Name: Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per letichettatura di anticorpi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Impara la tecnica di squash per preparare i cromosomi politene di Drosophila melanogaster per l'etichettatura con anticorpi. Questo metodo consente di studiare modificazioni epigenetiche e struttura della cromatina.

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Ringraziamo la signora V. Lephart di mantenimento delle scorte volare Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes for Health di sovvenzione (GM62916) e la National Science Foundation di sovvenzione (MCB0817107).

Il protocollo seguito per la preparazione di politene da squash cromosoma è adattato dalla procedura descritta in Johansen et al. (2009). 1. Cultura del terzo larve instar Drosophila Al fine di ottenere ottimali cromosomi politenici per le preparazioni di alta qualità da squash, condizioni di coltura poco affollate sono essenziali (cioè, posto a circa 20 la deposizione delle uova le mosche femmina in uno standard 4 "bottiglia di volare e passare a una nuova bottiglia ogni giorno). Selezionare la più grassa individui dal primo raccolto di arrampicata 3 larve instar mentre sono ancora vaganti, ma appena prima di impupamento. rotazione abbiamo cultura a 21 ° C, ma 18 ° C produrrà più grassi cromosomi che possono essere più adatti per alcuni scopi come ad esempio quando la banda / regioni interbanda devono essere visualizzate ad alta risoluzione. 2. Materiali da squash polytene <ul><li> Pinza dissezione Drummond (2) </li><li> Petri (60 x 15 mm) </li><li> Vetrini da microscopio Frosted (Fisher n ° 12-544-3) (poli-lisina rivestita) </li><li> 22 x 22 mm n. 15 coprioggetto (Fisher n ° 12-520B) (rivestito con Sigmacote; Sigma # SL2) </li><li> 22 x 40 mm n. 15 coprioggetto (Fisher n ° 12-530B) </li><li> Kim-salviette </li><li> Microscopio a contrasto di fase con obiettivo 20X </li><li> Piccolo Dewar (ad esempio, borraccia o thermos vuoto bottiglia) </li><li> Pinze lunghe </li><li> Lamette da barba </li><li> Coplin Jar </li><li> Gomma-Colf o vassoio Tupperware (o equivalente cassetto richiudibile) </li><li> Parafilm (tagliato in 22 piazze mm) </li><li> 175 g di peso </li></ul> 3. Fissativi e soluzioni <ol><li> Magazzino formaldeide 5X. Preparare una soluzione fresca di 0,74 g. paraformaldeide in 4,0 ml di dH 2 O e con 28 ml di KOH 1N. Calda a 65 ° C per sciogliere la paraformaldeide e quindi memorizzare su ghiaccio. </li><li> Fissativo 1. Preparare una soluzione fresca di 0,5 ml di PBS 10X, 50μl Triton X-100, 3,45 ml di dH 2 O e 1,0 ml di uno stock di formaldeide 5X. Caldo per disperdere i Triton X-100 e l'utilizzo entro 1 ora. </li><li> Fissativo 2. Preparare una soluzione fresca di 1,5 ml di dH 2 O, 2,5 ml di acido acetico glaciale, e 1,0 ml da uno stock di formaldeide 5X e utilizzare entro 1 ora. </li><li> Soluzione di acido Lactoacetic. Preparare una soluzione di 1 ml di acido lattico, 2 ml di dH 2 O, e 3 ml di acido acetico. </li></ol> 4. Polytene cromosoma preparazione di squash: <ol><li> Risciacquare con acqua larve e trasferimento in PBS in un piatto di coltura per la dissezione. </li><li> Afferrare la punta della bocca ganci con un paio di pinze, tenere il corpo circa 2 / 3 del modo verso il basso con l'altra coppia, e tirare sulla bocca ganci così le ghiandole salivari sono esposti. Separare le ghiandole salivari dal cervello e occhi antennali dischi, e sezionare via il corpo di grasso e qualsiasi altri tessuti associati dalle ghiandole. </li><li> Aggiungere 200 microlitri di Fissativo 1 al primo pozzo di una diapositiva due depressione bene e 200-300 microlitri di Fissativo da 2 a ben due. Trasferimento di una coppia di ghiandole salivari in un momento di Fissativo 1 nel bene uno e incubare per la quantità di tempo necessario per l'epitopo bersaglio, di solito circa 1-2 minuti. (Nota: alcuni epitopi, come per la maggior parte delle modificazioni degli istoni, può richiedere 5 minuti o più a lungo fissazione.) </li><li> Pinze utilizzando il trasferimento delle ghiandole salivari di Fissativo 2 in ben 2 e incubare per due minuti. </li><li> Trasferire le ghiandole a 10-30 ml di soluzione acida Lactoacetic su un vetrino pulito Sigmacoted. Abbassare delicatamente uno polilisina rivestita vetrino da microscopio sul vetrino e, senza applicare pressione verticale, sollevare il vetrino così le ghiandole sono tra il vetrino ed il coprioggetto. Immediatamente facilitare la lisi cellulare e cromosomiche diffondere con attenzione afferrando il vetrino con una pinza su un lato delicatamente e spostando leggermente avanti e indietro, cercando di minimizzare qualsiasi pressione verticale sul tessuto. In alternativa, utilizzare il lato gomma di una matita o anche un dito per spostare delicatamente il coprioggetto avanti e indietro. Si noti che qualsiasi ritardo nello spostamento del coprioggetto avanti e indietro è probabile che a diminuire la diffusione delle braccia cromosomiche come tenderanno a diventare più rigida su esposizione alla soluzione di acido Lactoacetic. Intorbidimento della soluzione è spesso una buona indicazione di separazione delle cellule. Picchiettando leggermente sulla coprioggetto obliquamente (per evitare una pressione verticale) con il lato gomma di una matita un paio di volte può anche aiutare nella diffusione dei cromosomi. </li><li> Immediatamente esaminare il tessuto al microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 20 o 40X per determinare se i cromosomi sono ben diffuse. </li><li> Quando il cromosomico diffusione è sufficiente impostare la diapositiva con il lato coprioggetti in giù su una pila di pulizia Kim-salviette. Posto un secondo Kim-wipe sulla parte superiore e appiattire cromosomi, ponendo il pollice su dove è posizionato il coprioggetto e premendo con decisione, evitando qualsiasi movimento orizzontale del vetrino che al taglioi cromosomi. </li><li> Esaminare il vetrino di nuovo sotto il microscopio per determinare se il preparato è adatto per lo scopo previsto. Se i cromosomi sono mossi in maniera significativa su schiacciamento, l'uso meno volume di soluzione acida Lactoacetic nella vostra preparazione successive. Ripetere i passaggi 4,1-4,8 fino a quando un numero sufficiente di diapositive adatte sono stati ottenuti. Mettere 175 g di peso sul vetrino delle diapositive. </li><li> Riempire un piccolo Dewar (ad esempio, thermos) con azoto liquido. Utilizzando una pinza lunga, tuffo scivolare in N 2 liquido fino a quando la smette di ebollizione, togliere diapositiva e utilizzare immediatamente il bordo di una lama di rasoio pulito in un angolo a buttar via il coprioggetto. Se diapositive sarà utilizzato immediatamente, mettere in una vaschetta Coplin con PBS a 4 ° C. Mettere insieme il vetrino in una vaschetta Coplin pieno di etanolo al 95%. Esaminare il vetrino una volta che il gelo ha sublimato via per confermare che il tessuto aderito alla diapositiva e non rimanere con il coprioggetto. Ripetete con il resto delle diapositive fino a quando tutte le diapositive vengono memorizzati in PBS (per l'uso entro alcune ore) o etanolo (per la conservazione a lungo termine). </li></ol> Rappresentante Risultati Il primo passo fondamentale per l'ottenimento di alta qualità polytene preparazione zucca è di far crescere le larve di grasso con grandi nuclei delle ghiandole salivari. Il secondo è una buona tecnica con la procedura di diffusione, che può richiedere una certa pratica. Un consiglio per una migliore diffusione successo è quello di trovare il volume minimo di soluzione di acido lactoacetic durante la fase di schiacciamento. Ciò promuoverà sufficiente diffusione dei cromosomi senza generare eccessive forze di streaming in grado di lavare via le armi dei cromosomi. E 'anche opportuno ricordare che i ritardi nello spostamento del coprioggetto avanti e indietro riduce la diffusione delle braccia cromosomiche man mano che diventano più rigidi quando sono esposti alla soluzione acida Lactoacetic. Se tutto va bene, ci dovrebbe essere numerosi cromosomi ben distribuiti politenici. La Figura 1 mostra un esempio di una tale preparazione, doppie etichettato con un marcatore per le regioni interbanda in verde e con un colorante che macchia le regioni a bande di colore blu. Se insufficiente diffusione è ottenuto, i cromosomi sarà simile a palline, come mostrato nella Figura 2. D'altra parte, se troppo diffusione si è verificata, il chomosomes sarà troppo sottile e prolungato o in alcuni casi frammentato in piccoli pezzi, come mostrato nella Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparazione zucca polytene doppio etichettati con anticorpi al JIL-1 istone H3S10 chinasi (in rosso) e Hoechst (blu). <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Zucca politene con diffusione insufficiente. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Zucca politene con troppa diffusione.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

L&#39;inclusione degli acidi acetico e lattico in protocolli convenzionali fissazione da squash facilita sia la risoluzione interbanda e braccio cromosomico diffusione ma purtroppo alcuni epitopi non sopravvivono a questo trattamento. Un esempio di tale epitopo è H3S10ph (Cai et al., 2008). Poiché il trattamento acido ha anche lo svantaggio che disseta la fluorescenza intrinseca di proteine ​​GFP-tagged, DiMario et al. (2006) ha recentemente sviluppato una base di formaldeide &quot;acid-free tecnica di...

preparazione dei cromosomi di drosophila zucche politene per l&#39;etichettatura di anticorpi

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila è stata a lungo un sistema di preferiti modello per studiare la relazione tra struttura della cromatina e regolazione dei geni per i vantaggi citologico fornite dal cromosomi giganti ghiandola salivare polytene larve del terzo stadio. In questo tessuto i cromosomi subiscono molti cicli di replicazione in assenza di divisione cellulare dando luogo a circa 1000 copie. Il DNA rimane allineata dopo ogni ciclo replicativo conseguente cromosomi notevolmente allargata che forniscono una opportunità unica per correlare morfologia della cromatina con la localizzazione di specifiche proteine. Di conseguenza, c&#39;è stato un elevato livello di interesse nella definizione delle modificazioni epigenetiche presenti in geni diversi e in diverse fasi del processo di trascrizione. Un importante strumento per tali studi è l&#39;etichettatura dei cromosomi politenici con anticorpi per l&#39;enzima, fattore di trascrizione o la modifica degli istoni di interesse. Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen Drosophila cromosomi politenici per l&#39;etichettatura degli anticorpi.

Questo protocollo video illustra la tecnica di zucca utilizzata in laboratorio per preparare Johansen<em&gt; Drosophila</em&gt; Cromosomi politenici per l&#39;etichettatura degli anticorpi.

Preparazione dei cromosomi di Drosophila Zucche politene per l&#39;etichettatura di anticorpi

La Drosophila è da tempo un sistema modello prediletto per studiare la relazione tra la struttura della cromatina e la regolazione genica, a causa della citologica...

Questa procedura inizia con la coltivazione di larve di terzo stadio di Drosophila in bottiglie per moscerini. Utilizzando due paia di pinzette, le ghiandole salivari vengono dissezionate dalle larve. Le ghiandole salivari vengono quindi fissate con successo in due fissativi diversi su un vetrino portaoggetti con due cavità.Infine, le ghiandole vengono schiacciate in una soluzione di acido lattico-acetico tra una lamella e un vetrino da microscopio. Ciao, sono la dottoressa Kristen Johansen del Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Biologia Molecolare dell'Università dello Stato dell'Iowa. Ciao, sono uno studente laureato assistente tecnico nel laboratorio della dottoressa Johansen.Oggi vi mostreremo un procedimento per preparare schiacciamenti di cromosomi politenici di drosophila adatti all'etichettatura con anticorpi. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le modifiche istoniche epigenetiche e la loro relazione con la struttura della cromatina e l'espressione genica. Cominciamo dunque.Per ottenere cromosomi politenici ottimali per preparazioni schiacciate di alta qualità, sono essenziali condizioni di coltura non affollate. Posizionare circa 20 femmine di moscerini depositori di uova in un comune flacone da quattro pollici e trasferirle in un flacone nuovo ogni giorno. Una coltura a 21 gradi Celsius è adeguata per la maggior parte degli scopi, ma l'incubazione a 18 gradi Celsius produrrà cromosomi più grossi, che potrebbero essere più adatti per alcuni esperimenti, ad esempio quando occorre visualizzare con alta risoluzione le regioni interbanda bandate.Selezionare gli individui più grassi dalla prima generazione di larve di terzo stadio che arrampicano sulle pareti del barattolo. Mentre sono ancora in movimento, ma subito prima della pupazione, le larve sono facilmente visibili lungo la parete del barattolo, al di sopra del terreno di coltura. Utilizzare pinzette per posizionare le larve su una piastra per colture cellulari.Per ogni round di schiacciamento, risciacquare due o tre larve insieme con acqua prima di trasferirle in una piastra pulita contenente PBS per la dissezione. Il PBS deve coprire le larve, ma il tempo non è un fattore critico. Poiché le larve possono sopravvivere in queste condizioni per ore, posizionare la piastra con le larve in PBS sul piano di un microscopio stereoscopico insieme a una coppia di pinzette.Afferrare la punta dei ganci boccali tenendo fermo il corpo. A circa due terzi del percorso, utilizzare una seconda paia di pinze per tirare i ganci boccali ed esporre le ghiandole salivari. Separare le ghiandole salivari dal cervello, dagli occhi e dai dischi tenali ed eliminare il corpo adiposo e qualsiasi altro tessuto associato.Aggiungere 200 microlitri del fissativo uno al primo pozzetto di una lamella con due pozzetti e da 200 a 300 microlitri del fissativo due al secondo pozzetto. Trasferire una coppia di ghiandole salivari alla volta nel fissativo uno nel primo pozzetto e incubare per il tempo necessario per l'epitopo bersaglio, solitamente circa uno-due minuti, utilizzando pinzette.Trasferire le ghiandole salivari per fissarle, due alla volta, e incubare per due minuti. Utilizzando pinzette, trasferire le ghiandole su un'ogiva coprioggetto pulita rivestita con sigma e aggiungere da 10 a 30 microlitri di soluzione di acido lattico-acetico appena preparata. Abbassare delicatamente un vetrino ricoperto di polilisina sull'ogiva coprioggetto.Sollevare con attenzione il vetrino sfruttando l'adesione del liquido al vetro per prendere il coprioggetto senza applicare pressione verticale. Per preparare il campione e distribuire immediatamente i cromosomi, afferrare con cura il bordo del coprioggetto con una pinzetta e muoverlo leggermente avanti e indietro. Ancora una volta, minimizzando la pressione verticale sul tessuto, l'oscillazione del coprioggetto è fondamentale per separare adeguatamente le singole cellule della ghiandola salivare.Battere leggermente in modo obliquo il coprioggetto con la parte gomma di una matita può inoltre aiutare a diffondere la soluzione; l'insorgenza di torbidità è spesso un buon indicatore della separazione cellulare. Esaminare immediatamente il tessuto al microscopio a contrasto di fase per verificare che i cromosomi siano ben distesi, come indicato da bracci cromosomici chiaramente separati ed estesi. Se i cromosomi non appaiono ben distesi al primo tentativo.È possibile ripetere leggeri colpetti sul vetrino coprioggetto finché non si ottiene una diffusione sufficiente. Posizionare il vetrino con il coprioggetto rivolto verso il basso su una pila di salviettine Kim pulite. Collocare una salvietta pulita sopra il preparato.Posizionare un pollice sulla posizione del vetrino coprioggetto e premere fermamente verso il basso. Evitare movimenti orizzontali, che potrebbero causare una rottura dei cromosomi. Riesaminare il vetrino al microscopio per determinarne l'idoneità all'esperimento in corso.Ripetere la dissezione e la preparazione dello striscio cromosomico per ottenere un numero sufficiente di vetrini. Posizionare un peso di 175 grammi sul coprioggetto dei vetrini utilizzando pinzette lunghe. Immergere un vetrino preparato in un piccolo contenitore di azoto liquido e mantenerlo immerso fino a quando cessa l'ebollizione.Rimuovere il vetrino e utilizzare immediatamente il bordo di una lama da rasoio pulita sotto l'angolo del coprioggetto per sollevarlo. Raccogliere il vetrino in un barattolo coplan contenente PBS freddo per l'uso immediato, oppure riempito con etanolo al 95% per una conservazione più lunga. Una volta che la brina è sublimata, esaminare il coprioggetto per verificare che il tessuto sia rimasto sul vetrino.Il primo passaggio fondamentale per ottenere una preparazione di schiacciamento di INE di alta qualità è coltivare larve grasse con nuclei grandi nelle ghiandole salivari. Il secondo è una buona tecnica nella procedura di spalmatura, che potrebbe richiedere un po' di pratica. Un suggerimento per migliorare il successo della spalmatura è individuare il volume minimo di soluzione di acido lattico acetico durante il passaggio di schiacciamento.Questo favorirà una diffusione sufficiente dei cromosomi senza generare forze di flusso eccessive che potrebbero rimuovere i bracci cromosomici. Vale inoltre la pena notare che qualsiasi ritardo nel muovere avanti e indietro il coprioggetto ridurrà la diffusione dei bracci cromosomici, poiché questi diventano più rigidi quando esposti alla soluzione di acido lattico acetico. Se tutto procede correttamente su ogni vetrino, dovrebbero essere presenti numerosi cromosomi politenici ben diffusi.Qui mostriamo un esempio di tale preparazione, marcata con un indicatore per le regioni interbanda in rosso e con un colorante che evidenzia le regioni bandate in blu. Se si ottiene una diffusione insufficiente, i cromosomi appariranno come piccole sfere, come mostrato qui. D'altro canto, se la diffusione è eccessiva, i cromosomi risulteranno troppo sottili ed allungati o, in alcuni casi, frammentati in piccoli pezzi, come illustrato qui.Abbiamo appena mostrato come preparare schiacciamenti cromosomici di politaenia della drosophila. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di iniziare con la larva grassa. È tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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