Christopher Hughes: un modello in vitro per lo studio dell'angiogenesi (Intervista)

Ciao, mi chiamo Dr.Christopher Hughes. Sono un professore all'Università della California Irvine e il mio laboratorio lavora sull'angiogenesi. E siamo particolarmente interessati ai geni che regolano il processo di angiogenesi.

Abbiamo ottimizzato un saggio in vitro basato sul lavoro di Nelson e, e in questo test possiamo osservare tutti i diversi processi che avvengono durante l'angiogenesi, rivestiamo le perle di tedex, piccole perle con cellule endoteliali. Quindi li incorporiamo in gel di fibrina. Forniamo fattori di crescita.

E nel corso di diversi giorni, le cellule endoteliali spuntano dalle perline. Migrano, si allineano, proliferano, formano tube, si ramificano e formano anastomosi. In modo che entro circa 10 giorni abbiamo un capillare completo come Network nella cultura.

Beh, alcuni dei problemi con i saggi envivo e di angiogenesi, per esempio, quelli che vengono fatti nei topi è che è molto, non è molto facile manipolare il sistema. È difficile visualizzare quando c'è questo che sta accadendo all'interno di un animale, non si può davvero vedere l'angiogenesi in corso. E se si vuole manipolare il sistema nelle nostre colture in vitro, è molto facile manipolare geneticamente le cellule endoteliali, accendere e spegnere i geni, e osservare gli effetti di ciò sulla germinazione dell'angiogenesi.

Ed è molto più difficile farlo nell'intero animale. Devi fare knockout o knockin. Questi sono i due principali vantaggi.

È, è facile da manipolare Ed è facile da visualizzare. Quindi, nel corso degli anni, sono stati sviluppati diversi saggi di agenesia in vitro e tutti hanno i loro vantaggi e svantaggi. E in particolare uno ben noto è il saggio su gel di matrice in cui le cellule endoteliali vengono posizionate sopra questa matrice extracellulare chiamata matrigel.

E il problema è che le cellule endoteliali formano strutture simili a cordoni cordonali, ma non producono mai veri e propri vasi alluminizzati. Non si vede germogliare, non si vede anastomosi. Ci sono modelli di gel di collagene, che possono essere buoni.

Ce ne sono molti Non si vede la proliferazione delle cellule endoteliali. Non si tende a vedere anastomosi. Il test del gel di fibrina che abbiamo sviluppato si basa su un modello di Nelson Kar pubblicato a metà degli anni novanta.

E ora lo abbiamo notevolmente migliorato in modo tale da poter vedere tutte le fasi dell'angiogenesi. Possiamo osservare il germogliamento iniziale, la migrazione. Vediamo la proliferazione delle cellule, vediamo la formazione del lume, otteniamo ramificazioni e infine otteniamo l'anastomosi per formare una rete vascolare completa in vitro.

Quindi questo test è davvero, crediamo che sia, il miglior sistema in vitro in circolazione se si vogliono esaminare tutte queste diverse fasi dell'angiogenesi. Un altro vantaggio che abbiamo con questo test in vitro è che possiamo eseguire la cattura laser, la micro dissezione, possiamo ruotare la coltura in modo che diventi molto piatta e quindi utilizzare il microscopio per micro dissezione a cattura laser. Possiamo effettivamente estrarre singole cellule e in particolare siamo interessati alle cellule della punta.

E quindi li stiamo eliminando e possiamo osservare l'espressione genica, in particolare nelle cellule della punta rispetto alle cellule del tronco, le cellule che stanno effettivamente producendo il lume. E la nostra ipotesi è che ci sarà un'espressione genica differenziale tra queste due popolazioni di cellule. Possiamo guardare a questo, sarebbe praticamente impossibile farlo in un sistema in vivo.

Quindi pensiamo che questo sia un altro grande vantaggio dell'utilizzo di questo test in vitro. Il primo lavoro che è stato fatto in questo, come ho menzionato da Nelson Recon, è stato quello di utilizzare cellule endoteliali microvascolari. E si pensa molto che le cellule endoteliali microvascolari, le cellule che si vorrebbero usare per un test come questo, perché in vivo è l'EC microvascolare che sta davvero formando nuovi vasi.

Abbiamo deciso di provare a farlo con ve. Si tratta di cellule endoteliali della vena ombelicale umana per un paio di motivi. Uno dei quali è che queste cellule sono molto facili da ottenere.

Si può andare in ospedale, si possono prendere i cordoni ombelicali dalle sale parto e si possono isolare le cellule molto facilmente. E anche queste cellule sono state utilizzate in coltura per molti anni. Sono molto ben caratterizzati.

E così abbiamo impostato questo test e lo abbiamo ottimizzato in modo da poter utilizzare queste cellule per questi motivi. Ed è interessante notare che si scopre che queste cellule endoteliali dei grandi vasi sembrano assumere la forma di cellule endoteliali microvascolari e di coltura. Perdono molti geni che sono normalmente espressi dall'ec dei grandi vasi e iniziano a esprimere geni che sono normalmente associati alle cellule endoteliali microvascolari.

E sono perfettamente in grado di formare capillari come germogli, di fare lumi e di far sembrare quelli che tutto il mondo sembrano veri e propri capillari nella cultura. Quindi sono facili da usare, sono facili da usare e fanno quello che vogliamo che facciano. Germogliano e, e fanno veri e propri vasi alluminizzati.

Quando vogliamo quantificare questo test, ci sono davvero un paio di modi in cui possiamo procedere. Possiamo guardare a criteri molto quantitativi come il numero di germogli, la lunghezza dei germogli, il diametro dei germogli, il numero di punti di ramificazione, il numero di anastomosi, ma guardiamo anche a criteri qualitativi. E quindi possiamo vedere se stanno formando lumen?

E questo è probabilmente ciò che ci interessa di più. In molti dei test che facciamo è la loro corretta formazione del lume. E questa è davvero una valutazione più qualitativa, anche se man mano che i vasi diventano più grandi, si può effettivamente misurare anche il diametro di quei lumen.

Quindi usiamo i fibroblasti in queste colture. Incorporiamo le perle nel gel di fibrina e piastramo i fibroblasti sopra il gel. I fibroblasti sono assolutamente essenziali per la corretta germinazione e formazione del lume.

In assenza di fibroblasti, otteniamo un po' di germogliamento. Tuttavia, le cellule endoteliali tendono a non rimanere attaccate l'una all'altra. Quello che succede è che migrano lontano l'uno dall'altro.

E quindi qualsiasi struttura che stai sviluppando su questo germoglio tende a cadere a pezzi. E dopo alcuni giorni, le cellule endoteliali vanno incontro ad apoptosi. Sembra quindi che i fibroblasti stiano producendo fattori essenziali per l'angiogenesi, almeno in questo sistema in vitro.

E siamo stati molto interessati a sapere quali sono questi fattori. Quello che abbiamo scoperto è che i fibroblasti secernono qualcosa nel mezzo, quindi possiamo prendere il terreno di coltura dai fibroblasti e questo sosterrà la corretta germinazione e la formazione del lume. Quindi abbiamo sicuramente a che fare con un fattore solubile.

Quindi, ovviamente, siamo molto interessati a sapere cosa stanno producendo i fibroblasti, che è così importante per l'angiogenesi in questo sistema. Abbiamo provato tutti i soliti sospetti, VEGF, fg F di base sono, sono nella coltura, l'aggiunta di più non sostituisce i fibroblasti. Abbiamo anche provato l'angiopoietina uno, il TGF beta, H, GF, eccetera, eccetera.

Finora non abbiamo trovato il fattore vitale. Quindi quello che stiamo facendo ora è purificare i fattori dal mezzo di condizione dai fibroblasti. Quindi stiamo mettendo il mezzo della condizione su varie colonne, catione, scambio, esclusione delle dimensioni, e stiamo ottenendo frazioni di ciò che hanno attività.

E ora stiamo seguendo quell'attività e stiamo prendendo quelle frazioni, scoprendo quali sono attive, e da lì possiamo eseguirle su gel, assicurarci di avere solo un numero relativamente piccolo di bande sul gel e poi possiamo tagliarle e sequenziarle in base alla spettrometria di massa. E questo ci sta regalando un sacco di giorni interessanti. Abbiamo un bel po' di geni candidati ora che stiamo testando individualmente per vedere se sono effettivamente il fattore che siamo, che stiamo cercando.

Quindi abbiamo testato molti fattori angiogenici noti e sappiamo che il GF veg e l'FGF basico sono in realtà essenziali per il corretto germogliamento in questo test. Ma non sono l'intera storia. Ci sono fattori derivati che sono importanti come, come ho detto, e un modo in cui abbiamo esaminato questo è che abbiamo preso cellule tumorali, che sono altamente angiogeniche in vivo, generano grandi tumori nei topi e sono altamente vascolarizzate.

E abbiamo esaminato queste cellule tumorali che esprimono livelli molto alti di vegf e le abbiamo inserite nelle nostre colture. Quindi abbiamo sostituito i fibroblasti con queste cellule tumorali e non supportano un'angiogenesi robusta in questo test. E questo, è molto interessante.

Ciò che suggerisce è, e questo è stato suggerito anche da altre persone, è che c'è un crosstalk tra il tumore, lo stroma S, che sono i fibroblasti e altre cellule di supporto nel tessuto e le cellule endoteliali. E può darsi che le cellule tumorali producano alcuni fattori che agiscono direttamente sulle cellule endoteliali, ma ne producano anche altri che stimolano i fibroblasti e altre cellule stromali a produrre fattori che poi supportano anche una robusta angiogenesi.