Name: Un protocollo per la produzione di KLRG1 tetramero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Scopri come produrre tetrameri KLRG1 per analizzare interazioni ligando-recettore nel sistema immunitario. Questo protocollo dettagliato utilizza colture batteriche e induzione con IPTG per generare strumenti affidabili per la ricerca immunologica.

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Ringraziamo il Dott. Naidenko per aiutare ad ottimizzare le condizioni di ripiegamento. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH assegno di ricerca AI58181 a Laurent Brossay. Cindy Banh è sostenuto da NIH NRSA F31 AI080230. Stephanie Terrizzi e Cindy Banh contribuiscono ugualmente a questo lavoro.

Preparazione dei corpi inclusi <ol><li> Inoculare 4 x 500 ml di fiaschi TB ciascuno contenente 50 mg / ml di cloramfenicolo carbenicillina e con una cultura durante la notte di batteri che esprime la KLRG1 costruire plasmide. Quando il diametro esterno raggiunge 0,6 A a 600 nm, indurre con l'aggiunta di 0,4 M IPTG e incubare la cultura per ulteriori 4 ore in agitazione a 37 ° C. </li><li> Risospendere le cellule raccolte in pH tampone risospensione = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 25% (p / v) di saccarosio, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Nota: pellet possono essere congelati in questa fase. </li><li> Piscina non più di 60 ml di resuspensions batterica in un bicchiere polipropilene. Se necessario regolare a 60 ml con tampone TE pH 8,0 e mescolate miscela a velocità dimezzata. </li><li> Per mescolando miscela aggiungere goccia a goccia: lisozima (finale = 1 mg / ml), MgCl2 (finale = 5 mm), 2 mg DNAsi I nel 50% glicerolo contenute 75 mm NaCl, Triton-X100 (finale = 1%), DTT ( finale = 10 mm). </li><li> Sonicare la soluzione in ghiaccio per 1,5 minuti e centrifugare il lisato a 5.000 giri per 10 minuti a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Decantare il surnatante. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone di lavaggio pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl, 0.5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> Sul ghiaccio, ultrasuoni soluzione per 1,5 minuti fino a quando il pellet è completamente risospeso. </li><li> Centrifugare i campioni a 5.000 giri per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Ripetere il lavaggio 5 volte. </li></ol></li><li> Ripetere 5b con tampone di lavaggio senza Triton X-100, centrifuga e risospendere in 4 ml di tampone TE. </li><li> Prendere sul bagnato inclusione peso enti liquami e conservare in TE buffer alla concentrazione di 30 a 100 mg / ml. </li></ol> Ripiegamento di KLRG1 <ol><li> Fare 1 l di ripiegamento tampone pH = 8.0 (0.4 M-Arginina HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mm PMSF, 3 EDTA senza compresse inibitore della proteasi, 5 GSH mM e 0,5 mM GSSG) e freddo a 4 ° C sotto agitazione. </li><li> Preparare i corpi di inclusione per l'iniezione nella miscela pieghevole: è l'ideale per fare 5 10 iniezioni ciascuna con 0,25 0,5 concentrazione mM in modo che la concentrazione finale della proteina saranno 2 3 micron. <ol class="lalpha"><li> Fate sciogliere il volume di 50 mg di liquami inclusione corpi in 7 M GnHCl con 10 mM β-mercaptoetanolo. </li><li> Mantenere l'inserimento corpi / miscela GnHCl a 37 ° C per 30 - 40 min e vortice ogni 5 minuti per assicurare fusione completa (liquame diventerà chiaro quando completamente sciolto). </li><li> Centrifugare alla massima velocità per 30 min in microcentrifuga a 4 ° C e trasferire il sopranatante in una provetta da centrifuga da 15 ml. Non a trasferire dei piccoli pellet nerastro. </li></ol></li><li> Regolare il volume con tampone di iniezione (3 M GnHCl, 10 NaAcetate mM, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Iniettare 1 ml di corpi inclusi diluito ogni ora. Quando si somministra, mescolate ad alta velocità, aggiungere 1 ml di goccia diluita corpi inclusi a goccia con 2 secondi tra ogni goccia. Quando l'iniezione viene fatta, mescolare a bassa velocità. </li><li> Continuare a mescolare durante la notte a bassa velocità a 4 ° C. </li></ol> Concentrazione delle reazioni ripiegamento <ol><li> A seguito di protocollo Millipore s, concentrare l'1 L di pre-filtrati (0,22 micron filtrata) reazione ripiegamento utilizzando un Amicon mescolato cellulare e YM10 NMWL ultrafiltrazione 10K membrana (Millipore) a ~ 10 ml. </li><li> Concentrato a ≤ 2 ml con un Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> Purificazione di KLRG1 tetramero <ol><li> Impostare il AKTAFPLC a 4 ° C secondo GE Healthcare manuali. </li><li> Purificare la forma di monomero KLRG1 per cromatografia dimensione esclusione utilizzando un Sephacryl S-200 ad alta risoluzione 16/60 colonna (GE Healthcare) in 20 HEPES mm e 150 mm NaCl. (Vedi figura 1). </li><li> Concentrato a 1 ml con Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Usa enzima Bira secondo il protocollo Avidità s per biotinylate il monomero KLRG1. </li><li> La biotina libera viene eliminato mediante cromatografia dimensione esclusione come in 2. </li><li> KLRG1 molecola è tetramerized mescolando KLRG1 monomero con 4 volte molare in eccesso PE coniugato streptavidina (BD Biosciences). </li></ol> Rappresentante Risultati <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"></a> Figura 1. Rappresentante risultati positivi dal cromatografia dimensione esclusione Akta FPLC del ripiegate KLRG1. Il grafico mostra la separazione del monomero (83,52 ml), dimero (56,36 ml), e multimer (36,26 ml) forma del ripiegate KLRG1. Il picco a 94,25 ml rappresenta lo scambio di buffer.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

In questo protocollo, viene mostrato come purificare, biotinylate e KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetramero può essere utilizzato per etichettare KLRG1 ligandi mediante citometria di flusso. Sebbene le condizioni ripiegamento dovranno essere testati empiricamente per ogni proteina, altro tipo C lectine potrebbe essere tetramerized utilizzando un protocollo simile. Utilizzando proteine ​​tetramerized come sonde, ligandi di orfano di tipo C recettori lectina potrebbero essere identificati.

<table><tbody><tr><td>Enzima BirA e tampone</td><td>Kit di biotinilazione</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Compresse complete di inibitore di proteasi Mini, senza EDTA</td><td>Reagente</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Cella agitata Amicon</td><td>Attrezzatura</td><td>EMD Millipore</td><td>Modello #8400</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Membrana di ultrafiltrazione YM10 NMWL 10K</td><td>Materiale per filtrazione</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore da 15 ml YM10</td><td>Materiale per filtrazione</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Attrezzatura</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Colonna ad alta risoluzione Sephacryl S-200 16/60</td><td>Attrezzatura</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina PE</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>o equivalente</td></tr></tbody></table>

un protocollo per la produzione di klrg1 tetramero

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Cellule killer lectina come G1 recettore (KLRG1) è un tipo di recettore della glicoproteina transmembrana II inibitorio appartenenti al tipo C-lectina come superfamiglia. KLRG1 esiste sia come monomero e come disolfuro-linked omodimero. Questo ben conservato si trova recettore sulle cellule più mature e recentemente attivato NK e su un sottogruppo di cellule T effettrici / memoria. Utilizzando KLRG1 tetramero così come altri metodi, E-, N-, e R-caderine sono stati identificati come KLRG1 leganti. Questi Ca +-dipendente cellula-cellula molecole di adesione si compone di un dominio extracellulare contenente cinque ripete caderina responsabile interazioni cellula-cellula, un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico che è legato al citoscheletro di actina 2. Generazione del tetramero KLRG1 era essenziale per l&#39;identificazione dei KLRG1 ligandi. KLRG1 tetramero è anche uno strumento unico per chiarire la caderina ruoli e giocare KLRG1 nella regolazione della risposta immunitaria e l&#39;integrità dei tessuti.

Questo protocollo descrive la produzione di KLRG1 tetramero, che è un potente strumento per l&#39;analisi di KLRG1 ligandi.

Un protocollo per la produzione di KLRG1 tetramero

Il recettore simile a lectina delle cellule killer G1 (KLRG1) è un recettore inibitorio glicoproteico transmembrana di tipo II appartenente alla superfamiglia delle lectine di tipo C. ...

Ciao, sono Stephanie Resi del laboratorio di Lauren Parce del Dipartimento di Microbiologia Molecolare e Immunologia della Brown University. Oggi vi mostreremo un procedimento per la generazione di tetrameri K LRG uno. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le interazioni coerenti di K LRG uno.Iniziamo. Per prima cosa, inoculare quattro fiasche da 500 millilitri di tampone TB contenente antibiotici appropriati con batteri esprimenti il costrutto plasmidico K LRG one e coltivare a 37 gradi Celsius con agitazione finché l'OD non raggiunge 0,6, unità assorbite a 600 nanometri, quindi indurre l'espressione tramite il promotore T seven aggiungendo 0,4 molare di IPTG e incubare la coltura per ulteriori quattro ore con agitazione a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione di quattro ore, trasferire i batteri in provette da centrifuga e centrifugare le colture per 20 minuti a 3000 giri al minuto e a 4 gradi Celsius.Se necessario, i pellet possono essere congelati a meno 80 gradi Celsius in questo momento per essere utilizzati in un momento successivo. Ri-sospendere le cellule raccolte in 30 millilitri di buffer di sospensione Resus. Successivamente, unire le sospensioni batteriche Resus fino a un volume di 60 millilitri in un becher di polipropilene.Se necessario, portare il volume totale a 60 millilitri aggiungendo ulteriore tampone TE a pH otto e mescolare la miscela a velocità media su un agitatore magnetico mentre la sospensione di Resus in pool viene agitata insieme alle seguenti soluzioni: lisozima, cloruro di magnesio, D NS uno, TRITON X-100 e, infine, DTT, aggiunti goccia a goccia alla miscela.Trasferire la soluzione in provette per ultracentrifuga utilizzando una pipetta dotata di convertitore a ultrasuoni al 30% di ampiezza. Sottoporre la soluzione a sonificazione sul ghiaccio per 1,5 minuti e centrifugare il lisato a 5.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi Celsius, decantare il soprannatante e aggiungere 15 millilitri di buffer di lavaggio. Ripetere la sonificazione come in precedenza fino a quando il pellet è completamente risospeso e ripetere la centrifugazione; ripetere i passaggi di lavaggio e di formazione del pellet cinque volte.Infine, risospendere il pellet utilizzando tampone di lavaggio che non contiene Triton X-100. Centrifugare ancora una volta e risospendere in quattro millilitri di tampone TE. Questi sono i vostri corpi di inclusione.Quantifichi i suoi corpi di inclusione in base al peso fresco. La sospensione dei corpi di inclusione può essere conservata a quattro gradi Celsius nei tamponi a concentrazioni da 30 a 100 milligrammi per millilitro. Una volta pronti i corpi di inclusione, può ora procedere al ripiegamento.Iniziare la procedura di ripiegamento preparando una bottiglia da un litro di tampone di ripiegamento, appena preparato, e agitare a bassa velocità a quattro gradi Celsius per raffreddarlo. Successivamente, preparare sette iniezioni di corpi di inclusione da iniettare nel tampone di ripiegamento. Per prima cosa, sciogliere il campione di sospensione di corpi di inclusione in una provetta da microcentrifuga contenente un volume finale di 1,4 millilitri in cloridrato di guanidina sette molare più 10 millimolare di β-mercaptoetanolo, in un bagno a 37 gradi Celsius per 30-40 minuti.Agitare vortex ogni cinque minuti. Saprete che la fusione è completa quando la sospensione diventa limpida.Centrifugare la miscela fusa alla velocità massima per 30 minuti in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius. Quindi, avendo cura di non raccogliere alcuna parte del piccolo pellet scuro. Trasferire il soprannatante in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.Regolare il volume a sette millilitri con tampone per iniezione per effettuare l'iniezione. Innanzitutto, aumentare la velocità di agitazione della miscela di ripiegamento a livello elevato. Quindi aggiungere un millilitro di corpi di inclusione diluiti.Goccia a goccia, con due secondi di intervallo tra ogni goccia. Aggiungere un millilitro di corpi di inclusione diluiti alla volta, con un'ora di intervallo tra ogni iniezione. Riportare la velocità di agitazione al minimo.Continuare a mescolare a bassa velocità a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Le proteine saranno quindi pronte per la concentrazione e la purificazione. Per iniziare a concentrare i tetrameri di KLRG1 ripiegati.Prima prefiltrare la reazione utilizzando un filtro da 22 micrometri. Successivamente, concentrare la reazione da un litro a circa 10 millilitri utilizzando una cella a agitazione Millipore Amicon e una membrana per ultrafiltrazione con limite nominale di peso molecolare di 10 kilodalton, seguendo le istruzioni del produttore e quelle specificate in S. Quindi, utilizzando una membrana per ultrafiltrazione Millipore con cutoff di peso molecolare di 10 kilodalton, concentrare ulteriormente fino a un volume minore o uguale a due millilitri.Configurare il sistema di cromatografia secondo le istruzioni del produttore. Utilizziamo il sistema di cromatografia liquida per proteine rapide GE healthcare ACTA a quattro gradi Celsius, impiegando una colonna ad alta risoluzione. Purificare la forma monomerica di K lrg, in 20 millimolar heaps e 150 millimolar cloruro di sodio, mediante cromatografia di esclusione molecolare.Il volume iniettato deve essere inferiore al 2% del volume totale del gel della colonna. Nuovamente, utilizzando una membrana da filtrazione ultrafine Millipore con cutoff di peso molecolare di 10 chilodalton, concentrare ulteriormente fino a un volume finale di un millilitro del monomero KLG seguendo le istruzioni del produttore. Rimuovere la biotina libera purificando come in precedenza mediante cromatografia di esclusione molecolare per ottenere il tetramero.Mescolare i monomeri KL LRG uno con un eccesso molare quadruplo di tetrameri di streptavidina coniugati con FICO rina sono ora disponibili per l'etichettatura di ligandi recettoriali. Questo grafico mostra un risultato positivo della separazione delle proteine K LRG uno ripiegate mediante cromatografia di esclusione molecolare da sinistra a destra. I picchi illustrano le forme multimerica, dimero e monomero di K LRG uno.Il picco più a destra rappresenta lo scambio del tampone. Sebbene le condizioni di ripiegamento debbano essere testate empiricamente per ogni proteina, altri recettori di tipo lectina C dovrebbero poter formare un tetramero utilizzando un protocollo simile, consentendo così l'identificazione potenziale di altri ligandi. Vi abbiamo appena mostrato come generare il tetramero di KLRG1 durante l'esecuzione di questa procedura.È importante ricordare di verificare i livelli di induzione e di attenersi rigorosamente alle condizioni di ripiegamento. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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