Name: Incapsulamento PuraMatrix delle cellule tumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Scopri l'incapsulamento di cellule tumorali in PuraMatrix per creare modelli 3D di cultura cellulare. Questo metodo utilizza la linea cellulare CAR5 per studiare il cancro ovarico in condizioni simili all'in vivo.

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Note tecniche: <ul><li> Gelificazione è iniziata con l'aggiunta di sali. Pertanto, è fondamentale che i sali non vengono a contatto con PuraMatrix fino a gelificazione è desiderato, l'esposizione a sali di molto bassa forza ionica (ad esempio, &lt;0,05 M) causerà gelificazione irreversibile. </li><li> Soluzioni rimanenze che vengono preparati possono essere usati in un secondo momento a condizione che non sono venuto in contatto con i sali. Non è necessario preoccuparsi di sonicazione ripetere. </li><li> Le bolle d'aria può essere rimosso aliquoting PuraMatrix in provette sterili seguita da centrifugazione. </li><li> Prestate molta attenzione durante i cambi di mezzi di comunicazione come l'aspirazione può facilmente interrompere il letto PuraMatrix. </li></ul> Materiali: BD PuraMatrix Peptide RAD16 Hydrogel-1% (Cat # 354250): la concentrazione del peptide totale della miscela non diluito è di 10 mg / ml. <ul><li> Acqua Sonicator Vasca o Vortex </li><li> 96-bene delle cellule piatto cultura </li><li> Colture Cellulari media </li><li> Sterile filtrata H 2 O </li><li> Saccarosio sterile filtrata 20% </li><li> Cellule (il tutto a 5.000 cellule / pozzetto): OVCAR-5 </li></ul> Tutte le fasi devono essere eseguite in condizioni asettiche. Procedimento: <ol><li> Sonicare PuraMatrix l'1% (RAD16) in un sonicatore acqua del bagno per 30 minuti per ridurre la viscosità prima dell'uso. </li><li> La soluzione PuraMatrix 1% può essere aliquotati in provette sterili per semplificare futuri esperimenti. <ol class="lalpha"><li> Evitare la formazione di bolle d'aria, se si tratta di semplicemente rallenta il provette sterili contenenti PuraMatrix a 1000 rpm (300 xg) per 5 minuti. </li><li> La concentrazione del peptide totale della miscela non diluito è di 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Due set di 4 pozzi saranno placcato a 2,5 mg / ml e 1,25 mg / ml di concentrazione del peptide totale, rispettivamente. </li><li> Diluire il PuraMatrix in ciascun pozzetto insieme con 0,2 micron sterile filtrata saccarosio 20% e il 13,3% di saccarosio al totale delle concentrazioni del peptide di 5 mg / ml e 2,5 mg / ml, rispettivamente, per ottenere una concentrazione di 2x BD PuraMatrix nel 10% di saccarosio. <ol class="lalpha"><li> Fare il 20% di saccarosio, diluire 10 g di saccarosio, poi volume di 50 ml di acqua. </li><li> 13% e il 10% di saccarosio può essere preparato diluendo la soluzione madre al 20%. <ol class="lroman"><li> 13% di saccarosio (per ogni ml 10): 6,5 ml di saccarosio al 20% + 3,5 ml sterili H 2 O. </li><li> 10% di saccarosio (per ogni ml 10): 5,0 ml di saccarosio al 20% + 5.0 ml sterile H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Preparare una master mix di peptidi PuraMatrix in base al numero di pozzi che si intende piatto. (Vedi esempio sotto). Poi aliquota in singoli tubi contenenti 25 ml della master mix. <ol class="lalpha"><li> Il master mix dovrebbe essere preparato a due volte la concentrazione finale desiderata di peptide totale in quanto sarà diluito con un uguale volume di cellule durante la placcatura. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1"></li></ol></li><li> Preparare sospensioni cellulari da trypsinizing cellula colture cellulari monostrato. <ol class="lalpha"><li> 2 ml di 0,05% tripsina EDTA può essere utilizzato per ogni T-75 Flask. </li></ol></li><li> Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta dei terreni di coltura cellulare contenente il 10% inattivato con il calore di siero fetale bovino (uso almeno 2 ml di mezzi per ml di tripsina utilizzato nel passaggio precedente). </li><li> Centrifugare le cellule a 1000 giri (~ 300 xg) per 5 minuti per creare un pellet di cellule. <ol><li> Risospendere le cellule nel 10% di saccarosio sterile filtrata. </li><li> Contare le celle e girare di nuovo a 1000 giri (~ 300 xg) per 5 minuti per rimuovere tracce di sale trovato nei media. </li></ol></li><li> Risospendere il OVCAR-5 cellule in 10% di saccarosio a 2,0 x 10 5 cellule / ml, in modo che il conteggio finale delle cellule per pozzetto saranno 5.000 cellule in ciascun pozzetto. Le seguenti operazioni devono essere eseguite rapidamente. </li><li> Aggiungere 25 microlitri di 2.0 x 10 5 cellule / ml di sospensione per il primo tubo singolo contenente 25 microlitri della master mix di PuraMatrix come indicato nello schema di cui sopra. <ol class="lalpha"><li> Mescolare rapidamente pipettando (~ 5 volte su e giù) nel tubo senza introdurre bolle d'aria. </li><li> Pipettare quindi i 50 microlitri di cellule sospensione / PuraMatrix miscela nel pozzo appropriato di un piatto ben 96. </li><li> Avviare gelificazione del PuraMatrix BD pipettando gentilmente 150 microlitri terreni di coltura cellulare (RPMI + 10% FBS) al lato del bene <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 2"></li></ol></li><li> Ripetere la procedura descritta in 8 fino a quando tutti i pozzetti sono stati placcati. </li><li> Dopo 30 minuti molto delicatamente rimuovere ~ 2 / 3 della media con una pipetta 200 microlitri per equilibrare il pH del idrogel. <ol class="lalpha"><li> NON UTILIZZARE UN VUOTO IN QUESTO ASPIRATORE ostacolerà la MATRIX </li><li> Posizionare la punta della pipetta nel pozzetto in modo chenon toccare il letto PuraMatrix e delicatamente rimuovere il supporto dal pozzo. </li><li> Si deve prestare attenzione a non disturbare la matrice durante la coltura di cellule in PuraMatrix. </li></ol></li><li> Molto delicatamente aggiungere 150 ml di mezzi freschi colture cellulari al lato del pozzetto contenente cellule incapsulate in PuraMatrix. </li><li> Cambiare il terreni di coltura di cellule in ciascun pozzetto ogni 48 ore con terreni di coltura fresco con attenzione ripetendo i punti 10 e 11. </li></ol> Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figura 1"> Figura 1. OVCAR-5 cellule sono state incapsulate, come descritto nel protocollo di cui sopra. Immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio rovesciato Olympus FV1000 dotato di Spectra-Physics DeepSee Ti: zaffiro laser sintonizzati a 750 nm. Sessioni di imaging sono state condotte nei giorni 1, 3, 5 e 7 post-placcatura. A distanza di lavoro, l'acqua immergendo obiettivo 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) è stato utilizzato per l'immagine attraverso la PuraMatrix. Volumi tridimensionali sono stati raccolti attraverso l'acquisizione di immagini in stack 1,47 micron passi assiale. Due non-descanned rivelatori di raccolti tramite l'emissione di autofluorescenza violetto (440-490 nm) e verde (510-550 nm) Filtri a banda passante. Le immagini finali e filmati stack di profondità sono stati elaborati utilizzando ImageJ unendo entrambi i canali di rilevazione. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1.

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

incapsulamento puramatrix delle cellule tumorali

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Crescente evidenza suggerisce che le cellule tumorali coltura in tre dimensioni con maggiore precisione ricapitola la complessità della biologia del tumore. Molti di questi modelli utilizzano membrane ricostituito scantinato derivati ​​da animali che contengono una quantità variabile di fattori di crescita e di citochine che possono influenzare la crescita dei modelli di cultura queste cellule. Qui, descriviamo in dettaglio la preparazione e l&#39;uso di PuraMatrix, disponibile in commercio gel peptide auto assemblaggio che è privo di materiale di origine animale e agenti patogeni a integrare e propagare il cancro ovarico linea cellulare, OVCAR-5. Iniziamo descrivendo come preparare il PuraMatrix prima dell&#39;uso. Successivamente, dimostriamo come mixare correttamente il PuraMatrix e sospensione cellulare per incapsulare le cellule in idrogel. Al momento l&#39;aggiunta di terreni di coltura cellulare o iniezione in un ambiente fisiologico, il componente del peptide PuraMatrix rapidamente auto assembla in un idrogel 3D che mostra una scala nanometrica struttura fibrosa con una dimensione dei pori media di 500-200 nm<sup&gt; 1</sup&gt;. Inoltre, ci mostrano come si propagano le culture cresciute in PuraMatrix incapsulato. Quando incapsulato in PuraMatrix, OVCAR-5 cellule assemblano in tre strutture acinose dimensionale che si avvicinano maggiormente la morfologia dei noduli micrometastatica osservati nella clinica di monostrato in modelli in vitro. Usando la microscopia confocale ci illustrano l&#39;aspetto di rappresentante OVCAR-5 cellule incapsulate in PuraMatrix il giorno 1, 3, 5, e 7 placcatura post. L&#39;uso di PuraMatrix alle cellule tumorali cultura dovrebbe migliorare la nostra comprensione della malattia e ci permettono di valutare la risposta al trattamento in sistemi modello più clinicamente predittiva.

Questo video dimostra come incapsulare le cellule tumorali e cultura in PuraMatrix, un assemblaggio di auto in commercio gel peptide.

Incapsulamento PuraMatrix delle cellule tumorali

Un numero crescente di prove suggerisce che la coltura di cellule tumorali in tre dimensioni ricapiti con maggiore accuratezza la complessità della biologia tumorale. Molte di queste...

I modelli di colture cellulari in monostrato si sono rivelati strumenti molto utili per lo studio di numerose patologie, inclusi i tumori. Tuttavia, tali modelli non riescono a ricapitolare l'ambiente tridimensionale osservato in vivo. Questo video illustrerà l'utilizzo di Matrixx pura, un gel peptidico autoassemblante disponibile in commercio, per incapsulare e coltivare la linea cellulare di carcinoma ovarico CAR five.La sospensione cellulare viene mescolata con la Matrixx pura e con il terreno di coltura cellulare. Viene aggiunto terreno per avviare l'attivazione della Matrixx pura quando incapsulata e coltivata in Matrixx pura, in cui cinque cellule si assemblano in strutture tridimensionali ASIN R che ricordano la morfologia dei noduli micrometastatici. Ciao, sono Adnan Abbi.Sono un ricercatore presso il laboratorio del Dott. TBA Hassan presso il Woman Center for Photo Medicine del Massachusetts General Hospital. Oggi vi mostreremo un protocollo per incapsulare e coltivare una linea cellulare di carcinoma ovarico in una matrice sintetica chiamata pure matrix. Utilizziamo questo modello per valutare la risposta al trattamento del carcinoma ovarico nel nostro laboratorio.Iniziamo. L'idrogel di peptidi RAD 16 con matrice BD 1% pura ha una concentrazione totale di peptidi di 10 milligrammi per millilitro prima dell'uso. Ridurre la viscosità della matrice pura sottoponendola a sonificazione in un bagno a ultrasuoni per 30 minuti; dopo la sonificazione, mantenere condizioni sterili.Aliquotare la soluzione di matrice pura al 1% in provette sterili. Per semplificare esperimenti futuri ed evitare la formazione di bolle d'aria, se queste si formano, centrifugare semplicemente le provette contenenti la matrice pura a 1000 giri/min per cinque minuti. In questa dimostrazione, si procederà a piastrare due serie di quattro pozzetti ciascuna, rispettivamente a 2,5 milligrammi per millilitro e a 1,25 milligrammi per millilitro di concentrazione totale del peptide. Preparare due miscele madri di peptide in matrice pura in base al numero di pozzetti da piastrare, che in questo caso sono otto.Ogni mix master deve essere preparato a una concentrazione doppia rispetto alla concentrazione finale desiderata del peptide totale, poiché verrà diluito con un volume uguale di cellule durante la semina. Per ottenere i mix master, diluire la matrice pura con saccarosio sterile al 10% e al 13,3% fino a raggiungere concentrazioni finali di peptide di cinque milligrammi per millilitro e 2,5 milligrammi per millilitro, rispettivamente, in modo da ottenere una concentrazione 2x di matrice pura in saccarosio al 10%. Successivamente, aliquotare 25 microlitri dei mix master in otto provette singole. I mix master della matrice pura sono ora pronti per l'incapsulamento cellulare. Nell'ambito di questo esperimento, la linea cellulare di carcinoma ovarico CAR five verrà incapsulata e propagata; prima della incubazione con tripsina, incubare le cellule con 10 millilitri di PBS sterile privo di calcio e magnesio per 15-20 minuti.Aspirare il PBS e la tripsina da una coltura cellulare in monostrato, neutralizzare la tripsina aggiungendo mezzo di coltura contenente siero fetale bovino inattivato termicamente al 10%. Utilizzare almeno due millilitri di mezzo per ogni millilitro di tripsina impiegato nel passaggio precedente. Successivamente, trasferire le cellule in provette da centrifuga e centrifugare a 1000 giri al minuto per cinque minuti per formare un pellet cellulare.Dopo la centrifugazione, sospendere il pellet cellulare in saccarosio sterile al 10%. Contare le cellule e centrifugare nuovamente a 1000 giri al minuto per cinque minuti. Per rimuovere le tracce di sale presenti nel mezzo, risospendere le cellule O car cinque in saccarosio al 10% a una concentrazione di due volte 10 alla quinta cellule per millilitro, in modo che il numero finale di cellule per pozzetto sia di 5.000 cellule in ciascun pozzetto.Le cellule sono ora pronte per l'incapsulamento nella pura Matrixx. I seguenti passaggi per l'incapsulamento delle cellule nella matrice pura devono essere eseguiti rapidamente: aggiungere 25 microlitri della sospensione cellulare precedentemente preparata al primo tubo individuale contenente 25 microlitri del master mix di pura Matrixx. Mescolare rapidamente aspirando e dispensando circa cinque volte su e giù nel tubo, senza introdurre bolle d'aria.Quindi pipettare la sospensione cellulare da 50 microlitri del composto Matrixx puro nel pozzetto appropriato di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti. Avviare l'attivazione del BD pure matrix aggiungendo delicatamente 150 microlitri di mezzo di coltura cellulare lungo il bordo del pozzetto. Ripetere i passaggi per l'incapsulamento delle cellule nei pozzetti rimanenti.Ricordare che questi passaggi devono essere eseguiti rapidamente e che l'intera procedura di incapsulamento deve essere completata per un pozzetto prima di passare al successivo. Dopo aver seminato tutti e otto i pozzetti, lasciare riposare le cellule per 30 minuti. Trascorsi 30 minuti, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, posizionare la punta della pipetta nel pozzetto in modo che non tocchi il letto di matrice pura ed eliminare con molta delicatezza il mezzo di coltura dal pozzetto. È necessario rimuovere circa i due terzi del mezzo per equilibrare il pH dell'idrogel.Non utilizzare un aspiratore a vuoto poiché ciò potrebbe alterare la matrice. Successivamente, aggiungere molto delicatamente 150 microlitri di mezzo di coltura cellulare fresco lungo il lato del pozzetto contenente le cellule incapsulate nella matrice pura Matrixx. Nello stesso modo mostrato in precedenza, rimuovere i due terzi del mezzo e aggiungere mezzo fresco ai pozzetti rimanenti.Sostituire il terreno di coltura cellulare in ogni pozzetto ogni 48 ore con terreno fresco. Sono mostrate rappresentazioni 3D di immagini rappresentative del protocollo di cellule OR5 encapsulate e coltivate in matrice pura ai giorni 1, 3, 5 e 7, come dimostrato nel procedimento.Abbiamo appena illustrato come incapsulare in coltura la linea cellulare di carcinoma ovarico CAR cinque all'interno di una matrice sintetica chiamata Pure Matrixx. Quando si utilizza Pure Matrixx, è importante tenere presente che questo protocollo è stato ottimizzato per la linea cellulare O Car cinque. Ogni ricercatore dovrà ottimizzare e regolare il protocollo in base alla propria specifica linea cellulare.E ricordate, quando si eseguono i cambi del mezzo, è molto importante non disturbare il letto della matrice poiché è molto fragile; non aspirate mai e utilizzate sempre una pipetta. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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