Robotica e Image Analysis dinamica per gli Studi di espressione genica nei tessuti vegetali

In questa procedura, le dinamiche dell'espressione genica nei tessuti vegetali vengono visualizzate nel tempo con l'uso della robotica, i primi semi di fagiolo di Lima vengono sterilizzati e posti tra tovaglioli di carta inumiditi in un contenitore di coltura tissutale per la germinazione. Dopo quattro giorni, i coani vengono rimossi e bombardati con un costrutto di DNA contenente un promotore fuso con GFP I coani posti in piastre di Petri sono montati su un sistema di raccolta di immagini robotiche bidimensionale progettato su misura. Il robot è programmato per acquisire immagini di ogni pezzo di tessuto ogni ora per 100 ore.

Le immagini sono sottoposte ad analisi di immagini, fornendo dati quantitativi sull'intensità dell'espressione di GFP nel tempo. Ciao, sono John Finer, direttore del Laboratorio di Trasformazione delle Piante presso il Dipartimento di Orticoltura e Scienze delle Colture dell'Ohio State University. Sono Carlos Herandez Garcia, dottorando nel laboratorio finale dell'Ohio State University.

Oggi Carlos vi mostrerà il protocollo che abbiamo sviluppato per l'analisi dell'espressione genica e dei tessuti vegetali utilizzando la proteina fluorescente verde. Utilizziamo questa procedura che abbiamo sviluppato in laboratorio per misurare la deformazione dell'attività OD. Per fare questo promotore la nostra prima corona a monte del gene GFP, che è il nostro gene reporter.

Ti mostrerò come introduciamo il controllo del promotore nella vena di Lima Cataly e invierò un'app sul nostro sistema di acquisizione di immagini robotiche dal design personalizzato. Concluderò esaminando il nostro protocollo per l'analisi delle immagini. Quindi andiamo Per iniziare questa procedura semi di fagioli di Lima sterilizzati in superficie utilizzando procedure standard.

Metti i semi sterilizzati in contenitori magenta GA seven tra strati di carta assorbente umida e incubali per quattro giorni a 25 gradi Celsius. Qui utilizziamo un vettore di espressione ad alto numero di copie, utile per l'analisi dei promotori e degli elementi del promotore. Questo vettore contiene il gene GFP, che viene utilizzato per visualizzare la funzione del promotore o dell'elemento promotore nei tessuti trasformati circa una o due ore prima del bombardamento.

Accisa piombo CU fagiolo di Lima dai rivestimenti dei semi. La piombo CU adatta al bombardamento deve essere di colore da giallo a verde chiaro, piatta e priva di danni che potrebbero interferire con l'ulteriore analisi dell'immagine immediatamente dopo l'escissione, posizionare 12 piombo cu in una capsula di Petri con terreno di coltura OMS contenente sali MS, cinque vitamine, saccarosio al 3% e gel allo 0,2% a pH 5,7. Quindi, precipitare il costrutto di DNA su particelle di tungsteno M 10 Innanzitutto, subito prima dell'uso, risospendere le particelle in acqua sterile a una concentrazione di 100 milligrammi per millilitro.

Quindi, in una provetta da 0,6 millilitri, aggiungere 25 microlitri di particelle, cinque microlitri di DNA a un microgrammo per microlitro, 25 microlitri di cloruro di calcio molare da 2,5 molari e 10 microlitri di spermatozoi da 100 millimolari. Incubare il preparato di DNA su ghiaccio per cinque minuti, quindi rimuovere e scartare 50 microlitri di soluzione sopra le particelle. Risospendere le particelle rivestite di DNA che rimangono sul fondo del tubo mediante vortex.

E subito dopo il vortex, rimuovere un Eloqua da due microlitri. Ripetere questo passaggio di vortice. Ogni volta che un Eloqua viene rimosso, le particelle rivestite devono essere conservate sul ghiaccio e utilizzate entro 15 minuti.

Ora che il DNA è rivestito sulle particelle, posizionare due microlitri di particelle attraverso la parte superiore di un filtro per siringa al centro di uno schermo filtrante. Quindi posizionare il filtro della siringa nell'unità di supporto del filtro all'interno della pistola di afflusso di particelle o della camera PIG. Posizionare un fagiolo di Lima con il lato assiale rivolto verso l'alto su un deflettore costituito da uno schermo fuso sul fondo di un becher.

Posizionare il deflettore, che viene utilizzato come piattaforma per sostenere i tessuti durante il bombardamento, nella camera del cannone a particelle. Per bombardare il tessuto aprire prima la valvola che porta al vuoto per evacuare la camera. Quando il vuoto raggiunge i 760 millimetri di mercurio, attivare il solenoide e rilasciare l'elio per spingere le particelle.

La pressione dell'elio utilizzata per accelerare le particelle è compresa tra 50 e 60 PSI. Dopo il bombardamento di particelle, chiudere la valvola della linea del vuoto e rilasciare il vuoto utilizzando la valvola di scarico. Quando il vuoto viene rilasciato, aprire lo sportello della camera per recuperare il piombo bombardato e restituire il piombo in un lato dal.

Terreno di coltura fino a OMS per la quantificazione e la profilazione dell'espressione. Bombardare un minimo di tre coleadina per ogni costrutto di DNA. È incluso anche un controllo positivo, che fornisce un profilo di espressione genica ben studiato.

Le coleadin sono ora pronte per l'imaging. Accendi la lampada al mercurio e attendi 30 minuti affinché la lampada si riscaldi. Accendi le fonti di alimentazione per la telecamera SPOT R-T-C-C-D e il controller del motore, che guida il movimento della piattaforma robotica progettata su misura, che contiene otto piastre.

Impostare il set di filtri per il rilevamento della GFP selezionando il set di due filtri GFP a 480 nanometri di eccitazione e 510 nanometri di emissione su un microscopio a tre dissezioni MZ L. Quindi, sterilizzare i coperchi delle piastre di Petri in policarbonato addensato spruzzandoli con etanolo al 70%. I coperchi specializzati utilizzati per coprire la base della capsula di Petri, prevengono la condensa durante la raccolta delle immagini.

Posizionare le piastre contenenti cuan bombardato sulla piattaforma robotica e serrare la vite di fermo laterale per fissarle in posizione. Ora apri l'applicazione software personalizzata che controlla sia la piattaforma robotica che l'acquisizione delle immagini. Aprire anche l'interruttore del controller della luce bianca del software utilizzando il software, orientare la piattaforma in posizione iniziale.

Questo viene fatto prima di entrare nelle posizioni. Per ogni ingresso di coccola nella scheda del motore, selezionare la prima piastra. La piattaforma posizionerà il centro della capsula di Petri sotto l'obiettivo del microscopio.

Utilizzando i pulsanti della distanza di spostamento, posizionare con precisione il primo CU LEADIN per la raccolta delle immagini. Utilizzando la funzione della modalità live, spostare il piombo delle coccole nell'area di visualizzazione appropriata Per il primo piombo delle coccole, utilizzare le manopole manuali sul microscopio da dissezione per impostare la messa a fuoco e impostare l'ingrandimento su 1,6x. Una volta impostata la regione di interesse, fare clic sul pulsante Aggiungi questa posizione.

Il software aggiungerà le coordinate di questa regione a un file di pianificazione delle posizioni e la piattaforma tornerà al centro delle posizioni del set di piastre per tutti i coen rimanenti sulle piastre. Utilizzando i pulsanti della distanza di spostamento, utilizzare le tre viti di livellamento manuale situate sotto ciascuna piastra sulla piattaforma robotica per regolare la messa a fuoco del coan rimanente sulla stessa piastra. Dopo aver inserito tutte le coordinate di tutti i coani, salvare le coordinate della pianificazione della posizione.

Immettere i parametri di raccolta delle immagini, come il tipo di luce, che è blu per GFP e l'impostazione dell'esposizione, nonché specificare dove memorizzare le immagini come descritto nel protocollo scritto allegato. Vai alla scheda di controllo del tempo di acquisizione e imposta l'intervallo di tempo di acquisizione dell'immagine e il numero totale di cicli di raccolta delle immagini. Le immagini vengono in genere raccolte ogni ora per 100 ore.

Generazione di profili di espressione genica ben definiti. Avviare l'acquisizione dell'immagine aprendo la scheda di pianificazione della posizione e quindi facendo clic sul pulsante Esegui pianificazione. Isolare il sistema di raccolta delle immagini dalla luce estranea al termine della raccolta delle immagini di 100 ore.

Le immagini ad alta risoluzione di circa cinque megabyte ciascuna sono pronte per l'analisi delle immagini. Usa l'immagine pronta per assemblare le 100 immagini sequenziali di ogni cartella. Importa tutte le immagini sequenziali come fotogrammi e ridimensionale a 800 x 600 pixel per velocizzare l'elaborazione delle immagini.

Quindi, utilizza gli indicatori su un nuovo livello introdotto, che è visibile in tutti i fotogrammi e utilizza i punti GFP selezionati nel riferimento dell'immagine. Allinea manualmente ogni immagine al termine dell'allineamento, elimina il livello utilizzato come riferimento e salva il file come un singolo file PSD. Inoltre, esporta tutti i fotogrammi come un singolo file MOV utilizzando la risoluzione più alta.

I file sono ora pronti per avviare la quantificazione GFP. Usa l'immagine J per aprire il file MOV e ritagliare un'area di 400 x 300 pixel. Quindi separa le immagini sequenziali in canali rosso, blu e verde utilizzando lo strumento di divisione RGB per i canali rosso e verde.

Sottrai la fluorescenza di fondo utilizzando la sottrazione del ROI misurato per ogni strumento plug-in slice. Calcola l'espressione GFP regolando i livelli di soglia e utilizzando un plug-in progettato per misurare il valore medio della scala di grigi per pixel e il numero totale di pixel che esprimono GFP. Copia i valori di output nell'immagine J.Infine incolla i valori di output per i canali verde e rosso in Microsoft Office.

Excel per un'ulteriore manipolazione dei dati per darti un'idea dei risultati dell'allineamento delle immagini. Questa prima animazione mostra l'imprecisione del riposizionamento della piattaforma robotica durante l'esperimento delle 100 ore. Il movimento spot è un artefatto derivante dall'incapacità della piattaforma robotica di tornare alla stessa identica posizione in ogni momento dopo l'allineamento manuale dell'immagine, le cellule che esprimono GFP possono essere facilmente osservate e le caratteristiche uniche di questo sistema di tracciamento sono facilmente visualizzabili.

Poiché questa animazione si ripete, la cellula che esprime GFP che è cerchiata, la cellula che è cerchiata in rosso mostra un declino molto rapido dell'espressione da 18 a 20 ore dopo il bombardamento, mentre la cellula che è cerchiata in bianco mostra un inizio ritardato dell'espressione di GFP. Oltre alle animazioni, questa procedura consente una rapida quantificazione dell'espressione di GFP nel tempo nel tessuto bersaglio del fagiolo di Lima. Questi risultati rappresentativi mostrano la quantificazione comparativa dell'intensità del promotore utilizzando il promotore CAMV 35 S e quattro diversi promotori della soia.

Ti abbiamo appena mostrato come introdurre il DNA nella catalina di germinare. I semi della vena di Lima posizionano la catalina sul robot, raccolgono le immagini per l'analisi delle immagini e analizzano tali immagini. Utilizziamo abitualmente questa procedura nel nostro laboratorio per convalidare i promotori di piante clone.

Si può generare una grande quantità di dati dall'introduzione di diversi promotori vegetali. Tuttavia, questa procedura è complicata con molti passaggi che possono andare storti quando si esegue questa procedura è importante iniziare con semi di fagioli freschi o almeno utilizzare semi di alta qualità che sono stati conservati correttamente. È anche importante ottenere il coperchio tagliato a bombarda e installarlo rapidamente sul robot e utilizzare lo spesso coperchio del piatto in animale domestico per ridurre al minimo i problemi di condensa.

E infine, si prega di notare che il GFP che utilizziamo è un'altra versione chiamata SGFP, front Gen HIN Lab presso l'Università di Harvard. Questa GFP non è molto stabile e può essere migliore per tracciare rapidi cambiamenti nell'espressione genica. E questo è per noi che ci guardiamo.

E buona fortuna con i tuoi esperimenti.