Name: Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Scopri come isolare i neutrofili dal sangue umano e stimolarli per generare trappole extracellulari (NETs), visualizzabili con microscopia a immunofluorescenza ed elettronica. Questo metodo avanzato consente di studiare i meccanismi di difesa immunitaria contro i patogeni.

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1. Isolamento PMN dal sangue umano Utilizzare circa 24 ml di sangue umano con EDTA o eparina (10 U / ml) come anticoagulante. <ol><li> Aggiungere 6 ml HISTOPAQUE 1119 in una provetta da 15 ml Falcon e con attenzione strato di 5-7 ml di sangue intero in cima. </li><li> Centrifugare per 20 minuti a 800 xg senza frenare. </li><li> Aspirare e scartare giallastro e chiaro strato superiore e di trasferimento inferiore fase rossiccio contenenti granulociti in fresco tubi Falcon. </li><li> Lavare le cellule compilando i tubi Falcon con PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 x g. </li><li> Nel frattempo preparare una soluzione Percoll al 100%, mescolando 18 ml Percoll con 2 ml di PBS 10x. Con 1x PBS preparare 4 soluzioni ml di 85%, 80%, 75%, 70% e 65% Percoll. </li><li> Preparare 2 tubi Falcon con un gradiente di Percoll stratificando 2 ml di ogni percentuale sopra l&#39;altro in ordine decrescente. </li><li> Dopo la centrifugazione eliminare il surnatante, combinare pellet e risospendere le cellule sedimentate in 4 ml di PBS. </li><li> Con attenzione il livello 2 ml di risospensione su ognuno dei gradienti. </li><li> Centrifugare per 20 minuti a 800 xg senza frenare. </li><li> Dopo la centrifugazione rimuovere strato superiore e la maggior parte del 65%-strato con PBMC e raccogliere bianco interfasi rimanente fino a 85%-strato in nuovi tubi Falcon. </li><li> Lavare le cellule riempiendo i tubi Falcon con PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 x g. </li><li> Rimuovere le cellule sedimentate surnatante e risospendere (di solito&gt; 95% sono PMN) in 2 ml di PBS. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol> 2. Attivazione di PMN <ol><li> Preparare un 24-pozzetti coltura cellulare mettendo una sterile 13 millimetri rotonda scivolare coperchio in vetro (# 1,5) in ciascun pozzetto </li><li> Semi di 2 x 10 5 cellule in 500μl RPMI (contenente 2% albumina sierica umana) per bene e incubare per 1h di CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Nel frattempo preparare una soluzione di 600 nM PMA in RPMI e aggiungere 100μl di cellule per pozzetto. Incubare da 15 minuti fino a 4 ore di CO 2 incubatore a 37 ° C. </li><li> Fissare le cellule nel 4% (concentrazione finale) paraformaldeide sciolto in PBS. </li></ol> PMA funge da controllo positivo e fino ad ora è l&#39;agente più potente per indurre la formazione di NET. In alternativa, altri stimoli o co-coltivazione con agenti patogeni possono essere utilizzati per l&#39;induzione NET. Lo stato della formazione rispettivi NET possono essere controllate, mentre il periodo di tempo sta procedendo, se ulteriori campioni paralleli sono preparati. Se un non-permeanti colorante DNA come Sytox verde (Invitrogen) si aggiunge alla non fisse celle, solo il DNA extracellulare verrà rilevato. Poiché la formazione di nuove reti è in qualche modo compromessa in presenza di Sytox, per ogni punto volta un campione parallelo deve essere utilizzato. 3. Rilevamento NET immunomarcatura NET sono molto fragili, anche dopo la fissazione e devono essere manipolati con grande cura, altrimenti la maggioranza si perde durante la preparazione. <ol><li> Rimuovere con attenzione scivola copertura in vetro con celle collegate dal 24-pozzetti cultura sollevandola al margine con un ago curvo e afferrare con una pinza sottile. Mettere il coperchio scivolare a testa in giù su una goccia di PBS. Questo può essere fatto su un foglio Parafilm che copre uno stand provetta. Lavare così 3 volte per 5 min. </li><li> Incubare i vetrini coprioggetto nello stesso modo in un calo dello 0,5% Triton X-100 per 1 min a RT al permeabilize cellule. Lavare 3 volte in PBS per 1 min. </li><li> Preparare una camera umida con Parafilm e un panno bagnato. Posare il coperchio scivola a testa in giù su una goccia di tampone di bloccaggio (5% asino siero) e incubare per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Diluire gli anticorpi primari, ad esempio ms contro Histon e rb contro elastasi neutrofila, nel tampone di bloccaggio. </li><li> Trasferimento di copertura scivola nella camera umida direttamente dal tampone di bloccaggio su una goccia di anticorpo primario e incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS. </li><li> Diluire anticorpi secondari, ad esempio dk contro ms Cy2 e dk contro rb Cy3, nel tampone di bloccaggio. </li><li> Trasferimento coprire scivola nella camera umida su una goccia di anticorpo secondario e incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS. A seconda delle opzioni di microscopia a fluorescenza, il DNA macchia per 5 minuti sia con Hoechst 33342 (1 mg / ml) che necessitano di eccitazione UV o con Draq5 per l&#39;eccitazione lontano rosso e lavare due volte con dist. acqua. </li><li> Impostare una goccia di 20μl Mowiol su un vetrino coprioggetto e montare con le cellule a testa in giù. Le cellule devono essere tra il vetrino e la diapositiva. La goccia di Mowiol formerà un sottile strato di spessore omogeneo in cui la polizza di copertura è posizionato sulla goccia. Normalmente, non c&#39;è bisogno di premere il campione. Se si desidera utilizzare non immersione lenti, il campione è pronto per l&#39;ispezione.Per l&#39;analisi microscopica con lenti ad immersione, lasciare che il campione secco per circa 1 ora fino a quando il Mowiol è solidificato al bordo del campione. </li></ol> 4. NET preparazione per microscopia elettronica a scansione (SEM) <ol><li> Messaggio fissare le cellule sul vetrino coprioggetto di vetro a 24-pozzetti con il 2,5% glutaraldeide. </li><li> Rimuovere i vetrini coprioggetto di vetro contenenti cellule dal 24-pozzetti cultura e messo a testa in giù su una goccia d&#39;acqua. Lavare così 3 volte per 5 min. </li><li> Trasferimento scivola coperchio posteriore in 24 pozzetti di coltura cellulare contenente 0,5% OsO4 e incubare per 30 min. </li><li> Rimuovere i vetrini coprioggetto di vetro contenenti cellule dal 24-pozzetti cultura e messo a testa in giù su una goccia d&#39;acqua. Lavare così 3 volte per 5 min. </li><li> Trasferimento scivola coperchio posteriore in 24 pozzetti di coltura cellulare contenente 1% di acido tannico e incubare per 30 min. </li><li> Ripetere i passaggi 4,2-4,4 </li><li> Disidratare attraverso il seguente schema posologico (5 minuti ciascuno): <ul><li> 30% di etanolo </li><li> Etanolo al 50% </li><li> Etanolo al 70% </li><li> 80% di etanolo </li><li> 90% di etanolo </li><li> 100% di etanolo </li><li> 100% di etanolo </li><li> 100% di etanolo </li></ul></li><li> Trasferimento di copertura scivola in asciugatrice punto critico e campioni secchi. </li><li> Superficie mano di campione con 5nm platino / carbonio con evaporatore strato sottile strato </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Il metodo di isolamento produce di solito non stimolate neutrofili vitali con una purezza superiore al 95%. Quando fisso in diversi momenti dopo la stimolazione, il protocollo immunostaining mostra la sequenza di cambiamenti morfologici delle cellule durante NETosis appiattimento, la perdita di lobuli nucleare, la perdita di granulo e l&#39;integrità nucleo che porta ad un crescente sovrapposizione di nucleare (cioè gli istoni) e granulare (cioè neutrofila) colorazione. Questo protocollo può servire come punto di partenza per analizzare le interazioni degli agenti patogeni specifici con neutrofili. Questa interazione può essere sezionato in maggior dettaglio utilizzando il protocollo di preparazione per la microscopia elettronica a scansione. NET fluorescenza Esempio di neutrofili stimolati colorate per NET (blu = DNA, rosso = istone, verde = neutrofila). Le immagini mostrano, oltre alla localizzazione NET, la localizzazione nucleare del DNA e istoni e il modello granulare per l&#39;elastasi neutrofila. SEM PMA stimolazione Scansione al microscopio elettronico che mostra non neutrofili stimolati e PMA-stimolata. Dopo la stimolazione, i neutrofili appiattirsi e produrre NET. NET SEM e Shigella Maggiore risoluzione dell&#39;immagine SEM del batterio Shigella intrappolati nelle reti.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

Il protocollo deve essere tale che l&#39;isolamento di non neutrofili stimolati a notevole purezza, l&#39;induzione della formazione del NET e l&#39;analisi dei cambiamenti morfologici durante NETosis. Quando si maneggiano i campioni con cura, evitando cioè dure condizioni di lavaggio che comporta la perdita di gran parte delle reti debolmente attaccato, la quantità di formazione NET in condizioni di stimolazione differenti (durata, stimolo) possono essere confrontati. A questo proposito, i protocolli previsti può servire come punto di partenza per stabilire i metodi per analizzare gli scenari più sofisticati: le interazioni neutrofili / patogeno, sequenza di stimoli, interazione con altre cellule immunitarie.

neutrofili trappole extracellulare: come generare e poterle visualizzare

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Granulociti neutrofili sono il gruppo più abbondante di leucociti nel sangue periferico. Come fagociti professionali, fagocitare i batteri e li uccidono intracellulare quando la loro miccia antimicrobica granuli con la phagosome. Abbiamo scoperto che i neutrofili sono un ulteriore modo di uccidere i microorganismi: al momento dell&#39;attivazione, rilasciano le proteine ​​dei granuli e cromatina che insieme formano le fibre extracellulari che legano gli agenti patogeni. Queste nuove strutture, o neutrofili Trappole extracellulare (NET), degradano fattori di virulenza e di uccidere i batteri 1, 2 e funghi parassiti 3. La spina dorsale strutturale del NET è il DNA, e sono rapidamente degradati in presenza di DNasi. Così, i batteri che esprimono DNasi sono più virulenti 4. Utilizzando la microscopia correlativa combinando TEM, SEM, immunofluorescenza e vivere tecniche di imaging cellulare, abbiamo potuto dimostrare che dopo la stimolazione, i nuclei di neutrofili perdono la loro forma e la eu-eterocromatina e omogeneizzare. Più tardi, l&#39;involucro nucleare e le membrane dei granuli disintegrano permettendo la miscelazione dei componenti NET. Infine, le reti sono rilasciati come rompe la membrana cellulare. Questo programma di morte cellulare (NETosis) è distinto da apoptosi e necrosi e dipende dalla generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno da NADPH ossidasi 5. Neutrofili trappole extracellulare sono abbondanti nei siti di infiammazione acuta. NET sembrano essere una forma di risposta immunitaria innata che i microrganismi si legano, impediscono loro di diffondere e garantire una elevata concentrazione locale di agenti antimicrobici per degradare fattori di virulenza e uccidere gli agenti patogeni permettendo neutrofili per assolvere la loro funzione antimicrobica anche oltre la durata della loro vita. C&#39;è una crescente evidenza, tuttavia, che le reti sono anche coinvolti in malattie che vanno da auto-immune sindromi alla sterilità 6. Si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano periferico 7 e stimolarli a formare NET. Inoltre abbiamo incluso i protocolli per visualizzare le reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

I granulociti neutrofili rappresentano il gruppo più abbondante di leucociti nel sangue periferico. In qualità di fagociti professionali, essi inglobano i batteri e li eliminano...

I trappole extracellulari dei neutrofili, o NET, sono un meccanismo recentemente identificato per l'eliminazione dei patogeni mediata dai neutrofili, che rilasciano una combinazione di proteine citoplasmatiche e dei granuli, nonché cromatina, formando fibre extracellulari che intrappolano i patogeni. In questo video, i granulociti sono isolati dal sangue intero umano mediante centrifugazione su gradiente di densità istopat. I neutrofili sono isolati dalla preparazione di granulociti mediante gradiente per collare.Centrifugazione seminata su vetrino e stimolata a formare trappole extracellulari neutrofili (NET) mediante stimoli chimici o biologici, le cellule vengono quindi processate per l'etichettatura immunoistochimica o per microscopia elettronica al fine di visualizzare le NET. Ciao, sono Christian Gosman della struttura centrale di microscopia presso l'Istituto Max Plunk per la Biologia dell'Infezione. Oggi vi mostreremo un procedimento per purificare granulociti neutrofili dal sangue umano e stimolarli a generare trappole extracellulari neutrofili, o NET.Visualizzeremo quindi le reti mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a scansione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi che portano alla formazione delle reti e per analizzare le proprietà antimicrobiche delle reti. Cominciamo dunque.Iniziare questo protocollo in una cappa a flusso laminare preparando sei millilitri di histo 1119 in ciascuna di quattro provette Falcon da 15 millilitri. Stratificare con attenzione da cinque a sette millilitri di sangue intero sopra l'histo in ciascuna provetta da centrifuga per 20 minuti a circa 800 ×g, assicurandosi che la frenata sia disattivata una volta completata la centrifugazione. Rimuovere con cura le provette dalla centrifuga.Il tubo conterrà quattro strati ben separati dall'alto verso il basso. Questi sono uno strato rosso scuro contenente eritrociti, uno strato rosso chiaro contenente granulociti neutrofili con alcuni eritrociti, uno strato giallo biancastro contenente leucociti e siero, e uno strato giallo chiaro di siero.Di nuovo, lavorare nell'armadietto a flusso laminare. Utilizzare il peristaltico collegato a un sistema a vuoto per aspirare con attenzione lo strato giallo superiore. Quindi, utilizzando una pipetta, trasferire la fase rossiccia contenente i granulociti da ogni tubo in un nuovo tubo falcon.Successivamente, riempire i tubi con PBS per lavare i granulociti. Quindi, centrifugare per 10 minuti a circa 300 ×g mentre le cellule sono in rotazione. Preparare una soluzione al 100% per coll mescolando 18 millilitri di per co con 2 millilitri di PBS 10 volte concentrato.Quindi utilizzare la soluzione al 100% per coll e PBS una volta per preparare quattro millilitri ciascuna delle concentrazioni 65, 70, 75, 80 e 85% per call. Utilizzare queste soluzioni per preparare gradienti per core sovrapponendo con attenzione due millilitri di ciascuna soluzione in ciascuna di due provette. Iniziare versando due millilitri della soluzione all'85% in ciascuna provetta.Quindi, sopra il 85% per coll, stratificare con attenzione due millilitri dell'80% per co. Continuare a stratificare due millilitri di ogni soluzione in ordine decrescente, in modo che la soluzione al 65% venga posta in cima. Rimuovere i leucociti sedimentati dalla centrifuga sotto la cappa.Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Successivamente, combinare le cellule risospese in una provetta pulita. Stratificare con attenzione due millilitri delle granulociti risospesi su ciascuno dei gradienti di percol.Quindi centrifugare per 20 minuti a circa 800 ×g, assicurandosi che la decelerazione sia disattivata al termine della centrifugazione. Le interfacce dovrebbero essere chiaramente visibili a causa della maggiore densità cellulare. Eliminare il livello superiore e la maggior parte del livello al 65%, che contengono cellule mononucleate del sangue periferico o pBMC.Raccogliere l'interfaccia 65%-70% insieme all'interfaccia 70%-75% e 80%-85% da ciascun gradiente e trasferirla in nuove provette falcon. Lavare le cellule riempiendo la provetta con PBS e centrifugare per 10 minuti a circa 300 ×g per formare il pellet cellulare dopo la centrifugazione. Rimuovere il sopranatante e risospendere i leucociti polimorfonucleati o PMN sedimentati in due millilitri di PBS.A questo punto, il 95% o più delle cellule nel preparato saranno mns. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule, quindi aggiungere 200.000 cellule in 500 microlitri di RPMI su coprioggetti rotondi sterili posizionati in piastre colturali con pozzetti di dimensione 15 millimetri. Incubare per un'ora in un incubatore con 5% di CO2 a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire ai coprioggetti dopo un'ora.Aggiungere 100 microlitri di RPMI contenente lo stimolante desiderato. Per un esperimento in corso temporale, aggiungere lo stimolante in modo sequenziale, iniziando dal tempo di stimolazione più lungo per ciascun punto temporale condizionale. Assicurarsi di preparare un controllo positivo aggiungendo 600 nano molari di PMA in RPMI.Inoltre, per ogni condizione o punto temporale, preparare un controllo negativo aggiungendo solo RPMI, incubare fino a quattro ore in un incubatore con anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Durante la stimolazione, la formazione di reti può essere monitorata mediante microscopia in campo chiaro. Poco dopo la stimolazione, i nuclei modificano drasticamente la loro forma. Perdono la loro rotondità, quindi si espandono al punto temporale desiderato con 600 microlitri di soluzione di paraformaldeide all'8% a temperatura ambiente in ogni pozzetto.Per portare la concentrazione finale al 4%, incubare per due-quattro ore per l'etichettatura immuno. Posizionare un foglio di paraformaldeide su un rack per provette con tre volte otto fori di circa 15 millimetri di diametro. Per formare dei pozzetti, riempire i pozzetti con PBS.Utilizzare un ago curvo per sollevare ciascun vetrino dal paraformaldeide nella piastra di coltura. Quindi, con una pinzetta, afferrare il vetrino e capovolgerlo sulla superficie di una goccia di PBS sul paraform. A questo punto, le trappole extracellulari dei neutrofili sono molto fragili e si deve prestare la massima attenzione durante le manipolazioni per evitare la perdita cellulare.Dopo cinque minuti, ripetere il lavaggio trasferendo i coprivetri in nuove gocce di PBS. Ripetere per un totale di tre lavaggi. Successivamente, trasferire i coprivetri in una goccia di Triton X-100 0,5% a temperatura ambiente per un minuto per permeabilizzare le cellule.Quindi lavare tre volte in PBS per un minuto ciascuna dopo il lavaggio. Procedere con la colorazione seguendo il protocollo scritto allegato. Eseguire ciascuna delle incubazioni e dei passaggi di lavaggio capovolgendo il coprislitta sul paraform.Dopo aver colorato le cellule, posizionare una goccia di 20 microlitri di MO su un vetrino e applicare i coprioggetti con la faccia verso il basso, in modo che le cellule si trovino tra il coprioggetto e il vetrino. Dopo un'ora, il MOY dovrebbe essersi solidificato e le cellule saranno pronte per l'analisi al microscopio. Utilizzando obiettivi a immersione, preparare le cellule per la microscopia elettronica a scansione sotto una cappa chimica.Fissare le cellule sui vetrini di vetro in una piastra a 24 pozzetti con glutaraldeide al 2,5% in PBS per 30 minuti. Durante l'incubazione, posizionare un foglio di paraform su un tubo di prova. Disporre con tre file di otto fori ciascuna di circa 15 millimetri di diametro.Per formare i pozzetti. Riempire i pozzetti con acqua distillata. Utilizzare un ago curvo per sollevare ciascun coprioggetto dalla soluzione di glutaraldeide.Quindi, utilizzando una pinzetta, afferrare il vetrino coprioggetto e trasferirlo in una goccia di acqua distillata sul Paraform, spostando i vetrini coprioggetto in gocce di acqua distillata sul Paraform. Ripetere per un totale di tre lavaggi, di cinque minuti ciascuno; trasferire nuovamente i vetrini coprioggetto nei pozzetti della piastra per colture cellulari contenenti tetroxido di osmio allo 0,5% in acqua distillata e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i vetrini coprioggetto dalla piastra e lavarli tre volte in acqua distillata come in precedenza.Quindi rimetterli nella piastra a 24 pozzetti con 0,5 millilitri di acido tannico all'1% in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti. Successivamente, lavare le lamelle tre volte, per cinque minuti ciascuna. Poi ripetere la fissazione con tetroxido di osmio e il lavaggio.Successivamente, coprire il tubo da provetta con un nuovo pezzo di parafilm. Disidratare le cellule mediante una serie di incubazioni nelle seguenti soluzioni di etanolo per cinque minuti ciascuna: 30, 50, 70, 80, 9100, 100.E infine, un'ultima volta in etanolo al 100%. Immergere il supporto in una bacinella per campioni riempita di etanolo. Posizionare rapidamente i coprioggetti nel supporto metallico, assicurandosi che i campioni non si secchino.Quindi trasferire la barchetta del campione in un essiccatore a punto critico (CPD) refrigerato. Riempire la camera del CPD con CO2 liquida. Lasciare completamente aperta la valvola di ingresso per mantenere il livello del liquido e, non appena si osserva una fase di etanolo sotto la fase di CO2 nella parte inferiore della camera, aprire la valvola di scarico posta in basso.Per rimuovere la maggior parte dell'etanolo. Lasciare aerare la camera per circa 30 minuti. Dopo l'aerazione, chiudere la valvola di ingresso e abbassare il livello del liquido appena sotto la parte superiore della barca.Fare scorrere acqua calda attraverso la giacca del CPD. Quando la temperatura raggiunge i 36-38 gradi Celsius e la pressione aumenta fino a 1.200 libbre per pollice quadrato, la linea di separazione tra liquido e gas scomparirà e i campioni si troveranno al di sopra del punto critico. Una volta raggiunto il punto critico, sfiatare lentamente il gas in un periodo di cinque minuti.Per evitare la condensa, la temperatura deve rimanere intorno ai 40 gradi Celsius. In questo periodo, aprire lo sportello ed estrarre la barchetta. Verificare che il solvente disidratante sia evaporato.Applicare i coprioggetti, con il lato dritto rivolto verso l'alto, sull'adesivo del portacampioni in alluminio e trasferirli nel sistema di rivestimento ad alta risoluzione. Portare il cilindro di rivestimento sotto vuoto fino a due volte 10 alla meno cinque millibar. Impostare quindi lo strumento a 1,8 chilovolt e 70 milliampere e monitorare lo spessore dello strato di carbonio platon mediante un cristallo al quarzo fino al raggiungimento di cinque nanometri.Sfiatare il cilindro di rivestimento del sistema di rivestimento ad alta risoluzione. Quindi, utilizzando pinzette, rimuovere i campioni dal coter. Riportare la camera del microscopio elettronico a scansione alla pressione normale.Aprire la porta. Inserire quindi i campioni nel portacampioni ed evacuare la camera. Per l'analisi SEM.Quando vengono fissati in diversi momenti successivi alla stimolazione, i cambiamenti morfologici durante la NETosi possono essere osservati mediante microscopia a fluorescenza. In questa figura, il DNA è mostrato in blu nel complesso con l'istone. Il DNA è mostrato in rosso e l'elastasi dei neutrofili.Un marcatore dei granuli è mostrato in verde durante la prima fase della NETosi; in nuclei condensati, si osserva solo alla periferia nucleare. Successivamente, quando la cromatina è più descondensata, la maggior parte del nucleo è colorata nelle reti descondensate. La colorazione è omogenea.Questo insieme di immagini illustra l'overlap tra la colorazione nucleare e granulare che si verifica durante la NETosi. Questa microfotografia ottenuta con microscopia elettronica a scansione mostra neutrofili non stimolati dopo stimolazione con il batterio Ella; i neutrofili si appiattiscono e producono trappole extracellulari neutrofiliche. Qui, un batterio gel è stato intrappolato nelle reti.I batteri, come quelli in forma di gel, vengono immobilizzati e uccisi dagli enzimi presenti nelle reti. Abbiamo appena mostrato come isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e stimolarli per indurre la formazione di trappole extracellulari neutrofili. Queste possono quindi essere ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza o microscopia elettronica a scansione.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le reti sono molto fragili anche dopo la fissazione. Per ridurre al minimo la perdita di reti, preleviamo le coprioggetti con i neutrofili stimolati dalle cavità della piastra e svolgiamo la maggior parte della procedura sulla superficie di gocce di tampone. Anche in questo caso, è fondamentale muovere i campioni delicatamente e lentamente.Ecco fatto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Immunologia e Infezioni

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Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.

Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Questo protocollo descrive un'analisi di trappola extracellulari del neutrofilo (NET) altamente sensibile e ad alto rendimento per la quantificazione semiautomatizzata di ex vivo NET formazione mediante microscopia confocale tridimensionale di immunofluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la formazione netta e degrado dopo stimoli diversi e può essere utilizzato per lo studio di potenziali terapie mirate al NET.

Un'analisi di High-throughput per valutare e quantificare la trappola extracellulari del neutrofilo formazione

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l'etichettatura dei componenti NET.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Presentato qui è un protocollo per l'induzione e l'analisi di trappole extracellulari (NET) di neutrofili in vitro . La quantificazione del DNA, della catelicidina (LL37) e dell'attività enzimatica ha prodotto dati che mostrano la variabilità nella composizione e morfologia dei NET indotta da stimoli microbici e chimici in condizioni controllate simili.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Scopri come isolare i neutrofili dal sangue umano e stimolarli per generare trappole extracellulari (NETs), visualizzabili con microscopia a immunofluorescenza ed elettronica. Questo metodo avanzato consente di studiare i meccanismi di difesa immunitaria contro i patogeni.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

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