Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Per osservare il comportamento di singole cellule in vivo, viene iniettato negli embrioni di pesce zebra un DNA plasmidico contenente un promotore specifico per cellula che guida l'espressione di una floroforo quattro o di un biosensore. I cambiamenti dinamici nell'effetto e nella distribuzione vengono visualizzati in vivo utilizzando un biosensore basato sul dominio di legame F e sulla utrofina. Embrioni appena fecondati vengono allineati lungo la lamella per iniezione e posizionati nell'angolo formato tra la lamella superiore e quella inferiore.

Il DNA che codifica per fluorofori o biosensori viene iniettato nella cellula. Il giorno successivo, gli embrioni vengono montati in aros.

Sul vetrino per l'analisi, gli embrioni vengono posizionati con le cellule marcate rivolte verso il basso e la camera viene sigillata con un coprioggetto. Ciao, sono Erica Anderson del laboratorio di Mary Hallin e dei dipartimenti di Zoologia e Anatomia dell'Università del Wisconsin Madison. Sono Nam Tauri, anch'io del laboratorio Hallin.

E io sono Matt Clay del laboratorio di Hallin. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'immagine in tempo reale di cellule singolarmente marcate in embrioni di pesce zebra. Utilizziamo questo procedimento in laboratorio per studiare la motilità cellulare e la dinamica dell'actina durante la crescita degli assoni e la migrazione delle cellule della cresta neurale.

Iniziamo. Per assemblare le lamelle per iniezione, preparare innanzitutto l'elastomero di silicone cyl guard seguendo le istruzioni del produttore. Mescolare 10 parti della base dell'elastomero con una parte di agente indurente.

Utilizzare il cilindro di protezione per unire insieme tre normali vetrini da microscopio in vetro. Disporre due vetrini uno accanto all'altro lungo i bordi lunghi. Applicare l'ARD sul terzo vetrino e posizionarlo sopra gli altri due vetrini.

Utilizzare una quantità minima di sigillo per vetrini in modo da sigillare i vetrini senza eccessi che fuoriescono tra i vetrini. Eventuali eccessi possono essere rimossi il giorno seguente con una lametta. Lasciare indurire la protezione SIL durante la notte prima dell'acquisizione delle immagini sui vetrini.

Utilizziamo rettangoli in acciaio inossidabile ritagliati delle stesse dimensioni di un vetrino microscopico standard, con un foro centrale di 1,5 centimetri. Un cover slip quadrato da 22 millimetri è fissato al rettangolo di acciaio con Sylgard. Sia i vetrini per iniezione che quelli per imaging sono riutilizzabili e possono essere puliti tra un utilizzo e l'altro con etanolo al 70%, seguito da un risciacquo con acqua prima di iniettare gli embrioni.

Diluire il DNA fino a una concentrazione finale di 10-50 microgrammi per millilitro. DNA in acqua con 0,2% di rosso fenolo. Il rosso fenolo permette la visualizzazione durante l'iniezione.

Successivamente, riempire e calibrare l'ago. Riempire retrogradamente l'ago capillare apol con circa microlitri di soluzione di DNA. Attendere che l'ago si riempia, quindi inserirlo nel portaago dell'apparato di iniezione utilizzando pinzette fini.

Spezzare la punta dell'ago in modo che l'apertura della punta abbia un diametro di circa 10 micrometri. Misurare il diametro della goccia nell'olio minerale utilizzando un micrometro oculare. Per calcolare il volume di iniezione, regolare l'impostazione della durata sul pico spritzer.

Quindi il diametro della goccia è di 0,12 micrometri o circa un nanolitro in volume. Una durata di 10-30 millisecondi è tipica. Raccogliere embrioni allo stadio di una singola cellula nel mezzo E3 per embrioni e trasferire circa da 30 a 60 embrioni sul vetrino per iniezione.

Posizionare gli embrioni lungo il bordo del vetrino superiore e rimuovere la maggior parte dell'E three in modo che gli embrioni siano trattenuti al vetrino dalla tensione superficiale mediante un ago da dissezione piegato. Ruotare gli embrioni in modo che la cellula sia a contatto con la parete del vetrino per iniezione. Utilizzare un micromanipolatore per guidare l'ago attraverso la coriona dell'embrione, attraverso il tuorlo e all'interno della singola cellula dell'embrione.

Iniettare da 0,5 a un nanolitro di soluzione di DNA nella cellula. Trasferire gli embrioni iniettati in piastre di Petri in E3 e collocarli in un incubatore a 28,5 gradi Celsius. Se necessario, lo sviluppo può essere rallentato incubando gli embrioni a temperatura più bassa il giorno successivo all'iniezione.

Preparare gli embrioni per l'acquisizione delle immagini circa un'ora prima che raggiungano l'età desiderata per l'acquisizione. Rimuovere le COR dagli embrioni utilizzando pinzette fini. In genere iniziamo l'acquisizione degli embrioni a circa 14-17 ore dalla fecondazione.

Successivamente, selezionare gli embrioni con cellule marcate utilizzando un microscopio stereoscopico dotato di fluorescenza; utilizziamo un obiettivo Forex su un microscopio Nikon a Z 100 grazie alla combinazione di lunga distanza di lavoro e alta ingrandimento. Posizionare un embrione in una provetta microcentrifuga con circa 50 microlitri di V tre. Aggiungere il stock di trica e agarosio al 1% a basso punto di fusione per ottenere una concentrazione finale di trica dello 0,02% utilizzando una pipetta di vetro a punta larga.

Trasferire immediatamente l'embrione in una goccia di agro sulla lamellina della slide per imaging, prima che l'agro si indurisca; posizionare l'embrione in modo che la regione con le cellule marcate sia rivolta verso il basso, a contatto con la lamellina inferiore. Successivamente, assemblare la camera per imaging. Applicare da un lato un anello di plastica con grasso siliconico per vuoto e fissarlo al supporto metallico per imaging.

Applicare uno strato di grasso sulla faccia opposta dell'anello. Riempire la camera con E tre contenente 10 millimolari di heaps e 0,02% di Trica; sigillare la parte superiore della camera fissando un cover slip di 22 millimetri quadrati sulla superficie superiore ingrassata dell'anello. L'embrione è ora pronto per l'acquisizione di immagini in 4D, come verrà mostrato nella prossima sezione.

I dettagli dell'acquisizione delle immagini dipenderanno dalle caratteristiche specifiche del vostro sistema microscopico. Qui illustriamo il processo di acquisizione a intervalli per il microscopio confocale Olympus FB 1000. Consultare il precedente protocollo JO per l'acquisizione a intervalli con il sistema confocale Zeiss LSM five 10.

Posizionare la camera di imaging nel portavetrino sul tavolino del microscopio e mettere a fuoco l'embrione utilizzando un obiettivo 10x o 20x. In luce trasmessa, passare a un obiettivo 60x con apertura numerica di 1,2 o superiore, e mettere a fuoco su una cellula marcata mediante fluorescenza in epi nel software FV. Fare clic su ripetizione xy per iniziare la scansione laser.

Regolare le impostazioni di acquisizione e i controlli per l'acquisizione delle immagini per ottimizzare l'immagine e acquisire una serie in Z. Impostare i limiti superiore e inferiore dello Z-stack insieme alla dimensione del passo. Attivare l'icona della profondità nella finestra di controllo dell'acquisizione dell'immagine e avviare l'acquisizione cliccando sull'icona XY, serie Z per acquisire una serie temporale.

Impostare l'intervallo di tempo e il numero di punti temporali nella scansione temporale. Nella finestra delle impostazioni di acquisizione, fare clic sull'icona temporale nella finestra di controllo dell'acquisizione delle immagini e avviare l'acquisizione cliccando sull'icona della serie XYZT. Presentiamo qui filmati ed immagini rappresentativi di singole cellule marcate.

Quando i singoli neuroni sono marcatti, i loro assoni non sono oscurati da altre cellule marcate e quindi le estensioni OD sugli assoni e sui coni di crescita sono chiaramente visibili. Questo filmato mostra un neurone sensoriale marcato con la proteina RFP targeting della membrana. Esso emette due assoni in direzioni opposte che crescono fuori dal campo visivo.

Un terzo assone si estende in modo ortogonale dal corpo cellulare e forma rami. Analogamente, l'etichettatura di singole cellule della cresta neurale permette l'analisi mediante imaging di fini processi cellulari associati alla motilità cellulare. Qui, due cellule della cresta neurale sono marcate con GFP mirato alla membrana.

Presentano un'ampia attività protrusiva durante la migrazione in direzione anteriore. È spesso utile etichettare singole cellule all'interno di una linea transgenica per visualizzare le interazioni tra cellule adiacenti all'interno di una popolazione. Questa immagine mostra un embrione con espressione stabile di GFP in tutti i neuroni sensoriali che è stato iniettato con DNA codificante il marcatore RFP per colorare di rosso un neurone sullo sfondo di neuroni verdi, mediante iniezione di DNA codificante.

La sonda del biosensore dell'actina mostra un effetto più intenso nel segnale nei coni di crescita e nelle protrusioni dinamiche lungo gli assoni appena formati rispetto al corpo cellulare. In una fase successiva, il segnale rimane intenso nei coni di crescita, mentre negli assoni maturi è significativamente più debole. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'immagine in tempo reale di neuroni e cellule della cresta neurale singolarmente marcati in embrioni di pesce zebra.

Quando si esegue questa procedura, è importante scegliere embrioni in cui il DNA non è espresso a livelli sufficientemente elevati da causare tossicità o morte cellulare. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.