Completa l'analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte I: lignina

La determinazione del contenuto e della composizione della lignina nelle pareti cellulari vegetali inizia con materiale vegetale essiccato, al quale vengono sottoposti diversi processi di estrazione. Il materiale ottenuto è costituito esclusivamente da pareti cellulari, che vengono poi frazionati per determinarne il contenuto di lignina. Il materiale delle pareti viene sottoposto a idrolisi con bromuro di acetile e i monomeri solubilizzati vengono quantificati mediante spettrometria UV per determinare la composizione della lignina.

Il materiale della parete viene idrolizzato mediante citolisi. I componenti della lignina solubilizzati vengono quindi derivatizzati in derivati volatili di trimetilsilano, che possono essere separati e quantificati mediante cromatografia gassosa abbinata a spettrometria di massa. La determinazione della composizione dei polisaccaridi della matrice e del contenuto di cellulosa è illustrata in un altro video intitolato Analisi Composizionale Completa delle Pareti Cellulari delle Piante, parte Due Carboidrati.

Ciao, sono Marcus Pauley, responsabile della struttura analitica Wall presso il Great Lakes Bioenergy Research Center della Michigan State University. Sono Cliff Foster, responsabile della struttura analitica per la parete cellulare. Vi mostreremo il procedimento per determinare il contenuto e la composizione dei campioni di biomassa vegetale.

Le piante convertono l'energia luminosa del sole in energia chimica, come la biomassa. La biomassa vegetale è costituita principalmente dalle pareti cellulari, una rete complessa di diversi polimeri che circondano tutte le cellule vegetali. In questo studio determiniamo la composizione dei materiali della parete cellulare vegetale per valutare la possibilità di trasformare questa lignina Cellose X, una risorsa rinnovabile altamente abbondante, in biocarburanti.

Oggi ci concentreremo sul polifenolo lignina in un altro video intitolato Analisi Compositiva Completa delle Pareti Cellulari delle Piante, parte due carboidrati. Ci concentreremo sull'analisi dei polisaccaridi. Per iniziare questa procedura, aggiungere tre sfere d'acciaio inox da 5,5 millimetri a un tubo filettato da 2 millilitri e circa 60-70 milligrammi di materiale vegetale essiccato all'aria o liofilizzato.

Il materiale può essere ridotto in polvere fine utilizzando eyewall, un robot per la macinazione e la dispensazione. Eyewall prende il tubo e lo agita per 30 secondi, durante i quali, grazie alle sfere di metallo, il materiale viene macinato in polvere fine; successivamente la polvere vegetale macinata ma compatta viene allentata mediante una procedura alternativa manuale a bassa produttività. Nella seconda parte viene illustrata una procedura semplificata: aggiungere 1,5 M di etanolo acquoso al 70% al materiale macinato, vortexare accuratamente e centrifugare a temperatura ambiente.

Questo trattamento solubilizza la maggior parte delle proteine e degli organelli cellulari; aspirare il soprannatante e aggiungere un volume uguale di soluzione cloroformio-metanolo al pellet insolubile nell'alcol. Agitare accuratamente per risospendere il pellet e centrifugare. Il cloroformio-metanolo estrae i composti idrofobici, come i lipidi; dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di acetone.

Per asciugare il campione, evaporare il solvente con un flusso d'aria a 35 gradi Celsius fino a completa essiccazione; i campioni essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente fino all'ulteriore elaborazione. Per avviare la rimozione dell'amido dal campione reus, sospendere il pellet in 1,5 ml di acetato di sodio 0,1 M, pH 5, chiudere i tubi ed esporli a un blocco riscaldante per gelatinizzare l'amido. Dopo aver raffreddato la sospensione su ghiaccio, aggiungere la miscela enzimatica degradante l'amido, chiudere il tubo e vortexare accuratamente; incubare la sospensione tutta la notte.

Nello shaker a 37 gradi Celsius, uno shaker rotante garantisce un'adeguata miscelazione. Dopo l'incubazione notturna, interrompere la digestione riscaldando in un blocco termoregolato a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi centrifugare e scartare il surnatante, che contiene amido solubilizzato.

Lavare il pellet rimanente tre volte utilizzando 1,5 mL di acqua ogni volta, agitando con vortex, centrifugando e decantando come mostrato in precedenza. Infine, risospendere il pellet in 500 microlitri di acetone ed evaporare il solvente con un flusso d'aria a 35 gradi Celsius fino a completa essiccazione. I campioni essiccati contenenti parete cellulare isolata o zampa, privi di cellulose, sono pronti per ulteriori analisi e possono essere conservati a temperatura ambiente.

Iniziare pesando da uno a 1,5 milligrammi di materiale di parete cellulare preparato. Il materiale può essere pesato manualmente o in modo automatizzato con la parete oculare, come dimostrato nella seconda parte. Risciacquare le pareti del tubo con 250 microlitri di acetone per raccogliere il materiale di parete cellulare sul fondo del tubo ed evaporare delicatamente l'acetone sotto flusso d'aria.

Dopo che l'acetone è evaporato, aggiungere delicatamente 100 microlitri di bromuro di acetile appena preparato al 25% in volume/volume in acido acetico glaciale lungo le due pareti. Per evitare schizzi, un lieve attacco da parte del bromuro degrada il polimero della lignina nei suoi monomeri acetilati. Quindi chiudere il matraccio con un tappo e riscaldare a 50 gradi Celsius per due ore.

Riscaldare ulteriormente per un'ora, agitando ogni 15 minuti, quindi raffreddare in ghiaccio. A temperatura ambiente, dopo aver raffreddato il pallone, aggiungere 400 microlitri di idrossido di sodio 2 molar e 70 microlitri di cloridrato di idrossilammina 0,5 molar appena preparato; vortexare i matracci. Successivamente, neutralizzare la soluzione portando esattamente il volume del matraccio fino al segno dei 2 millilitri con acido acetico glaciale, chiudere con il tappo e capovolgere più volte per mescolare. Pipettare 200 microlitri della soluzione contenente i monoaldeidi idrolizzati e solubilizzati in una piastra UV da 96 pozzetti specifica, e leggere la piastra in un lettore per piastre a 280 nanometri. Leggere la piastra almeno tre volte e calcolare la media dell'assorbanza, poiché le particelle in sospensione possono causare una leggera variazione dei valori di assorbanza.

Determinare la percentuale di una lignina solubile in bromuro sottile o A BSL utilizzando il coefficiente vegetale appropriato con la formula presentata nel protocollo scritto. La lignina è una rete polifenolica costituita principalmente da tre sottounità: P idrossifenolo, gua ACell e unità spring roll, al fine di determinare la composizione della lignina nel materiale vegetale. Iniziare trasferendo circa due milligrammi di materiale di parete cellulare in un tubo di vetro con tappo a vite per citolisi.

Successivamente, prepararsi a preparare la soluzione di fluoruro di boro trifluoruro etilato al 2,5% e di etanotiol al 10% in dioxano. Poiché il dioxano è molto pericoloso, non prelevare campioni o apparecchiature all'esterno della cappa. Ricordarsi di lavorare con molta attenzione e utilizzare un palloncino riempito con gas azoto per compensare il volume perso nella bottiglia di dioxano con azoto.

Preparare la soluzione mescolando i seguenti volumi per campione: 175 microlitri di dioxano, 20 microlitri di ETSH e cinque microlitri di BF3. Dopo aver mescolato, aggiungere 200 microlitri della soluzione a ciascun campione. Spurgare lo spazio di testa del vial con gas azoto e chiudere con il tappo.

Procedere immediatamente a riscaldare i campioni a 100 gradi Celsius per quattro ore, con mescolamento delicato ogni ora. Terminare la reazione di lisi su ghiaccio per cinque minuti. Quindi aggiungere 150 microlitri di bicarbonato di sodio 0,4 molare per neutralizzare e vortexare.

Per la purificazione dei prodotti derivanti dalla degradazione della lignina, aggiungere un mil di acqua e 0,5 mil di acetato, vortexare e lasciare separare le fasi. Lo strato di acetato di etile sarà nella parte superiore e l'acqua in quella inferiore. Trasferire 150 microlitri dello strato superiore di acetato di etile contenente i componenti della lignina in un tubo da due mil, assicurandosi che non venga trasferita alcuna quantità di acqua.

Dopo il trasferimento dallo strato superiore di acetato di etile, evaporare il solvente utilizzando un concentratore con aria. Aggiungere 200 microlitri di acetone ed evaporare. Ripetere il trattamento con acetone due volte per rimuovere l'eccesso di acqua.

Successivamente, convertire i componenti della lignina nei loro derivati volatili di trimetil silano. Aggiungere 500 microlitri di acetato di etile, 20 microlitri di purina e 100 microlitri di NO-bis(trimetil)silil acetammide a ogni provetta. Incubare per due ore a 25 gradi Celsius.

Al termine delle due ore, trasferire 100 microlitri della reazione in un vial per GC-MS e aggiungere 100 microlitri di acetone. Analizzare i campioni mediante GC dotato di spettrometro di massa quadrupolo o detector a ionizzazione di fiamma. Per informazioni sulla colonna e sui dettagli della corsa, consultare il protocollo scritto allegato.

Ecco alcuni risultati rappresentativi dell'analisi della lignina utilizzando il legno di pioppo come materiale vegetale. Secondo questa analisi, il 22% del materiale di pioppo è costituito dalla polifenolo lignina. La composizione dei componenti della lignina è stata analizzata mediante GCMS.

I picchi vengono identificati in base ai tempi di ritenzione relativi utilizzando un tetra coano come standard interno oppure tramite le caratteristiche icone dello spettro di massa a 299 m/z, 269 m/z e 239 m/z rispettivamente per i monomeri S e G. La composizione dei componenti della lignina viene quantificata impostando l'area totale dei picchi al 100%. L'analisi compositiva mostra che questo particolare campione contiene principalmente unità siringile o S. Tuttavia, sono anche abbondanti unità Goya, aol o G.

Ovviamente, la quantità e la composizione delle unità monolignoliche possono variare a seconda del tessuto vegetale e della specie. Vi abbiamo appena mostrato come determinare il contenuto e la composizione della lignina nel materiale vegetale per l'analisi dei polisaccaridi. Passate alla seconda parte.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.