Completa l'analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte I: lignina

La determinazione del contenuto di lignina e della composizione delle pareti cellulari delle piante inizia con il materiale vegetale essiccato, che viene sottoposto a varie estrazioni. Il materiale risultante è costituito solo da pareti cellulari e poi viene diviso per determinare il contenuto di lignina. Il materiale della parete viene sottoposto a idrolisi da parte del bromuro di acetil e i mono solubilizzati vengono quantificati mediante spettrometria UV per la determinazione della composizione della lignina.

Il materiale delle pareti viene idrolizzato mediante citolisi. I componenti solubilizzati della lignina vengono quindi derivati nei loro derivati salini trimetilsali, che possono essere separati e quantificati utilizzando la gascromatografia in combinazione con la spettrometria di massa. La determinazione della composizione dei polisaccaridi della matrice e del contenuto di cellulosa è dimostrata in un altro video intitolato Analisi composizionale completa delle pareti cellulari vegetali, parte seconda dei carboidrati.

Ciao, sono Marcus Pauley, capo della struttura Wall Analytical presso il Great Lakes Bioenergy Research Center qui alla Michigan State University. Sono Cliff Foster, responsabile della struttura analitica delle pareti cellulari. Ti mostreremo la procedura su come determinare il contenuto e la composizione dei campioni di biomassa vegetale.

Le piante convertono l'energia luminosa del sole in energia chimica come la biomassa. La biomassa vegetale è costituita principalmente da pareti cellulari, una complessa rete di una varietà di polimeri che racchiude tutte le cellule vegetali. Qui determiniamo la composizione dei materiali delle pareti cellulari delle piante per valutare il potenziale di trasformazione di questa lignina Cellose X, che è una risorsa rinnovabile molto abbondante, in biocarburanti.

Oggi ci concentreremo sulla lignina polifenolica in un altro video intitolato Analisi composizionale completa delle pareti cellulari vegetali, seconda parte dei carboidrati. Ci concentreremo sull'analisi dei polisaccaridi. Per iniziare questa procedura, aggiungi tre sfere di acciaio inossidabile da 5,5 millimetri a un tubo con tappo a vite sared da due millilitri e circa 60-70 milligrammi di aria o materiale vegetale liofilizzato.

Il materiale può essere macinato in polvere fine utilizzando un occhio di fianco, un robot di macinazione ed erogazione. L'occhio prende il tubo e lo agita per 30 secondi, dove a causa delle sfere di metallo, il materiale viene macinato in una polvere fine, quindi il macinato, ma la polvere vegetale compatta viene allentata in una procedura alternativa non robotica a bassa produttività. Facilitare un retrò è presentato nella seconda parte, aggiungere 1,5 M di etanolo acquoso al 70% al vortice del materiale macinato accuratamente e centrifugare a temperatura ambiente.

Questo trattamento solubilizza la maggior parte delle proteine e gli organelli cellulari aspirano il surnatante e aggiungono un volume uno a uno al volume. La soluzione di metanolo di cloroformio al pellet insolubile in alcol agitare accuratamente per far girare nuovamente il pellet e centrifugare. Il cloroformio metanolo estrae i composti idrofobici come i lipidi dopo la centrifugazione, aspira il surnatante e rimette in sospensione il pellet e 500 microlitri di acetone.

Per asciugare il campione, far evaporare il solvente con un flusso d'aria a 35 gradi Celsius fino a quando non si asciuga, i campioni essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente fino a un'ulteriore elaborazione. Per avviare la rimozione dell'amido dal reus del campione, sospendere il pellet e 1,5 mil di acetato di sodio molare 0,1 pH cinque tappare le provette e riscaldarle in un blocco riscaldante per gelatinizzare l'amido. Dopo aver raffreddato la sospensione con ghiaccio, aggiungere la miscela enzimatica che degrada l'amido, tappare la provetta e incubare accuratamente la sospensione durante la notte.

Nell'agitatore a 37 gradi Celsius, un agitatore rotante garantisce una miscelazione corretta. Dopo l'incubazione notturna, terminare la digestione riscaldando in un blocco riscaldante a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi centrifugare e scartare il surnatante, che contiene un amido solubilizzato.

Lavare il pellet rimanente tre volte utilizzando 1,5 mil di acqua ogni volta mediante vortex, centrifugazione e decantazione come dimostrato in precedenza. Infine, risospendere il pellet in 500 microlitri di acetone ed evaporare il solvente con un getto d'aria a 35 gradi Celsius fino a quando non si asciuga. I campioni essiccati contenenti parete cellulare isolata o gamba, senza cellulosa sono pronti per ulteriori analisi e possono essere conservati a temperatura ambiente.

Iniziare pesando da uno a 1,5 milligrammi di materiale preparato per la parete cellulare. Il materiale può essere pesato a mano o in modo automatizzato con la parete dell'occhio, come dimostrato nella seconda parte. Sciacquare le pareti del tubo con 250 microlitri di acetone per raccogliere il materiale della parete cellulare sul fondo del tubo e far evaporare l'acetone molto delicatamente sotto il flusso d'aria.

Dopo che l'acetone è evaporato, aggiungere delicatamente 100 microlitri di acetil bromuro al 25% in volume appena fatto in acido acetico glaciale lungo le due pareti. Per evitare schizzi, un sottile bromuro scompone il polimero di lignina nei suoi mono acetilati. Quindi tappare il matraccio tarato e scaldare a 50 gradi Celsius per due ore.

Riscaldare un'altra ora con quattro messaggi di testo ogni 15 minuti e infine raffreddare con ghiaccio A temperatura ambiente dopo aver raffreddato il pallone, aggiungere 400 microlitri di idrossido di sodio a due molari e 70 microlitri di vortice di idrossililamina cloridrato 0,5 molari appena preparato, i matracci volumetrici. Successivamente, neutralizzare la soluzione riempiendo il pallone volumetrico esattamente fino al segno di due millilitri con il tappo di acido acetico glaciale e capovolgere più volte per miscelare la pipetta 200 microlitri della soluzione contenente i mono lali idrolizzati e solubilizzati in una piastra a 96 pozzetti specifica UV e leggere la piastra in un lettore di piastre a pozzetti a 280 nanometri. Leggere la targhetta almeno tre volte e fare la media dell'assorbanza poiché il particolato può causare una leggera variazione dei valori di assorbanza.

Determinare la percentuale di una lignina solubile in bromuro sottile o A BSL utilizzando il coefficiente di pianta appropriato con la formula presentata nel protocollo scritto. La lignina è una rete polifenolica costituita principalmente da tre subunità, P idrossifenolo, gua ACell e unità di involtino primavera che determinano la composizione della lignina nel materiale vegetale. Inizia trasferendo circa due milligrammi di materiale della parete cellulare in una provetta di vetro con tappo a vite per la citolisi.

Successivamente, preparati a preparare il trifluoruro di boro al 2,5% di aiato e la soluzione di tiolo di etano al 10% in diossano. Poiché il diossano è molto pericoloso, non prelevare campioni o attrezzature dal cofano. Ricordati di lavorare con molta attenzione e usa un palloncino riempito di azoto gassoso per spostare il volume perso nella bombola di diossano con azoto.

Preparare la soluzione mescolando i seguenti volumi per campione: 175 microlitri, diossano, 20 microlitri, ETSH cinque microlitri, BF tre. Dopo la miscelazione, aggiungere 200 microlitri di soluzione a ciascun campione. Spurgare lo spazio di testa del flaconcino con azoto gassoso e tappo.

Procedere immediatamente al riscaldamento dei campioni a 100 gradi Celsius per quattro ore con una miscelazione delicata ogni fine ora. Theo ace lysis reaction by on ice per cinque minuti. Quindi aggiungere 150 microlitri di bicarbonato di sodio molare 0,4 per neutralizzare e vortice.

Per la pulizia dei prodotti di degradazione della lignina, aggiungere un mil di acqua e 0,5 mil di vortice di acetato e lasciare che le fasi si separino. Lo strato di acetato di etile sarà in alto e l'acqua in basso. Trasferire 150 microlitri dello strato superiore di acetato di Ethel contenente i componenti della lignina in un tubo da due mil, assicurandosi che non venga trasferita acqua.

Dopo il trasferimento dallo strato superiore di acetato di Ethel, far evaporare il solvente utilizzando un concentratore con aria. Aggiungere 200 microlitri di acetone ed evaporare. Ripetere il trattamento con acetone due volte per rimuovere l'acqua in eccesso.

Successivamente derivare i componenti della lignina dai loro derivati volatili del trimetile Cy Lane. Aggiungere 500 microlitri di acetato di etile, 20 microlitri di purina e 100 microlitri di NO biss trimetilcil acetammide a ciascun tubo. Incubare per due ore a 25 gradi Celsius.

Al termine delle due ore, trasferire 100 microlitri di reazione in una fiala GC MS e aggiungere 100 microlitri di acetone. Analizzare i campioni mediante GC dotato di spettrometro di massa quadruplo o rivelatore a ionizzazione di fiamma. Per la colonna e i dettagli della corsa, consultare il protocollo scritto allegato.

Ecco alcuni risultati rappresentativi dell'analisi della lignina utilizzando il legno di pioppo come materiale vegetale. Secondo questa analisi, il 22% del materiale di pioppo è costituito dal polifenolo lignina. La composizione dei componenti della lignina è stata analizzata mediante GCMS.

I picchi sono identificati da tempi di ritenzione relativi utilizzando lo standard interno del tetracoano o da icone caratteristiche dello spettro di massa di 2 99 MZ, 2 69 MZ e 2 39 MZ rispettivamente per i monomeri sg e h. La composizione dei componenti della lignina viene quantificata impostando l'area totale del picco al 100%L'analisi composizionale mostra che questo particolare campione contiene principalmente unità di stringa o S. Tuttavia, sono abbondanti anche le unità Goya, aol o G.

Ovviamente, la quantità e la composizione dell'unità monoliale possono variare a seconda del tessuto vegetale e della specie. Vi abbiamo appena mostrato come determinare il contenuto di lignina e la composizione del materiale vegetale per l'analisi dei polisaccaridi. Passa alla seconda parte.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.