Name: Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per limaging di ossigeno nei sistemi biologici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri la sintesi e la calibrazione di nanosonde fosforescenti per l'imaging dell'ossigeno nei sistemi biologici. Questo metodo utilizza porfirine di platino e palladio per misurare i livelli di ossigeno in vivo.

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1. Descrizione generale del protocollo di misurazione dell'ossigeno (Questa sezione non ha alcuna azione, ma è cruciale per capire il resto della carta. Può essere girato, ad esempio, come una sequenza di alcune diapositive in Power Point, accompagnato dalla voce). 1.1) La sonda viene consegnato nel mezzo di interesse, ad esempio, iniettata nel fluido interstiziale sangue o di un animale. 1.2) L'oggetto (superficie del tessuto), è illuminata con la luce di lunghezza d'onda appropriata al fine di promuovere la sonda nel suo stato di tripletto eccitato. Tipicamente l'eccitazione avviene attraverso il meccanismo di un fotone. Tuttavia, nel caso di speciale a due fotoni avanzata sonde, l'eccitazione può essere fatto tramite il meccanismo a due fotoni, che consente l'utilizzo delle sonde ad alta risoluzione applicazioni di microscopia. Un fotone di eccitazione generalmente fornisce risoluzione spaziale di meno, ma richiede una strumentazione più semplice e può essere utilizzato in un unico punto le misurazioni con LED a base di fibra ottica phosphorometers. 1.3) Fosforescenza emessa dalla sonda proviene dal longevo stato di tripletto. La molecola sonda deve essere appositamente progettato per fornire alta resa quantica dello stato di tripletto ed emettono fosforescenza invece di fluorescenza. Mentre in stato di tripletto, la sonda può sperimentare incontri collisione con le molecole di ossigeno, che può disattivare la stato di tripletto - ". Tempra", un processo chiamato In assenza di ossigeno, la durata della stato di tripletto, e quindi della decadenza fosforescenza, è τ 0. In presenza di ossigeno, la durata fosforescenza (τ) è ridotta a causa della tempra. C'è una relazione diretta tra la durata dello stato di tripletto e la quantità di ossigeno nell'ambiente. Questo è il famoso rapporto Stern-Volmer, che collega la durata (τ) della fosforescenza di concentrazione di ossigeno [O 2] (o pressione parziale di ossigeno pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Equazione" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="equazione"> Nei sistemi biologici, l'ossigeno è di gran lunga il più efficace quencher di fosforescenza, che rende il metodo di spegnimento fosforescenza molto selettiva per l'ossigeno. 1.4) Per misurare la t vita, i fotoni emessi fosforescenti sono cestinate nel tempo. Ad esempio, dopo l'impulso di eccitazione, 200 fotoni possono essere raccolte nei primi 15 microsecondi, 150 fotoni raccolti nei prossimi 15 microsecondi, e così via, fino a quando non fotoni vengono raccolti. I numeri nelle celle rilevate in tempo dare il decadimento fosforescenza, che viene analizzato per produrre la durata τ. Nella diagnostica per immagini, questa procedura è applicata in ogni singolo pixel dell'immagine, con conseguente mappe vita fosforescenza. Misure di vite sono insensibili alla eterogeneità della distribuzione della sonda durante l'oggetto, che è comune per i campioni biologici. Così, solo su vite rapporto ossigeno. Durata τ sono convertite in concentrazioni di ossigeno con il rapporto Stern-Volmer. 2. Costruzione di sonde fosforescenti Sonde fosforescenti per misure di ossigeno nei sistemi biologici costituiti da cromofori fosforescente (nuclei), incapsulato in gabbie costruite con dendrimeri - hyperbranched polimeri altamente regolare [3]. Dendrimeri proteggere i nuclei dalle interazioni con l'ambiente e controllare la velocità di diffusione di ossigeno al core, permettendo di ottimizzare la sensibilità e la gamma dinamica delle sonde (costante k q nel rapporto Stern-Volmer). Il capolinea del dendrimeri sono modificati chimicamente inerte con polietilene glicole idrofile (PEG) i gruppi, rendendo le sonde altamente solubile in acqua ed evitare le loro interazioni con macromolecole biologiche. Nuclei fosforescente delle sonde sono complessi Pt o Pd di porfirine e π-extended porfirine. π-Extended porfirine sono porfirine in cui si fondono anelli di pirrolo con frammenti aromatiche esterni. π-Extension permette la sintonizzazione delle sonde proprietà spettroscopiche per soddisfare le esigenze di una particolare applicazione di imaging (microscopia ad esempio contro la tomografia). Come esempio, si descrive la sintesi di tetaaryltetrabenzoporphyrins Pd (4 PdAr TBP) [4]. PdAr 4 TBP hanno bande di assorbimento potente nel lontano rosso parte della fosforescenza spettro e forte, adatto per le misure di ossigeno biologico. La sintesi di PdAr 4 TBP è costituito dai seguenti passaggi: 2.1) Preparazione di tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) da Lindsey condensa [5] di tetrahydroisoindole con benzaldehydes sostituito. Ad una soluzione 0,01 M di tetrahydroisoindole (1 eq) in CH &lt;sub&gt; 2 CL 2 l'aldeide aromatica (1 eq) è stato aggiunto sotto argon. La miscela di reazione è stata agitata per 10 minuti al buio a temperatura ambiente BF 3 Xet 2 O (0,2 eq) è stato aggiunto, e la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per altre 2 h. DDQ (1 eq) è stato aggiunto, e la miscela è stata lasciata tutta la notte sotto agitazione continua. La soluzione è stata lavata con il 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq HCl e infine con acqua salata. La fase organica è seccato su Na 2 SO 4, quindi concentrato nel vuoto. Il residuo è stato ricristallizzato da CH 2 Cl 2 - ter-butil etere miscela per dare 4 TCHP come polvere verde Ar. Le rese sono circa il 50%. 2.2) Inserimento del Pd per ottenere PdAr 4 TCHPs. Free-base di porfirine (1 eq) sono stati trattati con 2 o pDC Pd (OAC) 2 (1.2 eq) in refluenti CH 3 CN, in presenza di un eccesso di Et 3 N (20 eq). La conversione è stata monitorata dalla spettroscopia UV-vis (solvente CH 2 Cl 2-AcOH) e considerata completa dopo la banda di Soret dettatura a 468-472 nm scomparso. La miscela è stato permesso di raffreddare, diluito con CH 2 Cl 2 e filtrato attraverso un sottile strato di Celite per rimuovere Pd (0). Il solvente è stato evaporato e il residuo è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando CH 2 Cl 2 come solvente. Frazione rosso scuro sono stati raccolti, il solvente è stato evaporato per dare obiettivo PdAr 4 TCHPs della resa quasi quantitativi. 2.3) PdAr 4 TBP sono stati preparati da ossidazione del PdAr 4 TCHPs con le 2 volte l'eccesso di DDQ (16 eq) in THF riflusso. Durante il riflusso, il colore cambiato da rosso scuro al verde scuro. Il solvente è stato evaporato, il residuo è stato diluito con CH 2 Cl 2, lavati con il 10% aq Na 2 SO 3, acqua e salamoia. La fase organica è seccato su Na 2 SO 4 e concentrato nel vuoto. Il residuo è stato purificato mediante cromatografia su gel di silice (eluente CH 2 Cl 2). La prima frazione verde scuro è stato raccolto, concentrato nel vuoto per dare 85-90% di polvere di colore blu-verde PdAr4TBP è. 2.4) gruppi estere periferiche di tetrachis Pd-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) sono stati idrolizzati con 10 volte l'eccesso di KOH in 1% (v / v) acqua / THF a rt. Il solvente è stato decantato dal precipitato di sali di potassio formato di derivati ​​dell'acido carbossilico di PdAr4TBP è. I solidi sono stati sciolti in acqua, mescolato per ulteriori 2 ore, acidificato con conc. HCl a pH ~ 4-5. Il precipitato ottenuto è stato isolato per centrifugazione, lavate con acqua ed essiccato nel vuoto. Proteggere dendroni. Ogni singolo ramo del dendrimero si chiama dendron. Dendroni proteggere sono costruiti con aril-glicina (AG) blocchi costruttivi. Dendroni AG possono essere facilmente sintetizzati da economico materie prime e isolati in purezza ed elevate rese mediante cromatografia senza metodi. Sintesi di generazione 2 (G2) AG-dendron è costituito dai seguenti passaggi: 2.4) Sintesi degli elementi costitutivi, Boc-protetta 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide e 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, utilizzando il metodo Fischer haloacyl alogenuri. 2.5) Accoppiamento degli elementi costitutivi utilizzando CDMT / NMM chimica accoppiamento peptide. 2.6) rimozione della protezione del gruppo amminico focale agitando la soluzione del dendron G2 in TFA per 2 ore a RT 2.7) Per il montaggio del dendroni generazione superiore, aggancio / deprotezione passi sono ripetuti. Dendrimero gruppo si ottiene accoppiamento del dendroni deprotetto a PdAr4TBP (o porfirina altro) utilizzando la HBTU / DIPEA chimica accoppiamento. 2.8) In primo luogo, il Boc-gruppi di protezione vengono rimossi dal dendron. Per esempio, Boc-protetta dendron G3 (0,58 g) è stato sciolto in TFA (15 ml), e la miscela è stata lasciata reagire a temperatura ambiente per 2 ore. L'acido è stato rimosso per evaporazione rotante, ottenendo il dendron come il TFA-sale. Il residuo è stato dissolto in secca NMP (10 ml) e qualche goccia di DIPEA sono stati aggiunti, per placare le tracce di TFA. 2.9) Prima di iniziare la reazione di accoppiamento, è fondamentale per sciogliere completamente la porfirina. Per esempio, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) è stato sciolto in secca NMP (65 ml) sotto il riscaldamento a 140 ° C per 10 minuti, sotto flusso di azoto. 2.10) La soluzione è stata raffreddata a temperatura ambiente, HBTU (0,211 g) è stato aggiunto, e la miscela è stata agitata per 5 min. 2.11) DIPEA (0,35 ml) è stato aggiunto alla miscela in una porzione, immediatamente seguita dalla aggiunta del SOLUZIOsu di TFA-sale della dendron in NMP (vedi 2.8), e la miscela è stata lasciata una notte sotto agitazione. 2.12) La miscela è stata versata in 3% aq. NaCl (350 ml), e il precipitato risultante è stato raccolto per centrifugazione e lavato con acqua, MeOH, e Et 2 O da sospensione ripetitivi / centrifugazione cedere il bersaglio porfirina-dendrimero. 2.13) Per idrolizzano i gruppi esteri periferici, il dendrimero è stato trattato con NME 4 OH (~ 5 mm) in DMSO / MeOH nel periodo 20-60 min, seguito dalla rimozione completa solvente. Questa procedura ci ha permesso di generare dendrimeri con sufficiente numero di gruppi carbossilato per dare solubilità in acqua. Per completare l'idrolisi, la dendrimero è stato trattato con NaOH 0.1N acquosa (una notte). Di conseguenza, puro porfirina-dendrimero acidi carbossilici possono essere isolati in 80-95% dei rendimenti. Modifica della periferia dendrimero. A questo punto, a partire dalla stessa porfirina-dendrimero, sia di uno o due fotoni sonde possono essere sintetizzati. Nel primo caso, tutti i gruppi periferici carbossilici sono modificate con le unità PEG - una metodologia nota come PEGilazione. In quest'ultimo caso, diversi gruppi carbossilici sono prima accoppiato con due fotoni cromofori antenna (cumarina-343) modificato con etilendiammina (EDA) linker, seguita da PEGilazione del carboxyls rimanenti [6]. Dendrimeri sono stati pegilato con monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av.. MW 1000) utilizzando HBTU / DIPEA chimica accoppiamento. 2.14) Per una soluzione del dendron in NMP (o DMF) (1-10 mM) eccesso di 1,25 volte di HBTU è stato aggiunto, e la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per 10 minuti. Eccesso di 6,25 volte di DIPEA è stato aggiunto, seguito con l'aggiunta immediata di un eccesso di 1,25 volte di m-PEG-NH2. La miscela di reazione è stata agitata per 2 giorni a temperatura ambiente. Etere etilico è stato aggiunto alla miscela di reazione, il precipitato formato è stato separato per centrifugazione e ri-precipitato da THF con l'aggiunta di etere etilico. 2.15) purificazione finale è stato ottenuto con dimensioni-cromatografia esclusione dalla raccolta della fase di primo fronte. Pegilato porfirina-dendrimero è stato dissolto in una piccola quantità di THF (~ 15 ml) e caricato sulla sommità di una colonna cromatografica riempito di polistirolo SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). La colonna è stata eluita con puro THF, e la banda di colore scuro in movimento con la parte anteriore è stato raccolto. 2.16) THF è stato rimosso su un evaporatore rotante, e il restante materiale è stato essiccato a vuoto. 3. Sonda caratterizzazione Caratterizzazione fotofisiche comprende misurazioni di spettri di assorbimento e di emissione della sonda, fosforescenza durata τ 0 e Stern-Volmer ossigeno tempra costanti k q in condizioni fisiologiche. 3.1) Gli spettri di assorbimento e di emissione sono ottenuti in condizioni ambientali utilizzando strumenti standard (spettrofotometro e fluorimetro costante). ~ 1 microM soluzioni della sonda viene utilizzato. 3.2) Successivamente, il Stern-Volmer diagramma di taratura si ottiene. Questa è la misura più importante, perché ci permette di mettere in relazione la durata della sonda per la concentrazione di ossigeno. 3.3) Una soluzione della sonda nel tampone PBS (pH 7,2) si trova in una cuvetta speciale forma cilindrica, che viene posizionato all'interno della camera a temperatura controllata, che si trova all'interno di un leggero impermeabile gabbia con le porte per le fibre di eccitazione e di emissione ottica. Le fibre sono messi a stretto contatto con la cuvetta all'interno della camera in angolo retto geometria. 3.4) La cuvetta è chiuso con un tappo, in cui una molto sensibile Clark-elettrodo ossigeno (CK-elettrodo ossigeno) viene inserito. Il tappo contiene anche due porte aghi per aspirazione e mandata di argon. L'elettrodo è immerso nella soluzione, mentre gli aghi solo prevedere il flusso di flusso di gas al di sopra della superficie soluzione. In un primo momento, l'argon non è collegato alla presa. 3.5) La temperatura è impostata al valore desiderato (in genere 36-37 ° C) e la soluzione viene lasciata sotto agitazione per il raggiungimento dell'equilibrio. 3.6) La fibra di eccitazione è collegato alla porta eccitazione di un phosphorometer digitale, gestito da un PC. La sorgente di luce nel phosphorometer è un LED ad alta potenza, la cui uscita è controllato da un kHz D 333 / A a bordo. La fibra di emissione è collegata a un'altra porta ottica del phosphorometer, che è accoppiato ad un APD altamente sensibili all'infrarosso (valanga fotodiodo). L'uscita del diodo è amplificato e alimentato in A / canale D del consiglio stesso controllo, che permette la sincronizzazione tra l'eccitazione e canali di emissione. 3.7) Il software di controllo algenerazione di impulsi di eccitazione bassi di qualsiasi lunghezza desiderata (ad esempio 5 o 10 ms), seguita dalla raccolta di decadimento fosforescenza durante un qualsiasi periodo di arbitraria scelta (in genere 2-3 ms). Tempo necessario per una misura singola vita è tipicamente 0,5-1 s, tuttavia, le misurazioni possono essere ottenuti più rapidamente 10-20 al secondo. 3.8) L'uscita del elettrodo ossigeno viene amplificato e diretto in un altro A / D a bordo sullo stesso PC. Questa è una scheda a bassa frequenza (1 kHz max), che viene utilizzato per registrare l'elettrodo corrente in periodi di tempo selezionato. Il programma per la registrazione dei dati elettrodo funziona contemporaneamente con il software phosphorometer. 3.9) Una volta che la temperatura della soluzione è equilibrato, sia la phosphorometer ei programmi elettrodi vengono inizializzati allo stesso tempo di effettuare le misurazioni ogni 10 s. Le loro uscite sono registrati in modo sincrono in due file separati. Dopo di che, l'argon è collegato alla porta di ingresso sul tappo cuvetta. 3.10) Come argon scorre sulla superficie della soluzione agitata, sostituisce a poco a poco ossigeno. Ciò si traduce in una diminuzione della corrente elettrodo e un aumento della vita fosforescenza, che è misurata dal phosphorometer. Di solito, l'ossigeno è spostata la soluzione di tutto dopo circa 2 ore, durante i quali i dati sono registrati in modo completamente automatico in file. 3.11) Dopo la fine della corsa titolazione, i dati elettrodo e le durate fosforescenza sono importati in un programma di analisi standard (ad esempio Origine Miocrocal). L'attuale elettrodo dipende linearmente concentrazione di ossigeno, e per l'elettrodo utilizzato è praticamente zero a ossigeno zero. A pressione atmosferica, pO 2 è noto (circa 150 mm Hg). Così, i dati elettrodi possono essere direttamente convertiti alla scala di ossigeno, e la trama della vita inversa fosforescenza vs pO 2 può essere costruito. Questo grafico è dotato di una linea retta con il metodo dei minimi quadrati per dare il KQ tempra costante di ossigeno come la sua pendenza. Vita fosforescenza t0 è ottenuta dal fit stesso (come l'inverso del intercetta) o direttamente dalla misurazione a zero ossigeno. 3.12) Se necessario, la titolazione è ripetuta utilizzando una soluzione della sonda in presenza di albumina - una proteina presente nel plasma sanguigno in alte concentrazioni, - al fine di emulare le condizioni incontrato nel sistema reale sperimentale (sangue di un animale in vivo). La ottenere Stern-Volmer trame dovrebbero essere identici se il dendrimero protegge la sonda bene e gruppi PEG isolare la sonda dai contatti con l'albumina. In caso contrario, la sonda e le proteine ​​nel sangue interagisce, e che porterà ad un alterato Stern-Volmer complotto, causando ambiguità nelle misure di ossigeno. Costanti di calibrazione così ottenuti sono usati in esperimenti di imaging in cui le concentrazioni di ossigeno sono una sconosciuta a priori.

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
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<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abbreviazione</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Nome e cognome</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Acido trifluoroacetico</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium esafluorofosfato</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimetilsolfossido</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-cloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Misurazione dell&#39;ossigeno da tempra fosforescenza [1, 2] è costituito dai seguenti passi: 1) la sonda viene consegnato nel mezzo di interesse (es. sangue o liquido interstiziale), 2) l&#39;oggetto viene illuminato con luce di lunghezza d&#39;onda appropriata al fine di eccitare la sonda nel suo stato di tripletto, 3) la fosforescenza emessa è raccolta, e suo sviluppo nel tempo viene analizzato per produrre la vita fosforescenza, che viene convertita in concentrazione di ossigeno (o pressione parziale, pO<sub&gt; 2</sub&gt;). La sonda non deve interagire con l&#39;ambiente biologico e, in alcuni casi da 4) espulso dal supporto al completamento di misura. Ognuno di questi passi impone requisiti relativi alla progettazione molecolare delle sonde fosforescenti, che costituiscono l&#39;unica componente invasiva del protocollo di misurazione. Qui passiamo in rassegna la progettazione di dendritiche nanosensori fosforescenti per misure di ossigeno nei sistemi biologici. Le sonde sono costituite da Pt o Pd porfirina-based polyarylglycine (AG) dendrimeri, modificato marginalmente con polietilenglicole (PEG) i residui. Per un efficace eccitazione a due fotoni, capolinea del dendrimeri possono essere modificate con due fotoni cromofori antenna, che catturano l&#39;energia di eccitazione e smistarli verso i nuclei tripletta delle sonde tramite intramolecolari FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Ci descrivono le proprietà fotofisiche chiave delle sonde e del presente protocollo dettagliate sulla calibrazione.

Vi presentiamo i principi delle misure di ossigeno da tempra fosforescenza e la progettazione commento su nanosensori dendritiche porfirina-based per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

La misurazione dell'ossigeno tramite quenching della fosforescenza [1, 2] consiste nei seguenti passaggi: 1) la sonda viene inserita nel mezzo di interesse (ad esempio il sangue...

Presentiamo la progettazione di sonde fosforescenti per l'ossigeno basate su DER porfirinici di platino e palladio. Le sonde consistono in nuclei porfirinici metallici incapsulati in dendron e in uno strato periferico idrofilo di polietilenglicole; la costruzione delle sonde e le loro calibrazioni saranno illustrate in questo articolo. Ciao, mi chiamo Luis Sinks.Lavoro con il Professor Sergei OV presso il Dipartimento di Biochimica e Biofisica dell'Università della Pennsylvania. Sono Emmanuel Losis, anch'io proveniente da Vina. Sono anche io di Vina, e sono Sergei. Le misurazioni dell'ossigeno biologico mediante fosforo e spegnimento sfruttano sonde fosforate esogene, che vengono introdotte direttamente nel mezzo di interesse.I sonde per sangue o fluido interstiziale sono l'unico componente invasivo del sistema di misurazione che richiede particolare attenzione nella progettazione. Oggi vi mostreremo un procedimento per la sintesi e la calibrazione di sonde nanostrutturate dendritiche fosforescenti per la misurazione dell'ossigeno in sistemi biologici. Utilizziamo questo procedimento per sintetizzare e caratterizzare sonde destinate a misurazioni di ossigeno semiquantitative e quantitative.Iniziamo. Prima di iniziare a costruire le sonde, esaminiamo innanzitutto la teoria di base alla base della fosforescenza delle sonde. La fosforescenza ha origine dallo stato tripletto a vita lunga.La molecola sonda deve essere progettata per fornire un'elevata resa quantica dello stato tripletto e per emettere fosforescenza anziché fluorescenza. L'eccitazione delle sonde avviene mediante un fotone oppure, nel caso di particolari sonde potenziate a due fotoni, attraverso un meccanismo a due fotoni. L'eccitazione a un fotone fornisce generalmente una risoluzione spaziale inferiore, ma richiede strumentazione più semplice ed è utilizzabile in misure puntuali con perimetri fosforimetrici basati su LED con fibra ottica.Quando si trova nello stato tripletto, la sonda può subire incontri collisionali con molecole di ossigeno, che possono deattivare lo stato tripletto in un processo chiamato quenching. Pertanto, in presenza di ossigeno, la vita media della fosforescenza si accorcia. A causa del quenching, la dipendenza della vita media dello stato tripletto dalla quantità di ossigeno presente nell'ambiente è descritta dall'equazione di Stern-Volmer.In esperimenti in vivo, la sonda viene somministrata nel sangue o nel liquido interstiziale di un animale, e la superficie del tessuto viene illuminata con luce di una lunghezza d'onda appropriata per portare la sonda nel suo stato tripletto eccitato. Per misurare la vita media della fosforescenza, i fotoni fosforescenti emessi vengono raccolti in intervalli di tempo successivi. Ad esempio, dopo l'impulso di eccitazione, potrebbero essere raccolti 3.609 fotoni nei primi cinque microsecondi, 1.421 fotoni nei successivi cinque microsecondi e così via fino a quando non vengono più raccolti fotoni.I numeri nei contenitori riportati in funzione del tempo forniscono il decadimento della fosforescenza, che viene analizzato per determinare il tempo di vita fosforescente. Nell’imaging, questo procedimento viene applicato a ogni pixel dell'immagine, generando mappe del tempo di vita fosforescente. Le misurazioni dei tempi di vita sono insensibili alle eterogeneità nella distribuzione della sonda all'interno del campione, fenomeno comune nei campioni biologici.Ora vediamo come costruire le sonde. Iniziare la procedura di sintesi aggiungendo un'aldeide aromatica a una soluzione 0,01 molare di tetra idro iso indolo. Mescolare la miscela di reazione per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.Quindi aggiungere boro, trifluoruro di dietile, e continuare a mescolare per ulteriori due ore. Successivamente, aggiungere diclorocianobenzoquinone o DDQ, il che provoca un cambiamento di colore da rosso pallido a verde scuro; lasciare la miscela durante la notte sotto costante agitazione. Il giorno seguente, lavare e asciugare la soluzione, quindi concentrarla in vuoto.La cristallizzazione controllata del residuo fornisce l'obiettivo sotto forma di polvere verde. I rendimenti sono tipicamente intorno al 50%. Successivamente, trattare il porfirina in forma libera con acetato di palladio. Monitorare la conversione mediante spettroscopia UV-vista.La conversione è completa quando scompare la banda del sapone del Dion compresa tra 468 e 472 nanometri. Il porfirina viene isolato mediante cromatografia su colonna su gel di silice. Per preparare il palladio tetra benzo porfirina, ossidare il palladio tetra ciclo porfirina.Durante la riflessione, il colore cambia dal rosso scuro al verde intenso; evaporare il solvente, diluire il residuo con metilene dicloruro, lavare, asciugare e concentrare la fase organica in vuoto. Dopo la cromatografia su gel di silice, isolare il porfirina di palladio tetra benzo come una polvere verdeblu. Successivamente, idrolizzare i gruppi esterei periferici della porfirina di palladio trab benzo.Trattare innanzitutto l'estere del tetra benzo porfirina con una base in tetra idro furano. Proseguire quindi con l'idrolisi in ambiente basico acquoso, precipitare il porfirina mediante aggiunta di acido cloridrico e asciugarlo in vuoto. In questo modo si completa la sintesi del porfirina.Ora vediamo come sintetizzare gli entroni. Prima che le sonde vengano assemblate, gli entroni, che sono i rami del Denmark, devono essere pre-sintetizzati. Utilizziamo aero glicole, stessi DER, che possono essere convenientemente preparati a partire da materiali di studio economici mediante metodi privi di cromatografia.I dendrimeri con gruppi amminici nei punti focali vengono quindi legati ai gruppi carbossilici sul fito, che abbiamo appena illustrato come sintetizzare. Successivamente, i gruppi estere presenti alla periferia del DME vengono idrolizzati in modo analogo ai gruppi carbossilici presenti alla periferia del porfirina. A questo punto, partendo dall'acido poli-carbossilico del porfirina DME, possono essere sintetizzati uno o due sonde fotoniche per ottenere le sonde a due fotoni.Per prima cosa, attaccare in modo divergente alcuni frammenti di antenna a due fotoni a diversi gruppi carbossilici presenti sulla periferia del dimero. Procedere ora con la modifica dei residui di acido carbossilico rimanenti sul dimero. Iniziare aggiungendo un eccesso di 1,25 volte di HBTU a una soluzione altamente concentrata del porfirina monomero e agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 10 minuti.Ora, aggiungere diisopropiletilammina e metossi polietilenglicole ammina. Mescolare la miscela di reazione per due giorni a temperatura ambiente, quindi aggiungere etere etilico. Separare il precipitato mediante centrifugazione e riprecipitarlo diverse volte da tetraidrofurano aggiungendo etere dietilico.Infine, purificare la sonda mediante cromatografia di esclusione dimensionale su perle di polistirene utilizzando tetraedrano come solvente. Esaminiamo ora la caratterizzazione e la calibrazione della sonda. Gli spettri di assorbimento e di emissione della sonda vengono ottenuti utilizzando soluzioni della sonda a una concentrazione di un micromolare in condizioni ambiente, mediante uno spettrofotometro standard e un fluorimetro a stato stazionario.Successivamente, per ottenere il grafico di calibrazione stern-ulmer, che ci permette di correlare il tempo di vita della sonda alla concentrazione di ossigeno, si colloca una soluzione della sonda in un apposito vete cilindrico. Il vete è posizionato all'interno di una camera a temperatura controllata, situata all'interno di una gabbia impermeabile alla luce, dotata di aperture per le fibre ottiche di eccitazione e di emissione. Si chiude il vete con un tappo, nel quale è inserita un'elettrodo per ossigeno di tipo Clark ad alta sensibilità.Il tappo presenta inoltre due fori per aghi per l'ingresso e l'uscita dell'Argonne. Impostare la temperatura tra 36 e 37 gradi Celsius e lasciare mescolare la soluzione fino al raggiungimento dell'equilibrio. Collegare la fibra di eccitazione all'orifizio di eccitazione di un perimetro fosfo digitale controllato da un pc.La sorgente luminosa e il perimetro foso sono costituiti da un LED ad alta potenza, il cui output è controllato da una scheda digitale-analogica a 333 kilohertz. La fibra di emissione è collegata a un'altra porta ottica del perimetro foso, che è accoppiata a un fotodiodo a valanga sensibile all'infrarosso. L'output del fotodiodo viene amplificato e inviato al canale ad della stessa scheda di controllo, consentendo la sincronizzazione tra i canali di eccitazione e di emissione.Il software di controllo sviluppato in proprio genera impulsi di eccitazione della durata desiderata, seguiti dalla raccolta del decadimento della fosforescenza. L'uscita dell'elettrodo per l'ossigeno viene amplificata e inviata a un'altra scheda analogico-digitale nello stesso elaboratore. Si tratta di una scheda a bassa frequenza, con un massimo di un chilohertz, utilizzata per registrare la corrente dell'elettrodo in punti temporali selezionati, tipicamente dieci volte al secondo.Una volta che la temperatura della soluzione ha raggiunto l'equilibrio, sia il perimetro phos che i programmi dell'elettrodo vengono inizializzati contemporaneamente. Per eseguire misurazioni ogni 10 secondi, i loro output vengono registrati in modo sincrono in due file separati. Successivamente, Argonne viene collegato alla porta di ingresso del tappo a tenuta stagna.Mentre l'argon scorre sulla superficie della soluzione agitata, sostituisce gradualmente l'ossigeno. Ciò provoca una diminuzione della corrente dell'elettrodo e un aumento della vita media del fosforo, che viene misurata mediante il perimetro fosforo. Di solito l'ossigeno viene completamente rimosso dalla soluzione.Dopo circa due ore dalla fine della corsa di titolazione, i dati dell'elettrodo e i tempi di vita del fosforo vengono importati in un programma standard di analisi, che genera un grafico dell'inverso del tempo di vita del fosforo in funzione della pressione parziale di ossigeno. Questo grafico viene interpolato con una retta utilizzando il metodo dei minimi quadrati, ottenendo come pendenza la costante di soppressione dell'ossigeno. Il tempo di vita fosforescente viene ottenuto o dall'interpolazione stessa oppure direttamente dalla misurazione in assenza di ossigeno.La titolazione può essere ripetuta utilizzando una soluzione della sonda in presenza di albumina, una proteina presente nel plasma sanguigno, al fine di emulare le condizioni riscontrate nel sangue di un animale in vivo. I grafici di Stern-Volmer ottenuti dovrebbero essere identici se l'ER sta proteggendo la sonda. Bene, e i gruppi peg isolano la sonda dal contatto con l'albumina.La proposta illustrata qui prevede alcuni passaggi selezionati nella sintesi dell'ossigeno, seguiti dal trattamento delle sonde e dalla loro calibrazione. Durante la calibrazione, è fondamentale assicurarsi che le condizioni siano il più possibile simili a quelle del sistema biologico di interesse.È importante assicurarsi che la molecola sonda non sia influenzata da biomolecole, come l'albumina. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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