Christopher Hughes: un modello in vitro per lo studio dell'angiogenesi (Intervista)

Ciao, mi chiamo Dottor Christopher Hughes. Sono professore all'Università della California di Irvine e il mio laboratorio studia l'angiogenesi. In particolare, siamo interessati ai geni che regolano il processo di angiogenesi.

Abbiamo ottimizzato un saggio in vitro basato sul lavoro di Nelson e, e in questo saggio possiamo osservare tutti i diversi processi che avvengono durante l'angiogenesi; rivestiamo microsferette di tedex, piccole sferette con cellule endoteliali. Successivamente le incorporiamo in gel di fibrina. Forniamo fattori di crescita.

E nell'arco di diversi giorni, le cellule endoteliali germogliano dalle microsfere. Migrano, si allineano, proliferano, formano tubuli, si ramificano e creano anastomosi. Così che, dopo circa 10 giorni, otteniamo in coltura una rete capillare completa.

Beh, alcuni dei problemi legati ai saggi in vivo e di angiogenesi, ad esempio quelli effettuati nei topi, sono che è molto difficile manipolare il sistema. È complicato visualizzare ciò che avviene all'interno di un animale; non si riesce effettivamente a vedere l'angiogenesi in atto. Invece, se si desidera manipolare il sistema nelle nostre colture in vitro, è molto semplice modificare geneticamente le cellule endoteliali, attivare o disattivare geni e osservare gli effetti di tali manipolazioni sull'angiogenesi a gemmazione.

Ed è molto più difficile farlo nell'animale intero. È necessario creare knockout o knockin. Questi sono i due vantaggi principali.

È facile da manipolare ed è facile da visualizzare. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi saggi in vitro di agenesi, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi. In particolare, uno ben noto è il saggio con gel di matrice, in cui le cellule endoteliali vengono posizionate sopra questa matrice extracellulare chiamata matrigel.

E il problema è che le cellule endoteliali formano strutture simili a cordoni, ma non formano mai veri e propri vasi luminalizzati. Non si osserva gemmazione, né anastomosi. Esistono modelli a base di gel di collagene, che possono essere efficaci.

Esistono molti casi in cui non si osserva la proliferazione delle cellule endoteliali. Di solito non si tende a vedere l'anastomosi. Il saggio su gel di fibrina che abbiamo sviluppato si basa su un modello di Nelson Kar pubblicato a metà degli anni novanta.

E ora abbiamo notevolmente migliorato questa tecnica al punto da poter osservare tutte le fasi dell'angiogenesi. Possiamo seguire la formazione iniziale dei prolungamenti, la migrazione, osservare la proliferazione delle cellule, la formazione del lume, l'insorgenza di ramificazioni e, infine, l'anastomosi che porta alla formazione di una rete vascolare completa in vitro.

Questo saggio è davvero, secondo noi, il miglior sistema in vitro disponibile se si desidera osservare tutte le diverse fasi dell'angiogenesi. Un altro vantaggio di questo saggio in vitro è che possiamo effettuare la microdissezione con laser, possiamo centrifugare la coltura in modo che diventi molto piatta e quindi utilizzare il microscopio per la microdissezione con cattura laser. Possiamo effettivamente isolare cellule singole e, in particolare, siamo interessati alle cellule apicali.

E quindi stiamo rimuovendo queste aree e possiamo analizzare l'espressione genica, in particolare nelle cellule apicali rispetto alle cellule del tronco, ovvero quelle cellule che formano effettivamente il lume. La nostra ipotesi è che esista un'espressione genica differenziale tra queste due popolazioni cellulari. Possiamo esaminare questo aspetto, cosa che sarebbe pressoché impossibile da realizzare in un sistema in vivo.

Pensiamo quindi che questa sia un altro importante vantaggio dell'utilizzo di questo saggio in vitro. I primi studi condotti in questo campo, come menzionato da Nelson Recon, hanno utilizzato cellule endoteliali microvascolari. Si ritiene infatti che le cellule endoteliali microvascolari siano le cellule più adatte da utilizzare in un saggio di questo tipo, poiché in vivo sono proprio le EC microvascolari a formare nuovi vasi.

Abbiamo deciso di provare a farlo con ve. Queste sono cellule endoteliali di vena ombelicale umana per diverse ragioni. Una di queste è che tali cellule sono molto facili da ottenere.

È possibile recarsi in ospedale, ottenere corde ombelicali dalle sale parto ed isolare le cellule in modo molto semplice. Inoltre, queste cellule sono state utilizzate in coltura da molti anni. Sono molto ben caratterizzate.

E così abbiamo allestito questo saggio e lo abbiamo ottimizzato per poter utilizzare queste cellule per tali motivi. E in modo interessante, si è scoperto che le VEC, queste cellule endoteliali di vasi di grosso calibro, sembrano assumere la forma di cellule endoteliali microvascolari in coltura. Perdono molti geni che sono normalmente espressi dalle cellule endoteliali di grosso calibro e iniziano a esprimere geni normalmente associati alle cellule endoteliali microvascolari.

E sono perfettamente in grado di formare spruzzi simili a capillari, di creare lumi e di produrre in coltura strutture che assomigliano in tutto e per tutto a veri capillari. Sono quindi facili da utilizzare, ve sono facili da utilizzare, e svolgono ciò che desideriamo da loro. Producono gemmazioni e formano vasi adeguatamente lumenizzati.

Quando vogliamo quantificare questo saggio, ci sono effettivamente diversi approcci possibili. Possiamo considerare criteri realmente quantitativi, come il numero di germogli, la lunghezza dei germogli, il diametro dei germogli, il numero di punti di ramificazione, il numero di anastomosi, ma possiamo anche valutare criteri qualitativi. Possiamo quindi chiederci se stiano formando dei lumi.

E questo è probabilmente ciò che ci interessa maggiormente. In molti dei saggi che eseguiamo, la formazione corretta del lume è fondamentale. Si tratta in realtà di una valutazione più qualitativa, anche se, all'aumentare delle dimensioni dei vasi, è possibile misurare anche il diametro di tali lumi.

Utilizziamo quindi i fibroblasti in queste colture. Immergiamo le microsfere nel gel di fibrina e seminiamo i fibroblasti sulla superficie del gel. I fibroblasti sono assolutamente essenziali per una corretta formazione dei germogli e del lume.

In assenza di fibroblasti, si osserva una certa formazione di nuovi spruzzi. Tuttavia, le cellule endoteliali tendono a non rimanere attaccate tra loro. Quello che accade è che migrano l'una lontano dall'altra.

Di conseguenza, qualsiasi struttura che si sviluppi su questo germoglio tende a disintegrarsi. Dopo alcuni giorni, le cellule endoteliali subiscono apoptosi. Sembra quindi che i fibroblasti producano fattori essenziali per l'angiogenesi, almeno in questo sistema in vitro.

E siamo stati molto interessati a scoprire quali siano questi fattori. Quello che abbiamo scoperto è che i fibroblasti secernono qualcosa nel mezzo, quindi possiamo prelevare il mezzo condizionato dai fibroblasti e questo sosterrà una corretta formazione di germogli e di lume. Stiamo quindi sicuramente parlando di un fattore solubile.

È ovvio quindi che siamo molto interessati a scoprire cosa producono i fibroblasti che risulti così importante per l'angiogenesi in questo sistema. Abbiamo provato tutti i soliti sospettati: VEGF, FGF basico sono presenti nel coltura, ma aggiungerne quantità maggiori non sostituisce i fibroblasti. Abbiamo inoltre provato l'angiopoietina 1, il TGF-beta, l' HGF, e così via, e così via.

Fino ad ora non abbiamo trovato il fattore essenziale. Quindi, quello che stiamo facendo ora è purificare fattori dal mezzo condizionato proveniente da fibroblasti. Stiamo quindi passando il mezzo condizionato attraverso diverse colonne, a scambio cationico, ad esclusione dimensionale, e otteniamo frazioni che presentano attività.

E ora stiamo monitorando questa attività, prelevando tali frazioni, identificando quali sono attive e, da qui, possiamo analizzarle su gel, assicurandoci di avere solo un numero relativamente ridotto di bande sul gel; successivamente possiamo escinderle ed ottenere il loro sequenziamento mediante spettrometria di massa. E questo ci sta regalando giornate molto interessanti. Abbiamo già un buon numero di geni candidati che stiamo testando singolarmente per verificare se siano effettivamente il fattore che stiamo cercando.

Abbiamo quindi testato molti fattori angiogenici noti e sappiamo che il veg GF e il FGF basico sono effettivamente essenziali per la corretta formazione di nuovi vasi in questo saggio. Tuttavia, non rappresentano l'intera spiegazione. Esistono fattori derivati che risultano importanti, come ho menzionato, e un approccio che abbiamo utilizzato consiste nel prelevare cellule tumorali, che in vivo sono altamente angiogeniche, in grado di generare tumori di grandi dimensioni nei topi e fortemente vascolarizzati.

E abbiamo analizzato queste cellule tumorali e osserviamo che esprimono livelli molto elevati di VEGF; le abbiamo quindi inserite nelle nostre colture. Abbiamo sostituito i fibroblasti con queste cellule tumorali, ma esse non supportano un'angiogenesi robusta in questo saggio. E questo è molto interessante.

Quello che ciò suggerisce, e che è stato suggerito anche da altre persone, è che esiste un dialogo incrociato tra il tumore, lo stroma S, costituito dai fibroblasti e dalle altre cellule di supporto nel tessuto, e le cellule endoteliali. È molto probabile che le cellule tumorali producano alcuni fattori che agiscono direttamente sulle cellule endoteliali, ma producano anche altri fattori che stimolano i fibroblasti e altre cellule stromali a produrre molecole che a loro volta sostengono una marcata angiogenesi.