Name: Ossigenazione cerebrale misura Sangue Sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri la misurazione della tensione di ossigeno nella microvascolatura corticale di ratti e topi mediante il metodo di quenching della fosforescenza dipendente dall'ossigeno. Questa tecnica consente di studiare la dinamica dell'ossigeno cerebrale in condizioni fisiologiche e patologiche.

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1. Ampio campo di vista di immagine pO2 in vascolarizzazione corticale di un topo <ol><li> Ratti (250 g -350 g) sono inizialmente anestetizzati con isoflurano, e l'arteria femorale e la vena sono cateterizzati di monitorare la frequenza cardiaca, pressione arteriosa, ed emogasanalisi, così come per infusione endovenosa. La temperatura corporea è mantenuta a 37 ± 0,1 ° C. Tracheotomia viene eseguita, ei ratti sono ventilati con una miscela di aria e ossigeno. </li><li> I campioni di sangue per la misurazione del gas del sangue vengono effettuate ogni 30-45 min e la ventilazione e l'anestesia sono adeguati per mantenere il gas del sangue all'interno normale range fisiologico. </li><li> Una finestra chiusa del cranio sul osso parietale 4 mm x 4 mm dimensioni è preparato per l'imaging. L'osso e la durata vengono rimossi e la finestra del cranio è riempita con 1,5% di agarosio e sigillato con un coprioggetto microscopio. Un ulteriore 1 mm 2 fori bava con l'osso frontale è usato per indurre CSD da microiniezione intracorticale di KCl (~ 10 microlitri, 1 M). Estrema cura deve essere presa per evitare ogni danno della vascolarizzazione corticale. Eccesso di calore, pressione meccanica, o breve periodo di ipossia può compromettere barriera sanguigna e causare perdite del colorante dal sistema vascolare nello spazio interstiziale. </li><li> Una maschera da materiale otticamente opaco è collocato intorno finestra cranica. Lo scopo della maschera è quello di assorbire fosforescenza segnale che viene dal colorante che si sono riversate in tessuto dai bordi della materia dura. Il colorante nello spazio interstiziale è la fonte della fosforescenza molto luminoso che può rovinare la misura. La luminosità aumentata del colorante nello spazio interstiziale è risultato di accumulo del colorante in ambiente con bassa pressione di ossigeno e la frequenza tempra basso. Il danno del sistema vascolare in esperimento è quindi facilmente riconoscibile dalla comparsa di macchie luminose fosforescenza, nel qual caso viene respinto i dati sperimentali. </li><li> Dopo il completamento della chirurgia, isoflurano è interrotto e l'anestesia è passati a alfa-cloraloso (50 mg / kg in bolo per via endovenosa seguiti da 40 mg / (kg h) infusione). </li><li> Animale è trasferito su un carrello con pressione ventilatore, e monitorare la temperatura. Respirando l'aria della stanza, l'animale è rapidamente spostato al setup di imaging e riattaccato per il misuratore di portata con miscela appropriata di aria e ossigeno. </li><li> Il telaio stereotassico che detiene l'animale è posto sotto l'obiettivo. La finestra cranica è al centro del campo visivo nel quadro dell'obiettivo e posizionato parallelamente al piano focale. </li><li> Il laser pulsato è acceso e impostato su impulso di energia minima. Il fascio ottico è diretto verso contatore di energia impulso ed energia impulso consegnato al campione viene regolato per essere non più di 10 mJ / cm 2. L'ISS raggio centrata sulla finestra del cranio con angolo di incidenza obliquo di circa 60 gradi e laser iss spento. </li><li> Le misurazioni dei gas del sangue e le regolazioni della ventilazione ed anestesia vengono eseguite fino a quando tutti i parametri fisiologici dell'animale erano all'interno normale range fisiologico. </li><li> Supponendo che il volume del sangue è di circa il 7% del peso corporeo, una quantità appropriata di R3 fosforescenza Oxyphor sonda è sciolto in 1 ml di soluzione fisiologica per ottenere 4 x 10 -5 M concentrazione ematica della sonda. La soluzione della sonda viene iniettato attraverso la vena femorale. </li><li> Una soluzione 1 M di cloruro di potassio è preparato e ~ 1 ul viene iniettata con la siringa attraverso il foro bava sull'osso frontale per indurre CSD. </li><li> Il laser è acceso e l'imaging viene avviato subito dopo l'iniezione della soluzione di KCl. Imaging di fosforescenza viene eseguita durante ~ 10 min. </li><li> Un'altra misura del gas nel sangue è eseguita a confermare che i parametri fisiologici degli animali sono ancora nel range di normalità. </li><li> Vite fosforescenza si ottengono per tutti i pixel inserendo il decadimento singolo esponenziale con montaggio non lineare quadrato con ponderazione statistica in Matlab. Fosforescenza vite vengono convertiti nel pO2 valori utilizzando un empirico Stern-Volmer come rapporto (vide infra). </li></ol> 2. Ad alta risoluzione a due fotoni pO2 imaging micro vascolarizzazione corticale del mouse <ol><li> I topi vengono anestetizzati con isofluorene arteria femorale ed è cateterizzati di monitorare la frequenza cardiaca, pressione arteriosa, ed emogasanalisi, così come per la somministrazione del colorante. La temperatura corporea è mantenuta a 37 ± 0,1 ° C e gli animali sono in respiro spontaneo una miscela di aria e ossigeno. </li><li> Una finestra del cranio è preparato secondo la tecnica originariamente sviluppata da David Kleinfeld e Winfried Denk. Una buona cura dovrebbe essere presa per evitare qualsiasi danno del sistema vascolare per evitare possibili perdite del colorante nello spazio interstiziale. </li><li> Un paio di campioni di sangue per misurare i gas di sangue effettuato nel corso di una procedura di preparazione del tutto e la ventilazione e l'anestesia sono adeguati per tenere il gas nel sanguees nel normale range fisiologico. </li><li> L'animale viene spostato al setup di imaging. Un telaio modificato stereotassica che detiene l'animale è posto sotto l'obiettivo. La finestra cranica è al centro del campo visivo nel quadro dell'obiettivo Olympus 4X e posizionato parallelamente al piano focale. </li><li> Un'immagine della finestra del cranio è presa con la fotocamera digitale attraverso gli oculari, e l'obiettivo 4X viene sostituito con l'obiettivo 20X Olympus (NA = 0,95). </li><li> Le misurazioni dei gas del sangue e le regolazioni della ventilazione ed anestesia vengono eseguite fino a quando tutti i parametri fisiologici dell'animale sono all'interno di un range di normalità fisiologico. </li><li> Supponendo che il volume del sangue è di circa il 7% del peso corporeo, una quantità appropriata di la fosforescenza sonda PtP-C343 è disciolto in 0,2 ml di soluzione fisiologica per ottenere ~ 15 mM concentrazione ematica della sonda. La soluzione della sonda viene iniettato attraverso l'arteria femorale. </li><li> Iniziare l'esperimento, impostando gli intervalli di tempo desiderato per l'eccitazione tintura e la raccolta di emissione per ogni pixel. </li><li> Acquisire una scansione sondaggio che è un lento 2-dimensionale di scansione raster di degrado intensità fosforescenza che visualizza la struttura vascolare alla profondità attuale. L'obiettivo si sposta perpendicolarmente al finestrino del cranio (asse Z) e lenta scansione sondaggio 2D di intensità fosforescenza sono effettuate utilizzando la potenza minima laser a 840 nm per trovare la microvasi nel piano di imaging. </li><li> Ad ogni profondità di imaging, basato sulla scansione sondaggio di fosforescenza a quella profondità, un insieme di punti all'interno del sistema vascolare sono selezionati, e la registrazione di decadimenti fosforescenza in ogni punto viene ripetuto per un numero predefinito di media. </li><li> Impostare la quantità desiderata di media, intervallo di misura, e la durata sperimentare e avviare la misurazione. pO 2 misure vengono acquisite nelle posizioni selezionato con la frequenza di misura specificata per tutta la durata dell'esperimento. </li><li> Durante le misurazioni, il software re-indirizza il laser di eccitazione alla località selezionate cambiando la posizione degli specchi scansione del galvanometro. Controllo degli scanner galvanometro, modulatore elettro ottico, e tutte le altre apparecchiature sono eseguite da software personalizzato realizzati in LabView. </li><li> Vite fosforescenza sono ottenuti per tutti i punti selezionati inserendo il decadimento singolo esponenziale con montaggio non lineare piazza in Matlab. Fosforescenza vite vengono convertiti nel pO2 valori utilizzando un empirico Stern-Volmer come rapporto (vide infra). </li><li> Dopo aver raccolto i dati a profondità diverse corticale, iniettare destrano coniugato fluoresceina in vasi per l'imaging della struttura microcircolo. </li><li> Ottenere una pila di immagini strutturali del sistema vascolare eseguendo i due fotoni di imaging di fluorescenza FITC utilizzando un canale verde nei quattro canali del rivelatore. </li><li> Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Sottocommissione del Massachusetts General Hospital di ricerca sulla cura degli animali. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Pannello (a) sul lato sinistro di questa figura mostra un ampio campo di vista dell'immagine della pressione di ossigeno prima dell'arrivo di un'onda CSD. Il grafico (b) sul lato destro mostra l'evoluzione temporale della pressione di ossigeno media durante la propagazione CSD all'interno della regione di interesse riportate sul grafico (a). Figura 2 (avi film): Questo film mostra l'evoluzione temporale della pressione dell'ossigeno in tutta la finestra del cranio durante la propagazione dell'onda CSD. Barra di scala indica la pressione dell'ossigeno in millimetri di mercurio. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Proiezione 3D della pila vascolarizzazione immagine. Le tonalità di grigio rappresentano una maschera volumetrico nave, creato sulla base dell'immagine strutturale. PO 2 valori misurati sono colorati. Barra di scala è di 200 micrometri. Ristampato con il permesso di Nature Publishing Group 7.

<ol><li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinfeld%2C+D+%22Contemporary+Neuroscience+Series%22">Contemporary Neuroscience Series</a>. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials & Interfaces. , (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li>
<li>Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li>
<li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li>
<li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li>
</ol>

Abbiamo dimostrato due applicazioni della misura pO2 nel microcircolo corticale sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza. Mentre il primo metodo basato sul CCD fornisce immagini a largo campo di vista di pO2 monitoraggio, misurazione della pressione parziale di ossigeno nel microcircolo corticale sulla base di 2-fotoni microscopia fornisce una risoluzione capillare e permette l&#39;imaging in profondità. Entrambi i metodi forniscono ad alta velocità e alto rapporto segnale-rumore misurazioni. Inoltre, l...

<table><tbody><tr><td>Glicopirrolato</td><td>Reagente</td><td>American Regent Inc.</td><td>NDC 0517-4605-25</td><td>Utilizzato per controllare le secrezioni faringee, tracheali e bronchiali.</td></tr><tr><td>Cloridrato di lidocaina</td><td>Reagente</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4277-01</td><td>Utilizzato come anestetico locale durante gli interventi chirurgici.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Reagente</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>Utilizzato come farmaco anestetico generale per inalazione durante gli interventi chirurgici e come anestesia generale durante esperimenti con topi.</td></tr><tr><td>Alfa-cloraloso</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0128</td><td>Utilizzato come anestesia generale durante esperimenti con ratti.</td></tr><tr><td>Fluoresceina isotiocianato&amp;#8211;dextrano</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td>Somministrato per ottenere una concentrazione di circa 500 nM nel sangue.</td></tr></tbody></table>

ossigenazione cerebrale misura sangue sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Monitoraggio delle caratteristiche spazio-temporale di sangue e l&#39;ossigenazione dei tessuti cerebrali è cruciale per una migliore comprensione della neuro-metabolico-vascolari rapporto. Sviluppo di nuove modalità di pO2 misura con il monitoraggio simultaneo di pO2 in grandi campi di vista con maggiore risoluzione spaziale e / o temporale consentirà una maggiore comprensione del funzionamento del cervello normale e avrà anche un impatto significativo sulla diagnosi e cura delle malattie neurovascolari come ictus, il morbo di Alzheimer, e trauma cranico. Modalità di imaging ottico hanno dimostrato un grande potenziale per fornire ad alta risoluzione spazio-temporali e di imaging quantitativo di pO2 sulla base di assorbimento dell&#39;emoglobina nel visibile e nel vicino campo infrarosso dello spettro ottico. Tuttavia, la misura multispettrali di ossigenazione del sangue cerebrale si basa sulla migrazione fotone attraverso il tessuto cerebrale altamente dispersione. Stima e la modellazione dei parametri dei tessuti ottici, che possono subire cambiamenti dinamici durante l&#39;esperimento, è in genere necessario per la stima accurata di ossigenazione del sangue. D&#39;altra parte, la stima della pressione parziale di ossigeno (pO2) sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza non dovrebbe essere significativamente influenzato dai cambiamenti nei parametri ottica del tessuto e fornisce una misura assoluta di pO2. Sistemi sperimentali che utilizzano ossigeno sensibili coloranti sono stati dimostrati in studi in vivo del tessuto perfusi così come per il monitoraggio del contenuto di ossigeno in colture di tessuti, mostrando che tempra fosforescenza è una potente tecnologia di imaging in grado di ossigeno accurate nel fisiologico pO2 gamma. Qui mostriamo con due diverse modalità di imaging come eseguire la misurazione di pO2 nel sistema vascolare corticale basata sull&#39;imaging vita fosforescenza. Nella prima dimostrazione che presentiamo ampio campo di vista di immagine pO2 sulla superficie corticale di un topo. Questa modalità di imaging è relativamente semplice apparato sperimentale basato su una camera CCD e un laser pulsato verde. Un esempio di monitoraggio della depressione corticale diffusione sulla base di tutta la vita fosforescenza di colorante R3 Oxyphor è stato presentato. Nella seconda dimostrazione vi presentiamo una risoluzione elevata a due fotoni pO2 immagini in micro vascolarizzazione corticale di un mouse. Il setup sperimentale comprende un personalizzato costruito 2-fotone microscopio con laser a femtosecondi, modulatore elettro-ottico, fotonica e di conteggio tubo moltiplicatore foto. Vi presentiamo un esempio di imaging l&#39;eterogeneità pO2 nel microcircolo corticale tra capillari, con un romanzo PtP-C343 tintura con maggiore 2-fotoni sezione eccitazione. Clicca qui per visualizzare l&#39;articolo relativo <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici.</a>

Vi presentiamo una procedura sperimentale per la misurazione della pressione parziale di ossigeno (pO2) in vasi cerebrali sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza. Preparazione degli animali e delle procedure di imaging sono stati delineati per entrambi ampio campo visivo CCD-based imaging di pO2 nel ratto e nel 2-fotoni immagini eccitazione base di pO2 nei topi.

Ossigenazione cerebrale misura Sangue Sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza

Il monitoraggio delle caratteristiche spaziotemporali dell'ossigenazione del sangue e dei tessuti cerebrali è fondamentale per una migliore comprensione della...

Ciao, sono Sava Saje del Photo Migration Imaging Laboratory di David Bo presso il Martino Center for Biomedical Imaging del Massachusetts General Hospital. E sono anche capo del David Bow Laboratory e provengo dallo stesso laboratorio. Oggi vi mostreremo due procedure per la misurazione della tensione di ossigeno nella microvascolatura corticale di piccoli roditori, basate sull'estinzione dipendente dall'ossigeno della fosforescenza.Utilizziamo queste tecniche nel nostro laboratorio per studiare il rilascio e il consumo di ossigeno in condizioni cerebrali normali e patologiche. Cominciamo dunque. Per prima cosa, preparare diversi frammenti di vetrini coprioggetto circondati da maschere otticamente assorbenti realizzate con nastro isolante nero.Le maschere devono avere aperture di circa 3,5 millimetri di diametro. Questi coprioggetti vengono utilizzati per sigillare le finestre craniche, mentre la maschera assorbente blocca il segnale fosforescente di qualsiasi colorante fuoriuscito dai bordi delle finestre craniche. Preparare ora la finestra cranica sigillata sull'osso parietale.I dettagli della preparazione sono disponibili nei lavori di Kleinfeld et al. e Masini et al. citati in questa pubblicazione. In questa preparazione, la dura madre viene rimossa. Assicurarsi che la maschera copra tutti i bordi della finestra cranica.Ora, utilizzando un trapano dentale, praticare un foro aggiuntivo di un millimetro nel cranio frontale. Questo foro verrà utilizzato in seguito per indurre la depressione corticale progressiva. Avere cura di non danneggiare la vascolarizzazione corticale in alcun passaggio.Il sistema di imaging è costituito da un laser YAG a impulsi quantel brilliant a 532 nanometri e 10 hertz, in cui una piccola parte dell'energia dell'impulso viene accoppiata a una fibra multimodale e indirizzata al campione. L'energia di ciascun impulso viene inoltre campionata mediante un fotodiodo. Un rivelatore CCD.QE della visione law è montato su una piattaforma verticale Z. Utilizziamo un obiettivo Olympus quattro X con una distanza operativa di 29 millimetri. Un filtro passa-alto con una lunghezza d'onda di taglio di 650 nanometri e una lente tubolare con lunghezza focale di 100 millimetri sono montati davanti alla telecamera con l'animale posizionato.Regolare la posizione dell'obiettivo. Impostare ora il laser sull'energia minima dell'impulso e accenderlo. Misurare l'energia del fascio con un misuratore di energia degli impulsi ottici e regolare l'interruttore Q.Impostare un tempo di ritardo tale per cui l'energia dell'impulso erogata al campione non superi i 10 millijoule per centimetro quadrato. Successivamente, verificare che tutti i parametri fisiologici dell'animale siano entro i limiti fisiologici normali. Quindi, sciogliere una quantità ponderale appropriata della sonda fosforescente sensibile all'ossigeno.Oxy four R three, sviluppato da Libi Dev et al., viene aggiunto a un millilitro di soluzione fisiologica per ottenere una concentrazione di 40 micromolare nel sangue. Iniettare lentamente la soluzione nella vena femorale. Iniettare ora circa un microlitro di una soluzione uno molare di cloruro di potassio attraverso il foro praticato nel cranio nell'osso frontale per indurre la depressione corticale progressiva e avviare il software di acquisizione dati.L'acquisizione dell'immagine della fosforescenza dovrebbe durare circa 10 minuti. Durante l'esperimento, le immagini della fosforescenza vengono visualizzate in tempo reale sullo schermo. Al termine dell'acquisizione, prelevare un altro campione di sangue per confermare che i gas nel sangue dell'animale siano ancora entro i limiti fisiologici normali.Ecco alcuni risultati rappresentativi dell'imaging CCD a campo largo di PO O2 durante la depressione corticale progressiva. Il lato sinistro di questa figura mostra un'immagine a campo largo della pressione di ossigeno prima dell'arrivo dell'onda di DCP. Il lato destro mostra l'evoluzione temporale della pressione media di ossigeno durante la propagazione della DCP all'interno della regione di interesse indicata a sinistra.Questo filmato mostra l'evoluzione temporale della pressione di ossigeno in tutta la finestra cranica. Durante la propagazione dell'onda di desincronizzazione corticale (CSD), la barra della scala indica la pressione di ossigeno in millimetri di mercurio per l'immagine a due fotoni della tensione di ossigeno e della microvascolatura corticale di un topo. Preparare la finestra cranica come descritto nell'articolo numero sei 80 di JoVE e inserire la cannula nell'arteria femorale.Per l'acquisizione delle immagini, utilizziamo un obiettivo ad immersione in acqua con rivestimento infrarosso da 20x Olympus, sciogliamo una quantità ponderale appropriata della sonda fosforescente sensibile all'ossigeno, PTPC 3 43, sviluppata da Kova et al. in 0,2 ml di soluzione salina e la filtriamo attraverso un filtro da due micron. Dopo aver verificato che i parametri fisiologici dell'animale siano entro i limiti fisiologici normali, iniettiamo molto lentamente la soluzione di PTPC 3 43 nell'arteria femorale. I componenti principali dell'apparato sperimentale sono un laser a femtosecondi impostato a 840 nanometri, un modulatore elettro-ottico, scanner a galvanometro, lenti di scansione e lenti tubo Olympus, e un rivelatore a quattro canali con fotomoltiplicatori (PMT).Un canale di rilevamento contiene sia un PMT che un discriminatore. I conteggi di fotoni vengono raccolti mediante una scheda digitale ad alta velocità. Tutti gli aspetti dell'esperimento sono controllati da un software scritto in LabVIEW e C.Iniziare l'esperimento impostando gli intervalli di tempo desiderati per l'eccitazione del colorante e la raccolta dell'emissione. In ogni pixel, acquisire innanzitutto una scansione preliminare, ovvero una scansione raster bidimensionale lenta del decadimento dell'intensità della fosforescenza, che visualizza la struttura del sistema vascolare alla profondità corrente. Utilizzando l'immagine della scansione preliminare, selezionare delle posizioni intravascolari in cui misurare la PO₂. Durante le misurazioni, il software devia il laser di eccitazione verso le posizioni selezionate modificando la posizione degli specchi di scansione galvanometrici.Impostare la quantità desiderata di intervallo di misura per la media e la durata dell'esperimento, quindi avviare la misurazione. Vengono acquisite due misure PO nei punti selezionati all'intervallo di misura specificato per tutta la durata dell'esperimento. Dopo aver raccolto i dati a diverse profondità corticali, iniettare un colorante fluorescente coniugato con destrina nel circolo vascolare per l'imaging.La struttura della microvascolatura. Ottieni una serie di immagini strutturali della vascolatura eseguendo l'immagine a due fotoni della fluorescenza di fitc utilizzando un canale verde nel rilevatore a quattro canali. Qui presentiamo una proiezione 3D della serie di immagini della microvascolatura acquisite.Le sfumature di grigio rappresentano una maschera volumetrica dei vasi creata in base all'immagine strutturale. I valori di PO₂ misurati sono stati codificati a colori. La barra della scala è di 200 micrometri.Vi abbiamo appena mostrato due procedure per misurare la tensione di ossigeno nella microvascolatura corticale, in piccoli roditori, basate sull'indebolimento dipendente dall'ossigeno della fosforescenza. Quando si eseguono queste procedure, è importante effettuare interventi chirurgici cerebrali molto accurati e indossare occhiali di protezione durante l'uso dei laser. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Vi presentiamo i principi delle misure di ossigeno da tempra fosforescenza e la progettazione commento su nanosensori dendritiche porfirina-based per l'imaging di ossigeno nei sistemi biologici.

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Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

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simulazione ipossia negli esseri umani è stato di solito eseguita da inalazione di miscele di gas ipossiche. Per questo studio, i subacquei di apnea sono stati utilizzati per simulare ipossia dinamica nell'uomo. Inoltre, i cambiamenti fisiologici di desaturazione e ri-saturazione cinetica sono stati valutati con strumenti non invasivi come la Near-Infrared-spettroscopia (NIRS) e la saturazione di ossigenazione periferica (SpO2).

Un modello per simulare ipossia clinicamente rilevanti negli esseri umani

Qui, presentiamo un metodo di caratterizzazione spettroscopica di molecole organiche mediante spettroscopia di fotoluminescenza risolta in tempo sulla scala cronologica nanosecondo al millisecondo in condizioni di assenza di ossigeno. Metodi per rimuovere efficientemente l'ossigeno dai campioni e, quindi, limitare luminescenza tempra inoltre sono descritti.

Tempo-risolta caratterizzazione fotofisica di tripletto-raccoglitrici composti organici a un utilizzo di ambiente privo di ossigeno un iCCD telecamera

Descriviamo l'uso di una nuova telecamera a vita di luminescenza del dominio di frequenza per la mappatura delle distribuzioni 2D O2 con fogli di sensori ottici. Il sistema di telecamere e le procedure di analisi delle immagini sono descritte insieme alla preparazione, alla calibrazione e all'applicazione di fogli di sensori per la visualizzazione del microambiente O2 nella rizosfera delle piante acquatiche.

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Questo protocollo dimostra come misurare la connettività funzionale dello stato di riposo nella corteccia prefrontale umana utilizzando uno strumento di spettroscopia di correlazione diffusa su misura. La relazione discute anche gli aspetti pratici dell'esperimento e le fasi dettagliate per l'analisi dei dati.

Connettività funzionale dello stato di riposo basato sul flusso sanguigno cerebrale del cervello umano utilizzando la spettroscopia ottica di correlazione diffusa

Presentato qui è un protocollo per il monitoraggio non invasivo dell'emodinamica cerebrale di pazienti neurocritici in tempo reale e al letto del paziente utilizzando ottiche diffuse. In particolare, il protocollo proposto utilizza un sistema ottico diffuso ibrido per rilevare e visualizzare informazioni in tempo reale sull'ossigenazione cerebrale, sul flusso sanguigno cerebrale e sul metabolismo cerebrale.

Monitoraggio in tempo reale di pazienti neurocritici con spettroscopie ottiche diffuse

Il protocollo descrive la generazione di sferoidi ad alto rendimento per la bioprinting utilizzando l'analisi multiparametrica della loro ossigenazione e morte cellulare su un microscopio a fluorescenza standard. Questo approccio può essere applicato per controllare la vitalità degli sferoidi ed eseguire la standardizzazione, che è importante nella modellazione del tessuto 3D, del microambiente tumorale e della biofabbricazione (micro)tissutale di successo.

Biofabbricazione assistita da microscopia dell'ossigeno a prezzi accessibili di sferoidi multicellulari

Questo articolo descrive l'uso di un nuovo imager ottico veloce per l'imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l'imaging e l'applicazione dell'imager nello studio dei campioni biologici.

Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche

Descriviamo un protocollo per misurare in modo non invasivo e continuo l'indice di flusso sanguigno microvascolare assoluto e la saturazione di ossigeno nel sangue utilizzando un dispositivo multimodale basato su ottiche diffuse nel vicino infrarosso. Valutiamo quindi il tasso metabolico del consumo di ossigeno e l'iperemia reattiva utilizzando un test di occlusione vascolare.

Monitoraggio non invasivo dell'ossigenazione microvascolare e dell'iperemia reattiva mediante spettroscopia ottica diffusa ibrida nel vicino infrarosso per la terapia intensiva

Scopri la misurazione della tensione di ossigeno nella microvascolatura corticale di ratti e topi mediante il metodo di quenching della fosforescenza dipendente dall'ossigeno. Questa tecnica consente di studiare la dinamica dell'ossigeno cerebrale in condizioni fisiologiche e patologiche.

Ossigenazione cerebrale misura Sangue Sulla base di ossigeno-dipendente tempra di fosforescenza

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