Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

I trappole extracellulari dei neutrofili, o NET, sono un meccanismo recentemente identificato per l'eliminazione dei patogeni mediata dai neutrofili, che rilasciano una combinazione di proteine citoplasmatiche e dei granuli, nonché cromatina, formando fibre extracellulari che intrappolano i patogeni. In questo video, i granulociti sono isolati dal sangue intero umano mediante centrifugazione su gradiente di densità istopat. I neutrofili sono isolati dalla preparazione di granulociti mediante gradiente per collare.

Centrifugazione seminata su vetrino e stimolata a formare trappole extracellulari neutrofili (NET) mediante stimoli chimici o biologici, le cellule vengono quindi processate per l'etichettatura immunoistochimica o per microscopia elettronica al fine di visualizzare le NET. Ciao, sono Christian Gosman della struttura centrale di microscopia presso l'Istituto Max Plunk per la Biologia dell'Infezione. Oggi vi mostreremo un procedimento per purificare granulociti neutrofili dal sangue umano e stimolarli a generare trappole extracellulari neutrofili, o NET.

Visualizzeremo quindi le reti mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a scansione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi che portano alla formazione delle reti e per analizzare le proprietà antimicrobiche delle reti. Cominciamo dunque.

Iniziare questo protocollo in una cappa a flusso laminare preparando sei millilitri di histo 1119 in ciascuna di quattro provette Falcon da 15 millilitri. Stratificare con attenzione da cinque a sette millilitri di sangue intero sopra l'histo in ciascuna provetta da centrifuga per 20 minuti a circa 800 ×g, assicurandosi che la frenata sia disattivata una volta completata la centrifugazione. Rimuovere con cura le provette dalla centrifuga.

Il tubo conterrà quattro strati ben separati dall'alto verso il basso. Questi sono uno strato rosso scuro contenente eritrociti, uno strato rosso chiaro contenente granulociti neutrofili con alcuni eritrociti, uno strato giallo biancastro contenente leucociti e siero, e uno strato giallo chiaro di siero.

Di nuovo, lavorare nell'armadietto a flusso laminare. Utilizzare il peristaltico collegato a un sistema a vuoto per aspirare con attenzione lo strato giallo superiore. Quindi, utilizzando una pipetta, trasferire la fase rossiccia contenente i granulociti da ogni tubo in un nuovo tubo falcon.

Successivamente, riempire i tubi con PBS per lavare i granulociti. Quindi, centrifugare per 10 minuti a circa 300 ×g mentre le cellule sono in rotazione. Preparare una soluzione al 100% per coll mescolando 18 millilitri di per co con 2 millilitri di PBS 10 volte concentrato.

Quindi utilizzare la soluzione al 100% per coll e PBS una volta per preparare quattro millilitri ciascuna delle concentrazioni 65, 70, 75, 80 e 85% per call. Utilizzare queste soluzioni per preparare gradienti per core sovrapponendo con attenzione due millilitri di ciascuna soluzione in ciascuna di due provette. Iniziare versando due millilitri della soluzione all'85% in ciascuna provetta.

Quindi, sopra il 85% per coll, stratificare con attenzione due millilitri dell'80% per co. Continuare a stratificare due millilitri di ogni soluzione in ordine decrescente, in modo che la soluzione al 65% venga posta in cima. Rimuovere i leucociti sedimentati dalla centrifuga sotto la cappa.

Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS. Successivamente, combinare le cellule risospese in una provetta pulita. Stratificare con attenzione due millilitri delle granulociti risospesi su ciascuno dei gradienti di percol.

Quindi centrifugare per 20 minuti a circa 800 ×g, assicurandosi che la decelerazione sia disattivata al termine della centrifugazione. Le interfacce dovrebbero essere chiaramente visibili a causa della maggiore densità cellulare. Eliminare il livello superiore e la maggior parte del livello al 65%, che contengono cellule mononucleate del sangue periferico o pBMC.

Raccogliere l'interfaccia 65%-70% insieme all'interfaccia 70%-75% e 80%-85% da ciascun gradiente e trasferirla in nuove provette falcon. Lavare le cellule riempiendo la provetta con PBS e centrifugare per 10 minuti a circa 300 ×g per formare il pellet cellulare dopo la centrifugazione. Rimuovere il sopranatante e risospendere i leucociti polimorfonucleati o PMN sedimentati in due millilitri di PBS.

A questo punto, il 95% o più delle cellule nel preparato saranno mns. Utilizzando un emocitometro, determinare il numero di cellule, quindi aggiungere 200.000 cellule in 500 microlitri di RPMI su coprioggetti rotondi sterili posizionati in piastre colturali con pozzetti di dimensione 15 millimetri. Incubare per un'ora in un incubatore con 5% di CO2 a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire ai coprioggetti dopo un'ora.

Aggiungere 100 microlitri di RPMI contenente lo stimolante desiderato. Per un esperimento in corso temporale, aggiungere lo stimolante in modo sequenziale, iniziando dal tempo di stimolazione più lungo per ciascun punto temporale condizionale. Assicurarsi di preparare un controllo positivo aggiungendo 600 nano molari di PMA in RPMI.

Inoltre, per ogni condizione o punto temporale, preparare un controllo negativo aggiungendo solo RPMI, incubare fino a quattro ore in un incubatore con anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Durante la stimolazione, la formazione di reti può essere monitorata mediante microscopia in campo chiaro. Poco dopo la stimolazione, i nuclei modificano drasticamente la loro forma. Perdono la loro rotondità, quindi si espandono al punto temporale desiderato con 600 microlitri di soluzione di paraformaldeide all'8% a temperatura ambiente in ogni pozzetto.

Per portare la concentrazione finale al 4%, incubare per due-quattro ore per l'etichettatura immuno. Posizionare un foglio di paraformaldeide su un rack per provette con tre volte otto fori di circa 15 millimetri di diametro. Per formare dei pozzetti, riempire i pozzetti con PBS.

Utilizzare un ago curvo per sollevare ciascun vetrino dal paraformaldeide nella piastra di coltura. Quindi, con una pinzetta, afferrare il vetrino e capovolgerlo sulla superficie di una goccia di PBS sul paraform. A questo punto, le trappole extracellulari dei neutrofili sono molto fragili e si deve prestare la massima attenzione durante le manipolazioni per evitare la perdita cellulare.

Dopo cinque minuti, ripetere il lavaggio trasferendo i coprivetri in nuove gocce di PBS. Ripetere per un totale di tre lavaggi. Successivamente, trasferire i coprivetri in una goccia di Triton X-100 0,5% a temperatura ambiente per un minuto per permeabilizzare le cellule.

Quindi lavare tre volte in PBS per un minuto ciascuna dopo il lavaggio. Procedere con la colorazione seguendo il protocollo scritto allegato. Eseguire ciascuna delle incubazioni e dei passaggi di lavaggio capovolgendo il coprislitta sul paraform.

Dopo aver colorato le cellule, posizionare una goccia di 20 microlitri di MO su un vetrino e applicare i coprioggetti con la faccia verso il basso, in modo che le cellule si trovino tra il coprioggetto e il vetrino. Dopo un'ora, il MOY dovrebbe essersi solidificato e le cellule saranno pronte per l'analisi al microscopio. Utilizzando obiettivi a immersione, preparare le cellule per la microscopia elettronica a scansione sotto una cappa chimica.

Fissare le cellule sui vetrini di vetro in una piastra a 24 pozzetti con glutaraldeide al 2,5% in PBS per 30 minuti. Durante l'incubazione, posizionare un foglio di paraform su un tubo di prova. Disporre con tre file di otto fori ciascuna di circa 15 millimetri di diametro.

Per formare i pozzetti. Riempire i pozzetti con acqua distillata. Utilizzare un ago curvo per sollevare ciascun coprioggetto dalla soluzione di glutaraldeide.

Quindi, utilizzando una pinzetta, afferrare il vetrino coprioggetto e trasferirlo in una goccia di acqua distillata sul Paraform, spostando i vetrini coprioggetto in gocce di acqua distillata sul Paraform. Ripetere per un totale di tre lavaggi, di cinque minuti ciascuno; trasferire nuovamente i vetrini coprioggetto nei pozzetti della piastra per colture cellulari contenenti tetroxido di osmio allo 0,5% in acqua distillata e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i vetrini coprioggetto dalla piastra e lavarli tre volte in acqua distillata come in precedenza.

Quindi rimetterli nella piastra a 24 pozzetti con 0,5 millilitri di acido tannico all'1% in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti. Successivamente, lavare le lamelle tre volte, per cinque minuti ciascuna. Poi ripetere la fissazione con tetroxido di osmio e il lavaggio.

Successivamente, coprire il tubo da provetta con un nuovo pezzo di parafilm. Disidratare le cellule mediante una serie di incubazioni nelle seguenti soluzioni di etanolo per cinque minuti ciascuna: 30, 50, 70, 80, 9100, 100.

E infine, un'ultima volta in etanolo al 100%. Immergere il supporto in una bacinella per campioni riempita di etanolo. Posizionare rapidamente i coprioggetti nel supporto metallico, assicurandosi che i campioni non si secchino.

Quindi trasferire la barchetta del campione in un essiccatore a punto critico (CPD) refrigerato. Riempire la camera del CPD con CO2 liquida. Lasciare completamente aperta la valvola di ingresso per mantenere il livello del liquido e, non appena si osserva una fase di etanolo sotto la fase di CO2 nella parte inferiore della camera, aprire la valvola di scarico posta in basso.

Per rimuovere la maggior parte dell'etanolo. Lasciare aerare la camera per circa 30 minuti. Dopo l'aerazione, chiudere la valvola di ingresso e abbassare il livello del liquido appena sotto la parte superiore della barca.

Fare scorrere acqua calda attraverso la giacca del CPD. Quando la temperatura raggiunge i 36-38 gradi Celsius e la pressione aumenta fino a 1.200 libbre per pollice quadrato, la linea di separazione tra liquido e gas scomparirà e i campioni si troveranno al di sopra del punto critico. Una volta raggiunto il punto critico, sfiatare lentamente il gas in un periodo di cinque minuti.

Per evitare la condensa, la temperatura deve rimanere intorno ai 40 gradi Celsius. In questo periodo, aprire lo sportello ed estrarre la barchetta. Verificare che il solvente disidratante sia evaporato.

Applicare i coprioggetti, con il lato dritto rivolto verso l'alto, sull'adesivo del portacampioni in alluminio e trasferirli nel sistema di rivestimento ad alta risoluzione. Portare il cilindro di rivestimento sotto vuoto fino a due volte 10 alla meno cinque millibar. Impostare quindi lo strumento a 1,8 chilovolt e 70 milliampere e monitorare lo spessore dello strato di carbonio platon mediante un cristallo al quarzo fino al raggiungimento di cinque nanometri.

Sfiatare il cilindro di rivestimento del sistema di rivestimento ad alta risoluzione. Quindi, utilizzando pinzette, rimuovere i campioni dal coter. Riportare la camera del microscopio elettronico a scansione alla pressione normale.

Aprire la porta. Inserire quindi i campioni nel portacampioni ed evacuare la camera. Per l'analisi SEM.

Quando vengono fissati in diversi momenti successivi alla stimolazione, i cambiamenti morfologici durante la NETosi possono essere osservati mediante microscopia a fluorescenza. In questa figura, il DNA è mostrato in blu nel complesso con l'istone. Il DNA è mostrato in rosso e l'elastasi dei neutrofili.

Un marcatore dei granuli è mostrato in verde durante la prima fase della NETosi; in nuclei condensati, si osserva solo alla periferia nucleare. Successivamente, quando la cromatina è più descondensata, la maggior parte del nucleo è colorata nelle reti descondensate. La colorazione è omogenea.

Questo insieme di immagini illustra l'overlap tra la colorazione nucleare e granulare che si verifica durante la NETosi. Questa microfotografia ottenuta con microscopia elettronica a scansione mostra neutrofili non stimolati dopo stimolazione con il batterio Ella; i neutrofili si appiattiscono e producono trappole extracellulari neutrofiliche. Qui, un batterio gel è stato intrappolato nelle reti.

I batteri, come quelli in forma di gel, vengono immobilizzati e uccisi dagli enzimi presenti nelle reti. Abbiamo appena mostrato come isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e stimolarli per indurre la formazione di trappole extracellulari neutrofili. Queste possono quindi essere ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza o microscopia elettronica a scansione.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che le reti sono molto fragili anche dopo la fissazione. Per ridurre al minimo la perdita di reti, preleviamo le coprioggetti con i neutrofili stimolati dalle cavità della piastra e svolgiamo la maggior parte della procedura sulla superficie di gocce di tampone. Anche in questo caso, è fondamentale muovere i campioni delicatamente e lentamente.

Ecco fatto. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.