Bone Preparazione Undecalcified per Istologia, Istomorfometria e analisi Fluorocromo

E l'istologia dell'osso decalcificato dimostra la microarchitettura ossea, mostrando sia i componenti mineralizzati che cellulari dell'osso, fornendo informazioni essenziali sul rimodellamento osseo o sulla formazione e riassorbimento dell'osso. Questo riveste un'importanza notevole in una vasta gamma di applicazioni cliniche e di ricerca. Fornisce immagini dettagliate e consente tecniche come la valutazione con fluorescenza e l'istooptometria.

Realizzare sezioni sotto l'osso calcificato è tecnicamente complesso, in particolare con campioni di grandi dimensioni. Questo video illustrerà le difficoltà tecniche e i metodi per superarle al fine di ottenere sezioni sotto l'osso calcificato. Non tratterà la valutazione istomorfometrica di queste sezioni.

Per questo, vi rimandiamo alla seguente pubblicazione fondamentale. Questo video illustrerà la preparazione del campione e le procedure di fissazione, l'inclusione e il taglio istologico sia con metodo dello "ground" che con metodo del "cut", la preparazione dei vetrini e la colorazione, dopo il prelievo del tessuto. Il campione.

In questo caso, la colonna vertebrale cervicale di pecora viene posta in un contenitore sigillato e opaco contenente una soluzione tampone al 10% di fosfato. L'esposizione alla luce deve essere minima se si intende eseguire un'analisi con fluorocromo. Poiché i fluorocromi sono sensibili alla luce, il campione viene quindi trasferito in laboratorio e ridotto alle dimensioni appropriate, operazione che migliora la fissazione e garantisce che si adatti a un blocco.

Sebbene a questo punto sia necessario conoscere l'orientamento del tessuto sul vetrino, in modo che il blocco possa essere preparato nel piano corretto. La sicurezza è molto importante e gli strumenti devono essere utilizzati in modo da mantenere le mani lontane dalla lama. La loro area di interesse viene ora ridotta alle dimensioni desiderate.

Il rifinitura finale viene quindi eseguita con una sega a nastro più piccola, il che comporta una minore perdita di tessuto. Una volta che un blocco è stato tagliato alle dimensioni desiderate, viene collocato in un contenitore sigillato e opaco contenente formula fresca per completare la fissazione. Il volume del contenitore dovrebbe essere approssimativamente 10 volte la dimensione del campione.

Per ottenere una fissazione adeguata, il campione deve rimanere nella formula e nella soluzione da una a due settimane, a seconda delle dimensioni; successivamente viene trasferito in Etanolo al 70%. La lavorazione viene quindi eseguita lentamente, poiché le grandi dimensioni dei blocchi e la bassa permeabilità dell'osso rendono lenta la diffusione dei solventi. La disidratazione viene quindi effettuata utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo e successivamente la chiarificazione viene fatta in butanolo. Il campione viene mantenuto al riparo dalla luce e sotto agitazione costante.

Si consiglia circa una settimana in ciascuna soluzione. Il processo richiede quindi circa quattro-sei settimane. Questo passaggio non deve essere accelerato, poiché comprometterebbe la qualità finale delle sezioni.

Esistono diverse opzioni di inclusione disponibili per l'osso calcificato. La scelta della resina o del metacrilato dipende da ciò che deve essere analizzato. Ad esempio, l'immunohistochimica non è possibile con tutte le resine.

Le resine epossidiche richiedono luce UV per la polimerizzazione, il che interferirebbe con l'analisi dei fluorocromi. Raccomandiamo di consultare le specifiche del produttore prima di effettuare una scelta accurata. Utilizziamo TEVI 7, 100 poiché consente sezioni ben tagliate e levigate per la microscopia ottica e l'analisi dei fluorocromi ed è economicamente vantaggiosa.

Un aspetto importante da considerare durante l'inclusione è che la densità dell'osso e quella del mezzo di inclusione dovrebbero essere il più possibile simili. Questo è molto importante durante il successivo taglio dei blocchi, in particolare per la sezione micro termica; la miscela viene preparata secondo le istruzioni del produttore e agitata vigorosamente. Potrebbe essere utile includere alcuni campioni di prova per ottimizzare il protocollo.

A differenza della paraffina, questo è un passaggio irreversibile. I blocchi vengono posizionati con la superficie di taglio rivolta verso il basso all'interno dello stampo. Lo stampo sarà più grande del blocco per fornire supporto e resistenza.

L'infiltrazione con metacrilato deve essere eseguita lentamente per consentire un'infiltrazione massima del metacrilato nell'osso. Ancora una volta, l'esposizione alla luce deve essere ridotta al minimo. Dopo una settimana con una soluzione di infiltrazione, la soluzione di infiltrazione viene sostituita e viene aggiunta la soluzione indurente.

Viene quindi realizzata una piastra di supporto. Per questo utilizziamo tevit 30 40. Successivamente, il modello viene staccato e il blocco è ora pronto.

La sezionatura per affilatura produce sezioni più grandi, con uno spessore compreso tra 20 e 50 micron. È utile per l'analisi fluorometrica poiché sezioni più spesse generano una fluorescenza più intensa. Per ottenere la sezione affilata, è necessario un microtomo, preferibilmente dotato di lama di diamante. Utilizziamo una lama di diamante curva da 0,6 millimetri.

È fondamentale utilizzare un lubrificante. Preferiamo un lubrificante a base di petrolio, anche se i lubrificanti a base di silicio funzionano altrettanto bene. Successivamente, il blocco viene posizionato nella morsa.

Viene fissato al supporto macro e il blocco viene avanzato verso la lama. La prima sezione espone la superficie di taglio e orienta il campione. Deve essere scartata.

La macinazione è un processo lento e non deve essere affrettata. È necessario garantire un'adeguata lubrificazione durante la macinazione della sezione. Successivamente, questa viene posizionata su un vetrino.

È possibile pulirla e lucidarla secondo necessità. La sezione ha la tendenza ad arricciarsi, quindi si consiglia di posizionare una parte di un sacchetto per panini sopra di essa e mantenerla piatta, con un altro vetrino fissato al suo posto.

Viene quindi posto in un incubatrice a una temperatura compresa tra 60 e 80 gradi Celsius per un'ora. Questo ammorbidisce un metacrilato e favorisce l'adesione del campione al vetrino in modo uniforme. Qui osserviamo un'immagine fluorescente composita di tre diversi fluorocromi iniettati a intervalli mensili.

Questo consente l'identificazione del sito di mineralizzazione in un preciso momento temporale. Le dosi e la preparazione di questi marcatori sono riportate nel testo. Il microtermine fornisce sezioni sottili, ideali per la microscopia ottica.

Si tratta di un processo tecnicamente complesso. Si consiglia di utilizzare un microtomo a slitta per la maggiore resistenza che offre nel tagliare questi blocchi duri. È possibile utilizzare diversi tipi di lame, inclusi quelli in carburo di tungsteno.

Tuttavia, si consiglia una lama in acciaio inossidabile poiché può essere affilata facilmente e frequentemente secondo necessità. La lama deve essere orientata in modo da formare un angolo di 45 gradi con il blocco. La densità della metacrilato è influenzata da molti fattori, tra cui l'umidità ambiente della stanza.

Il blocco deve quindi essere conservato su una superficie disidratata. L'ammorbidimento può essere ottenuto applicando un foglio di carta bagnata sul blocco, se necessario; potrebbero essere necessarie diverse sezioni per raggiungere le condizioni di taglio ottimali per ottenere una sezione di qualità. Ancora una volta, il sacchetto sottovuoto e il vetrino aggiuntivo vengono serrati per appiattire la sezione prima di posizionarla nell'incubatrice.

La colorazione è simile a quella dell'istologia standard con inclusione in paraffina, tranne per il fatto che ovviamente non è richiesta la paraffinatura. I coloranti comunemente utilizzati per l'osso includono VSA con controstain alla safranina, safranina, verde brillante ol, e masson tricromica. Il protocollo per questi è indicato nel testo.

I reagenti vengono selezionati e filtrati prima dell'uso. Golden. La colorazione è spesso utilizzata per l'optometria istologica. Raccomandiamo di ottimizzare le colorazioni prima su vetrini di prova.

Dopo ogni passaggio, il vetrino può essere osservato al microscopio per verificare le colorazioni corrette. Ciò permette di determinare i tempi appropriati per ciascun colorante. Una volta ottimizzato lo standard di colorazione, tutti i vetrini dell'esperimento vengono colorati contemporaneamente in una rack seguendo lo stesso protocollo, per evitare che variabilità nella colorazione influisca sulla sua geometria termica.

I vetrini verranno quindi coperti in modo standard. Vi auguriamo buona fortuna con il vostro esperimento.