Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

In questa procedura, la dinamica dell'espressione genica nei tessuti vegetali viene visualizzata nel tempo mediante l'uso della robotica; in primo luogo, i semi di fagiolo lima vengono sterilizzati e posizionati tra tovaglioli di carta inumiditi in un contenitore per colture cellulari per la germinazione. Dopo quattro giorni, i cotiledoni vengono rimossi e bombardati con un costrutto di DNA contenente un promotore fuso alla GFP. I cotiledoni posizionati in piastre di Petri vengono montati su un sistema robotico personalizzato per la raccolta di immagini in due dimensioni. Il robot è programmato per acquisire immagini di ciascun frammento di tessuto ogni ora per 100 ore.

Le immagini vengono sottoposte ad analisi dell'immagine, fornendo dati quantitativi sull'intensità dell'espressione di GFP nel tempo. Ciao, sono John Finer, direttore del Laboratorio di Trasformazione Vegetale del Dipartimento di Orticoltura e Scienze delle Colture presso l'Ohio State University. Sono Carlos Herandez Garcia, studente di dottorato nel laboratorio Finer presso l'Ohio State University.

Oggi Carlos vi mostrerà il protocollo che abbiamo sviluppato per l'analisi dell'espressione genica e dei tessuti vegetali utilizzando la proteina fluorescente verde. Utilizziamo questa procedura, da noi sviluppata in laboratorio, per misurare l'attività della ceppa OD. A tale scopo, posizioniamo innanzitutto il nostro promotore a monte del gene GFP, che rappresenta il nostro gene reporter.

Mostrerò come introduciamo il controllo del promotore nella vena di Cataly del fagiolo di Lima e inviamo un'applicazione sul nostro sistema robotico personalizzato per l'acquisizione di immagini. Concluderò illustrando il nostro protocollo per l'analisi delle immagini. Cominciamo: per iniziare questa procedura, sterilizzare superficialmente i semi di fagiolo di Lima utilizzando procedure standard.

Posizionare i semi sterilizzati in contenitori Magenta GA7 tra strati di carta assorbente umida e incubare per quattro giorni a 25 gradi Celsius. In questo caso utilizziamo un vettore di espressione con alto numero di copie, utile per analisi di promotori ed elementi promotori. Questo vettore contiene il gene GFP, che viene utilizzato per visualizzare la funzione del promotore o degli elementi promotori nei tessuti trasformati circa una-due ore prima del bombardamento.

Escidere i CU di fagiolo lima dai tegumenti dei semi. I CU di fagiolo lima adatti per il bombardamento devono essere gialli o verde chiaro, piatti e privi di qualsiasi danno che potrebbe interferire con l'analisi successiva delle immagini; immediatamente dopo l'escissione, posizionare 12 CU in una piastra di Petri con mezzo di coltura OMS contenente sali MS, vitamine B5, saccarosio al 3% e gelrite allo 0,2% a pH 5,7. Successivamente, precipitare il costrutto di DNA su particelle di tungsteno M10. Subito prima dell'uso, risospendere innanzitutto le particelle in acqua sterile a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.

Quindi, in una provetta da 0,6 millilitri, aggiungere 25 microlitri di particelle, 5 microlitri di DNA a una concentrazione di 1 microgrammo per microlitro, 25 microlitri di cloruro di calcio 2,5 molare e 10 microlitri di spermina 100 millimolare. Incubare la preparazione di DNA sul ghiaccio per cinque minuti, quindi rimuovere e scartare 50 microlitri della soluzione sovrastante le particelle. Ri-sospendere le particelle rivestite di DNA che rimangono sul fondo della provetta mediante vortex.

E immediatamente dopo aver agitato con il vortex, prelevare due microlitri di Eloqua. Ripetere questo passaggio di agitazione con il vortex. Ogni volta che si preleva un Eloqua, le particelle rivestite devono essere mantenute sul ghiaccio e utilizzate entro 15 minuti.

Ora che il DNA è stato depositato sulle particelle, posizionare due microlitri di particelle attraverso la parte superiore di un filtro a siringa al centro di una griglia filtrante. Successivamente, inserire il filtro a siringa nell'unità di supporto del filtro all'interno della camera della pistola per l'introduzione di particelle, o camera PIG. Posizionare un seme di fagiolo lima con l'ilo rivolto verso l'alto su una piastra deflettente costituita da una griglia fusa sul fondo di un becher.

Posizionare la piastra deflettente, utilizzata come piattaforma per sostenere i tessuti durante il bombardamento nella camera della pistola a particelle. Per bombardare il tessuto, aprire innanzitutto la valvola che conduce al vuoto per evacuare la camera. Quando il vuoto raggiunge 760 millimetri di mercurio, attivare il solenoide e rilasciare l'elio per far avanzare le particelle.

La pressione dell'elio utilizzata per accelerare le particelle è compresa tra 50 e 60 PSI. Dopo il bombardamento con particelle, chiudere la valvola della linea del vuoto e rilasciare il vuoto mediante la valvola di scarico. Una volta rilasciato il vuoto, aprire la porta della camera per recuperare il co leadin bombardato e riportare il co leadin dal lato a dal.

Fino a mezzo di coltura OMS per la quantificazione e il profilo di espressione. Bombardare almeno tre co-piani per ogni costrutto di DNA. È incluso anche un controllo positivo, che fornisce un profilo di espressione genica ben studiato.

I campioni sono ora pronti per l'acquisizione delle immagini. Accendere la lampada al mercurio e attendere 30 minuti perché la lampada si riscaldi. Accendere le fonti di alimentazione per la telecamera SPOT R-T-C-C-D e per il controllore del motore, che guida il movimento della piattaforma robotica su misura, che contiene otto piastre.

Impostare il set di filtri per la rilevazione della GFP selezionando il set di due filtri per GFP a 480 nanometri di eccitazione e 510 nanometri di emissione su un microscopio stereoscopico MZ L tre. Successivamente, sterilizzare i coperchi spessi in policarbonato delle piastre di Petri spruzzandoli con etanolo al 70%. I coperchi specializzati utilizzati per coprire la base della piastra di Petri impediscono la formazione di condensa durante l'acquisizione delle immagini.

Posizionare le piastre contenenti il cuan bombardato sulla piattaforma robotica e serrare la vite laterale di bloccaggio per fissarle in posizione. Aprire ora l'applicazione software personalizzata che controlla sia la piattaforma robotica sia l'acquisizione delle immagini. Aprire anche l'interruttore del controllo della luce bianca tramite il software e orientare la piattaforma nella posizione iniziale.

Questo viene fatto prima di impostare le posizioni. Per ogni coddle leadin nella scheda motore, selezionare la prima piastra. La piattaforma posizionerà il centro della piastra di Petri sotto l'obiettivo del microscopio.

Utilizzando i pulsanti di spostamento della distanza, posizionare con precisione il primo CU LEADIN per la raccolta delle immagini. Utilizzando la funzione in modalità live, spostare il cuddle leaden nell'area di visione appropriata. Per il primo cuddle leaden, utilizzare le manopole manuali del microscopio stereoscopico per regolare il fuoco e impostare l'ingrandimento a 1,6 x. Una volta definita la regione di interesse, fare clic sul pulsante aggiungi questa posizione.

Il software aggiungerà le coordinate di questa regione a un file di programmazione delle posizioni e la piattaforma tornerà al centro della piastra, impostando le posizioni per tutti i restanti coen sulle piastre. Utilizzando i pulsanti di spostamento, regolare la messa a fuoco per i restanti coan sulla stessa piastra mediante le tre viti di livellamento manuale situate al di sotto di ciascuna piastra sulla piattaforma robotica. Dopo aver inserito tutte le coordinate di tutti i coan, salvare le coordinate della programmazione delle posizioni.

Impostare i parametri di acquisizione delle immagini, come il tipo di luce, che è blu per la GFP, e le impostazioni di esposizione, specificando inoltre dove salvare le immagini come descritto nel protocollo scritto allegato. Passare alla scheda di controllo del tempo di acquisizione e impostare l'intervallo di tempo tra un'acquisizione e l'altra e il numero totale di cicli di raccolta delle immagini. Di solito le immagini vengono raccolte ogni ora per 100 ore.

Generazione di profili di espressione genica ben definiti. Avviare l'acquisizione delle immagini aprendo la scheda del piano posizionale e quindi facendo clic sul pulsante esegui piano. Isolare il sistema di acquisizione delle immagini da fonti di luce estranee al termine della raccolta delle immagini di 100 ore.

Le immagini ad alta risoluzione, ciascuna di circa cinque megabyte, sono pronte per l'analisi dell'immagine. Utilizzare ImageReady per assemblare le 100 immagini sequenziali provenienti da ciascuna cartella. Importare tutte le immagini sequenziali come fotogrammi e ridimensionarle a 800 per 600 pixel per velocizzare l'elaborazione delle immagini.

Successivamente, utilizzare i segni su un nuovo livello introdotto, visibile in tutti i fotogrammi, basandosi sui punti selezionati di GFP nell'immagine di riferimento. Allineare manualmente ogni immagine; al termine dell'allineamento, eliminare il livello utilizzato come riferimento e salvare il file come un singolo file PSD. Inoltre, esportare tutti i fotogrammi come un singolo file MOV utilizzando la risoluzione più elevata.

I file sono ora pronti per iniziare la quantificazione della GFP. Utilizzare ImageJ per aprire il file MOV e ritagliare un'area di 400 per 300 pixel. Successivamente, separare le immagini sequenziali nei canali rosso, blu e verde utilizzando lo strumento di suddivisione RGB per i canali rosso e verde.

Sottrarre la fluorescenza di fondo utilizzando lo strumento plugin sottrai ROI misurata per ogni sezione. Calcolare l'espressione di GFP regolando i livelli di soglia e utilizzando un plugin progettato per misurare il valore medio in scala di grigi per pixel e il numero totale di pixel che esprimono GFP. Copiare i valori di output in ImageJ. Infine, incollare i valori di output per i canali verde e rosso in Microsoft Office.

Excel per ulteriori manipolazioni dei dati, in modo da dare un'idea dei risultati dell'allineamento delle immagini. Questa prima animazione mostra l'inaccuratezza del riposizionamento della piattaforma robotica durante l'esperimento della durata di 100 ore. Il movimento dei punti è un artefatto derivante dall'incapacità della piattaforma robotica di tornare esattamente alla stessa posizione in ciascun punto temporale dopo l'allineamento manuale delle immagini; le cellule che esprimono GFP possono essere facilmente osservate e le caratteristiche uniche di questo sistema di tracciamento risultano chiaramente visibili.

Man mano che l'animazione si ripete, osservare le cellule che esprimono GFP e che sono cerchiate: la cellula cerchiata in rosso mostra un rapido calo dell'espressione tra le 18 e le 20 ore dopo il bombardamento, mentre la cellula cerchiata in bianco mostra un'espressione ritardata di GFP. Oltre alle animazioni, questa procedura consente una rapida quantificazione dell'espressione di GFP nel tempo nel tessuto bersaglio del fagiolo di Lima. Questi risultati rappresentativi mostrano la quantificazione comparativa dell'intensità dei promotori utilizzando il promotore CAMV 35S e quattro diversi promotori della soia.

Abbiamo appena mostrato come introdurre il DNA nei cotiledoni di piante germinate. I semi con la nervatura di Lima posizionano il cotiledone sul robot, acquisiscono immagini per l'analisi dell'immagine ed elaborano tali immagini. Utilizziamo regolarmente questa procedura nel nostro laboratorio per convalidare i promotori vegetali dei cloni.

È possibile generare una grande quantità di dati dall'introduzione di diversi promotori vegetali. Tuttavia, questa procedura è complessa e comprende molte fasi che possono presentare problemi; quando si esegue questa procedura, è importante iniziare con semi freschi di fagiolo oppure utilizzare almeno semi di alta qualità conservati correttamente. È inoltre fondamentale posizionare rapidamente il coperchio tagliato per il bombardamento e configurarlo sul robot, utilizzando il coperchio spesso della piastra petri per ridurre al minimo i problemi di condensa.

E infine, si noti che la GFP che utilizziamo è un'altra versione chiamata SGFP, proveniente dal Gen HIN Lab della Harvard University. Questa GFP non è molto stabile e potrebbe essere più adatta per monitorare rapidi cambiamenti nell'espressione genica. E questo è tutto da parte nostra per averci seguito.

In bocca al lupo per i vostri esperimenti.