenente SDS e diversi inibitori della proteasi.

I tubi vengono quindi agitati fino ad ottenere una soluzione omogenea. Quindi i campioni vengono agitati per 30 minuti nella camera del codice per essere ulteriormente omogeneizzati, i campioni vengono fatti bollire per sciogliere le pareti cellulari e le proteine idrofobiche. La presenza di SDS impedisce la formazione di oligomeri che interrompono la precipitazione delle proteine.

Una fase di centrifugazione separa tre fasi. Le proteine sono sospese nella soluzione trasparente che viene raccolta in un nuovo tubo tenuto sul ghiaccio. La tavolozza viene quindi utilizzata per eseguire un secondo passaggio, ripetendo il vortice, l'ebollizione e la centrifugazione.

Le anse delle due lisi vengono combinate per eseguire la precipitazione con precipitazione glaciale, tampone contenente tono acido, acido triacido e DTT. I campioni vengono quindi conservati per una notte per 16 ore a meno 20 gradi centigradi per consentire l'uso delle proteine. Le proteine di precipitazione sono situate sul fondo dei tubi per migliorare la precipitazione.

Le provette vengono centrifugate ad alta velocità per 45 minuti. Al palato è ormai ben visibile. I surnatanti possono essere scartati utilizzando un tampone per tubi da cinque millilitri.

Il TCA viene quindi rimosso aggiungendo 25 millilitri di tampone di lavaggio glaciale contenente acetone e DTT. Viene quindi agitato accuratamente e vigorosamente. Quindi viene eseguita una nuova fase di centrifugazione.

Il palato proteico ora galleggia, quindi è necessario prestare una certa pressione per eliminare lo snat. Viene eseguita una seconda fase di lavaggio, con l'aggiunta di lavaggio, tampone, agitazione e centrifugazione. L'agente SUP viene eliminato e il campione viene essiccato utilizzando uno speed bag.

Quando il campione è asciutto, la proteina è di consistenza simile alla polvere. Memorizzare. La proteina del campione deve essere raccolta dal tubo per ridurre l'interferenza elettrostatica della plastica.

Viene utilizzata una pistola elettrostatica e la polvere proteica viene raccolta utilizzando una spatola metallica. Le proteine vengono quindi sospese direttamente nel tampone di marcatura. Utilizzato per dash 2D 30 minuti a 800 grammi al minuto.

Sufficiente per la solubilizzazione. La proteina prima di procedere alla costosa etichettatura del trattino 2D. La qualità delle proteine è testata su SDS pagina one size gel come si può vedere.

L'assenza di sbavature significative sul bordo di una corsia suggerisce una buona qualità del campione.