Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l'imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Vi presentiamo i principi delle misure di ossigeno da tempra fosforescenza e la progettazione commento su nanosensori dendritiche porfirina-based per l'imaging di ossigeno nei sistemi biologici.

Presentiamo il design di sonde fosforescenti per ossigeno a base di DER di porfirina di platino e palladio. Le sonde sono costituite da nuclei metallici di porfirina che incapsulano il dendro e la struttura periferica dello strato di polietilenglicole idrofilo delle sonde e le loro calibrazioni saranno illustrate in questo articolo. Ciao, mi chiamo Luis Sinks.

Lavoro con il professor Sergei OV qui al Dipartimento di Biochimica e Biofisica dell'Università della Pennsylvania. Sono Emmanuel Losis, anche lui della Vina. Sono grasso anche dal, E sono Sergei V.Le misure di ossigeno biologico mediante fosforo e tempra fanno uso di fosforo esogeno e sonde, che vengono introdotte direttamente nel mezzo di interesse.

Le sonde di sangue o di fluido interstiziale sono l'unico componente invasivo dello schema di misurazione che richiede un'attenzione particolare al loro design. Oggi vi mostreremo una procedura per la sintesi e la calibrazione di nano sonde fosforescenti dendritiche per la misura dell'ossigeno e i sistemi biologici. Utilizziamo questa procedura per sintetizzare e caratterizzare le sonde per misure di ossigeno semi e doppie.

Quindi iniziamo. Prima di iniziare a costruire sonde, esaminiamo la teoria di base alla base della fosforescenza delle sonde. La fosforescenza ha origine dallo stato di tripletto di lunga vita.

La molecola della sonda deve essere progettata per fornire un'elevata resa quantica dello stato di tripletto e per emettere fosforescenza invece di fluorescenza. L'eccitazione delle sonde avviene da un fotone o, nel caso di sonde speciali potenziate da due fotoni, dal meccanismo a due fotoni. L'eccitazione di un fotone fornisce generalmente una risoluzione spaziale inferiore, ma richiede una strumentazione più semplice e può essere utilizzata in misurazioni a punto singolo con perimetri fos in fibra ottica basati su LED.

Mentre si trova nello stato di tripletto, la sonda può sperimentare incontri collisionali con molecole di ossigeno, che possono disattivare lo stato di tripletto, un processo chiamato quenching. Pertanto, in presenza di ossigeno, la durata della fosforescenza si accorcia. Come risultato del quenching, la dipendenza del tempo di vita dello stato di tripletto dalla quantità di ossigeno nell'ambiente è caratterizzata dall'equazione di Stern Volmer.

Negli esperimenti in vivo, la sonda viene erogata nel sangue o nel liquido interstiziale di un animale e la superficie del tessuto viene illuminata con luce di una lunghezza d'onda appropriata per portare la sonda nel suo stato di tripletto eccitato. Al fine di misurare il tempo di vita fosforescente, i fotoni fosforescenti emessi sono bi nel tempo. Ad esempio, dopo l'impulso di eccitazione, potrebbero essere raccolti 3.609 fotoni nei primi cinque microsecondi, 1.421 fotoni raccolti nei successivi cinque microsecondi e così via fino a quando non vengono raccolti fotoni.

I numeri nei contenitori tracciati rispetto al tempo forniscono il decadimento della fosforescenza, che viene analizzato per ottenere il tempo di vita della fosforescenza. Nell'imaging, questa procedura viene applicata a ogni pixel dell'immagine, ottenendo mappe di durata fosforescenti. Le misurazioni della durata di vita sono insensibili alle eterogeneità della distribuzione della sonda in tutto l'oggetto, che è comune per i campioni biologici.

Vediamo ora come costruire le sonde. Iniziare la procedura di sintesi aggiungendo un'aldeide aromatica a una soluzione molare 0,01 di tetra idroiso indolo. Mescolare la miscela di reazione per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere il boro, il trifluoruro datil, mangiare e continuare a mescolare per altre due ore. Quindi, aggiungi dicloruro ciano, benzochinone o DDQ, che si traduce nel colore. Passare dal rosso pallido al verde intenso e lasciare il composto per una notte sotto agitazione continua il giorno successivo, lavare e asciugare la soluzione, quindi concentrarla sottovuoto.

La cristallizzazione Reg del residuo dà il bersaglio come una polvere verde. Le rese sono in genere intorno al 50% Successivamente, trattare la porfirina a base libera con acetato di palladio. Monitora la conversione mediante spettroscopia UV vista.

La conversione è completa dopo che la banda di sapone del Dion tra 468 e 472 nanometri scompare. La porfirina viene isolata mediante cromatografia su colonna su gel di silice. Per preparare la tetra benzoporfirina di palladio, ossidare la tetra cicloporfirina di palladio.

Durante la riflessione, il colore cambia dal rosso scuro al verde intenso, evapora il solvente, diluisce il residuo con lavaggio con clorometano, asciuga e concentra la fase organica sotto vuoto. Dopo cromatografia su gel di silice, isolare la tetra porfirina di palladio come polvere di colore bluverde. Successivamente, idrolizzare i gruppi etro periferici della palladio trab benzo porfirina.

Per prima cosa trattare la tetra benzo porfirina Esther con una base in tetra idro purina. Proseguire quindi l'idrolisi e la base acquosa, precipitare la porfirina con l'aggiunta di acido cloridrico ed essiccarla sottovuoto. Questo completa la sintesi della porfirina.

Vediamo ora come sintetizzare gli entroni. Prima che le sonde siano assemblate, gli entron, che sono i rami della Danimarca, devono essere pre-sintetizzati. Utilizziamo aero gli, gli stessi DER, che possono essere convenientemente preparati con materiali di studio poco costosi utilizzando metodi privi di cromatografia.

I teroni con gruppi amminici nei loro punti focali vengono quindi attaccati ai gruppi carillari sul phy, che vi abbiamo appena mostrato come realizzare. Quindi i gruppi estere alla periferia del DME vengono idrolizzati in modo simile ai gruppi carbossilici alla periferia della porfirina. A questo punto, a partire dall'acido policarbossilico porfirino DME, possono essere sintetizzate una o due sonde di fotoni per sintetizzare le due sonde di fotoni.

Per prima cosa attaccano subacqueamente alcuni frammenti di antenna a due fotoni a diversi gruppi carbossilici sulla periferia del demer. Procedete ora con la modifica dei residui di acido carbossilico rimanenti sul demer. Iniziare aggiungendo un eccesso di 1,25 volte di HBTU a una soluzione altamente concentrata di rimero di porfirina e mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 10 minuti.

Ora, aggiungi di isopropil etilammina e metossi polietilenglico lammina. Mescolare la miscela di reazione per due giorni a temperatura ambiente e poi aggiungere l'etere etilico. Separare la forma da precipitare per centrifugazione e riprecipitarla dal tetraedro alcune volte aggiungendo etere datilico.

Infine, purificare la sonda mediante cromatografia ad esclusione dimensionale su perle di polistirene utilizzando il tetraedro come solvente. Ora diamo un'occhiata alla caratterizzazione e alla calibrazione della sonda. Gli spettri di assorbimento ed emissione della sonda sono ottenuti utilizzando soluzioni di sonda micromolare in condizioni ambientali con uno spettrofotometro standard e un fluorimetro a stato stazionario.

Successivamente per ottenere il diagramma di calibrazione Ulmer di poppa, che ci permette di mettere in relazione la durata della sonda con la concentrazione di ossigeno, poniamo una soluzione della sonda in uno speciale vete cilindrico. Il vete è posizionato all'interno di una camera a temperatura controllata all'interno di una gabbia impermeabile alla luce con porte per l'eccitazione e l'emissione di fibre ottiche. Chiudere il vete con un tappo, che ha inserito un elettrodo di ossigeno di tipo Clark altamente sensibile.

Il tappo ha anche due porte per l'ago per l'ingresso e l'uscita di Argonne. Impostare la temperatura a 36-37 gradi Celsius e lasciare mescolare la soluzione fino a raggiungere l'equilibrio. Collegare la fibra di eccitazione alla colata di eccitazione di un perimetro di fosfo digitale controllato da un pc.

La sorgente luminosa e il perimetro del phos è un LED ad alta potenza, la cui uscita è controllata da una scheda digitale-analogica da 333 kilohertz. La fibra di emissione è collegata a un'altra porta ottica del perimetro fos, che è accoppiata a un fotodiodo a valanga sensibile agli infrarossi. L'uscita del diodo viene amplificata e immessa nel canale ad della stessa scheda di controllo, consentendo la sincronizzazione tra i canali di eccitazione e di emissione.

Il software di controllo scritto a casa genera impulsi di eccitazione di qualsiasi lunghezza desiderata, seguiti dalla raccolta del decadimento della fosforescenza. L'uscita dell'elettrodo di ossigeno viene amplificata e diretta in un'altra scheda digitale analogica sullo stesso pc. Si tratta di una scheda a bassa frequenza, un kilohertz massimo, che viene utilizzata per registrare la corrente dell'elettrodo in punti temporali selezionati, in genere 10 volte al secondo.

Una volta che la temperatura della soluzione è stata bilanciata, vengono inizializzati contemporaneamente sia il perimetro del fos che i programmi degli elettrodi. Per eseguire misurazioni ogni 10 secondi, i loro output vengono registrati in modo sincrono in due file separati. Successivamente, Argonne è collegato alla porta di ingresso sul tappo veterinario.

Quando l'Argonne scorre sulla superficie della soluzione agitata, sostituisce gradualmente l'ossigeno. Ciò si traduce in una diminuzione della corrente dell'elettrodo e in un aumento della durata del fosforo, che viene misurata dal perimetro del fosforo. Di solito l'ossigeno viene spostato completamente dalla soluzione.

Dopo circa due ore dall'esecuzione della titolazione, i dati dell'elettrodo e la durata del fosforo vengono importati in un programma di analisi standard, che crea un grafico della durata inversa del fosforo rispetto alla pressione parziale dell'ossigeno. Questo grafico è dotato di una linea retta che utilizza il metodo dei minimi quadrati per dare costante la tempra dell'ossigeno alla sua pendenza. Il tempo di vita fosforescente si ottiene dallo stesso accoppiamento o direttamente dalla misurazione a zero ossigeno.

La titolazione può essere ripetuta utilizzando una soluzione della sonda in presenza di albumina, una proteina presente nel plasma sanguigno al fine di emulare le condizioni incontrate nel sangue di un animale in vivo. I grafici di Ulmer di poppa ottenuti dovrebbero essere identici se l'ER protegge la sonda. Bene, e i gruppi peg isolano la sonda dal contatto con l'albumina.

Il suggerimento qui, passaggi selezionati nella sintesi dell'ossigeno, quindi ha trattato i problemi e la loro calibrazione. Quando si esegue la calibrazione. È importante assicurarsi che le condizioni siano il più possibile vicine a quelle del sistema biologico di interesse.

È importante assicurarsi che la molecola della sonda non sia influenzata da biomolecole, come l'albumina. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna per la tua esperienza.