Un metodo migliorato di isolamento dell'RNA da Pino Loblolly ( P. taeda L.) e altre specie di conifere
22 febbraio 2010
Tessuti vegetali, tra cui floema e xilema di pino loblolly ( Pinus taeda L.), contengono alti livelli di fenoli e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione di RNA. Questa presentazione discute le tecniche per la raccolta del campo coltivato tessuti e l'isolamento di RNA di qualità sufficiente per microarray e analisi genomiche di altri.
Quanto segue è stato prodotto da ricercatori dell'Università della Georgia e della Warnell School of Forestry and Natural Resources. Questo video dimostrativo descrive il prelievo dei tessuti xilematici e floematici e l'isolamento successivo dell'RNA da Pinus Teta, comunemente noto come pino loblolly, che è la specie di conifera più importante per la produzione di prodotti forestali negli Stati Uniti. Una volta abbattuto l'albero, in questo caso un albero di 40 anni, il fusto principale viene tagliato in sezioni di circa 50 centimetri di lunghezza.
Il tronco viene quindi inciso longitudinalmente in diversi punti con la motosega per facilitare la rimozione della corteccia. Utilizzando un martello e uno scalpello per legno, si solleva la corteccia finché non può essere staccata a sezioni. Successivamente, il tessuto fluido viene rimosso manualmente, prelevato dall'interno delle sezioni di corteccia e immediatamente immerso in azoto liquido.
Dopo aver rimosso la corteccia, lo strato sottile di xilema secondario può essere raccolto raschiando la superficie del fusto con una lametta a taglio singolo. Il tessuto xilematico acquoso viene immediatamente posto in azoto liquido. In questo campionamento, abbiamo inoltre raccolto campioni di legno reattivo, comunemente indicati come legno di compressione e legno opposto, prima di tagliare i rami dal fusto principale.
L'orientamento del ramo viene innanzitutto segnato con vernice spray in modo da identificare le aree contenenti i due tipi di tessuto: legno opposto nella parte superiore del ramo e legno di compressione nella parte inferiore. Durante la rimozione della corteccia, i rami vengono inizialmente incisi con una motosega lungo linee che delimitano il legno di compressione, il legno opposto e la zona di rimozione della corteccia, operazione eseguita come per i tronconi del fusto principale, fatta eccezione per il fatto che viene rimossa soltanto la corteccia nella regione corrispondente al tipo di reazione.
Il legno raccolto viene rimosso in qualsiasi momento. È tipicamente più difficile rimuovere ampie sezioni di corteccia da questi rami più piccoli. I campioni di legno di reazione del xilema secondario vengono raccolti nello stesso modo del xilema secondario normale, raschiando con la lametta e immergendo immediatamente in azoto liquido.
Notare il colore bruno rossastro caratteristico del legno di compressione. È importante sottolineare che il prelievo e la lavorazione di numerosi campioni da un albero di grandi dimensioni richiedono diverse persone, ognuna impegnata in un compito specifico, in modo che tutti i tipi di tessuto vengano raccolti contemporaneamente per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA; i campioni congelati e l'azoto liquido vengono successivamente trasferiti in sacchetti di stoccaggio etichettati e posti su ghiaccio secco per il trasporto in laboratorio. Il nostro primo passo consiste nel polverizzare il tessuto utilizzando un mulino criogenico modello 6850 Specs; rispetto alla macinazione con mortaio e pestello, questo passaggio aumenta in modo significativo i rendimenti di estrazione dell'RNA per i campioni di tessuto legnoso, mantenendo i campioni freddi con azoto liquido.
Il tessuto viene inizialmente spezzettato manualmente e posto nella camera del campione. La camera viene inserita nel portacampioni e bloccata in posizione, quindi il campione viene macinato per due minuti. Il prodotto finale ha la consistenza di una polvere grossolana.
Il protocollo di estrazione dell'RNA è un processo che richiede due giorni. Nel primo giorno, 2,5 grammi di tessuto congelato vengono aggiunti al tampone per l'estrazione dell'RNA riscaldato a 65 gradi Celsius. Il campione viene agitato vigorosamente per favorire la miscelazione, quindi viene aggiunto un volume uguale di cloroformio e il campione viene nuovamente mescolato mediante inversione delicata.
Il campione viene quindi posizionato su una ruota rotante per cinque minuti. Successivamente, il campione viene trasferito in provette in teflon Oakridge ad alta velocità e centrifugato in un rotore SS 34 a 12.000 giri al minuto per cinque minuti. La frazione acquosa superiore viene estratta in una provetta pulita e viene aggiunto un volume pari alla metà di cloroformio.
Il campione viene vorticosato per un minuto e quindi nuovamente posto sulla ruota rotante per cinque minuti. Dopo una seconda centrifugazione, la frazione acquosa viene nuovamente estratta in una provetta in polipropilene ad alta velocità da 50 ml e centrifugata a 10.000 giri/min per 20 minuti. Per rimuovere eventuali particelle residue, il campione viene travasato in una provetta Falcon da 50 ml e viene aggiunto un quarto del volume di cloruro di litio 10 molare al campione.
Il campione viene mescolato agitandolo e posto a quattro gradi Celsius durante la notte. Il secondo giorno, il campione precipitato con cloruro di litio viene prima centrifugato a 11.000 giri al minuto per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Il surnatante viene versato e scartato, e i tubi vengono capovolti su salviette chimiche per un minuto. Per rimuovere ogni eccesso di liquido, il pellet di RNA, che dovrebbe essere visibile, viene risospeso in 800 microlitri di tampone SSTE caldo, pre-riscaldato a 65 gradi Celsius. Assicurarsi di aspirare e dispensare più volte e lungo tutti i margini del pellet per garantire che venga completamente solubilizzato.
Successivamente, trasferire l'RNA risospeso in una microprovetta priva di RNA da due mil e oltre. Riscaldare il campione per uno o due minuti in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius, seguito da vortexaggio per assicurare che il campione sia completamente risospeso. Questa procedura può essere ripetuta se necessario.
Ora, aggiungere un volume uguale di fenolo cloroformico tamponato. Vortexare il campione per 15-20 secondi e centrifugare a 14.000 giri/min per tre minuti. La frazione acquosa viene trasferita in un nuovo tubo microcentrifuga e vi si aggiunge un volume uguale di isopropanolo.
Il campione viene vortexato e microfuso come nell'estrazione precedente. Per la fase finale di estrazione organica, i tubi con gel bloccato vengono prima microfusi a 11.000 giri/min per due minuti.
Successivamente, il campione di RNA ottenuto dall'estrazione precedente viene aggiunto al gel con blocco di fase, seguito da un volume pari alla metà di cloroformio, e i due componenti vengono mescolati delicatamente mediante pipettaggio. Il campione viene quindi centrifugato a 11.000 giri al minuto per cinque minuti, e il campione acquoso di RNA viene trasferito in un nuovo tubo microcentrifuga Ambion privo di RNAasi. Il passaggio successivo consiste in una semplice precipitazione dell'RNA, aggiungendo al campione un decimo del volume di acetato di sodio 3 M a pH 4,8 e due volumi di etanolo al 100%.
Il campione viene vortexato, posto brevemente in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti e quindi centrifugato per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Il soprannatante viene aspirato con attenzione e il piccolo pellet bianco viene lavato con un millilitro di etanolo al 70% freddo di ghiaccio, quindi si aspira e si ripete il lavaggio con etanolo dopo l'ultima aspirazione. L'etanolo residuo viene fatto evaporare lasciando i tubi aperti in banco per cinque minuti.
I pellet di RNA vengono risospesi in 100 microlitri di acqua DEPC e risospesi mediante vortexaggio e riscaldamento a 65 gradi. Questa procedura può essere ripetuta se necessario. Viene determinata la concentrazione del campione.
Si calcolano i rapporti spettrofotometricamente e 2 62 80 e 2 62 30 per stimare il grado di contaminazione da proteine e carboidrati nel campione. L'elettroforesi su gel 1%AGROS viene utilizzata per stimare qualitativamente la qualità del campione, la contaminazione da DNA genomico e la degradazione dell'RNA. L'integrità di campioni critici viene valutata ulteriormente mediante un bioanalizzatore Agilent 2100 per determinare i rapporti ribosomiali 28 18 s e un numero di integrità dell'RNA. Grazie per aver guardato il nostro video sul prelievo di campioni di tessuto e sull'isolamento di RNA totale da pino loblolly.
I seguenti individui sono responsabili della ripresa e della produzione di questo video formativo.
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Panoramica
Questa presentazione tratta del reperimento dei tessuti xilematici e floematici del pino loblolly (Pinus taeda) e della successiva isolazione dell'RNA. Le tecniche descritte mirano a superare le difficoltà create dagli elevati livelli di fenoli e polisaccaridi che interferiscono con la purificazione dell'RNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia vegetale
- Purificazione dell'RNA
- Analisi genomica
Sfondo
- Il pino loblolly è una specie fondamentale per i prodotti forestali negli Stati Uniti.
- L'elevato contenuto di fenoli e polisaccaridi complica l'estrazione dell'RNA.
- I tessuti provenienti da piante coltivate in campo richiedono tecniche specifiche di raccolta.
- La qualità dell'RNA è cruciale per microarray e studi genomici.
Scopo dello studio
- Dimostrare tecniche efficaci di raccolta per il pino marittimo (loblolly pine).
- Isolare RNA di qualità sufficiente per analisi genomiche.
- Fornire una guida pratica ai ricercatori in biologia vegetale.
Metodi Utilizzati
- Taglio del fusto principale di un pino loblolly di 40 anni in sezioni.
- Incisione delle sezioni con una motosega per facilitare la rimozione della corteccia.
- Utilizzo di un martello e uno scalpello per sollevare e staccare la corteccia.
- Rimozione manuale del tessuto floematico e immersione in azoto liquido.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di RNA da tessuti raccolti.
- Dimostrazione di tecniche efficaci per superare le difficoltà di purificazione.
- Fornitura di una guida visiva per i ricercatori.
- Evidenziazione dell'importanza della qualità dell'RNA per le applicazioni a valle.
Conclusioni
- Le tecniche di raccolta sono essenziali per ottenere RNA di alta qualità.
- I metodi sul campo possono essere adattati a diversi tessuti vegetali.
- Un'efficace isolazione dell'RNA è fondamentale per la ricerca genomica.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di RNA di alta qualità da tessuti di conifere, come il pino marittimo, è fondamentale per consentire analisi genomiche e trascrittomique affidabili nella ricerca e sviluppo di biotecnologie vegetali. Superare le sfide poste da contaminanti fenolici e polisaccaridici ha un impatto diretto sulla fiducia predittiva dei saggi molecolari a valle e supporta una valida conferma degli obiettivi nei flussi di lavoro di biotecnologia forestale e agricola. Questo protocollo migliorato aumenta la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro basati sull'RNA per sistemi vegetali complessi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi rigorosa dell'espressione genica in specie di conifere per l'elucidazione dei percorsi metabolici.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi fornendo RNA ad alta integrità per saggi molecolari.
- Riduce l'ambiguità biologica negli studi trascrittomici dei tessuti legnosi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Semplifica la preparazione di campioni di RNA validati per lo sviluppo di saggi con microarray e qPCR.
- Migliora la riproducibilità dei saggi riducendo al minimo l'interferenza di contaminanti nelle reazioni enzimatiche.
- Permette uno screening affidabile delle variazioni nell'espressione genica in diversi tipi di tessuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Supporta la scoperta di biomarcatori traslazionali garantendo la qualità dell'RNA per analisi interspecie.
- Assicura continuità dal prelievo del campione in campo alla validazione molecolare in laboratorio.
- Riduce i rischi negli studi preclinici standardizzando la qualità dell'input di RNA per applicazioni a valle.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di isolamento dell'RNA si integra nell'interfaccia tra il prelievo di campioni sul campo e lo sviluppo di saggi molecolari, collegando la fase iniziale di scoperta con analisi genomiche successive.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi metabolici grazie all'estrazione di RNA di alta qualità da tessuti vegetali difficili da lavorare.
- Screening: Fornisce RNA pronto per il saggio con contaminanti minimizzati, per uno screening molecolare riproducibile.
- Analisi: Fornisce metriche quantitative sull'integrità dell'RNA (ad esempio, rapporti spettrofotometrici, RIN del bioanalizzatore) per la valutazione della qualità del campione.
- Ricerca traslazionale: Si allinea a studi su biomarcatori che richiedono una qualità costante dell'RNA in ambienti di campo e di laboratorio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato e scalabile, adattabile a numerose specie di conifere e piante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle analisi dell'espressione genica e trascrittomica.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la capacità di elaborazione dell'isolamento dell'RNA da tessuti complessi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione riducendo il rischio di fallimento del saggio dovuto a scarsa qualità dell'RNA.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione adeguata al rischio di bersagli molecolari e geni candidati nei processi di biotecnologia vegetale.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche nella raccolta di tessuti in campo e nella manipolazione di campioni ricchi di fenoli.
- Necessita dell'accesso a attrezzature specializzate come macinatori criogenici e centrifughe ad alta velocità.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per la lavorazione dei campioni e il controllo di qualità.
- È adattabile a diverse specie di conifere e piante legnose, con modifiche al protocollo secondo necessità.
- I potenziali limiti includono l'elevata intensità lavorativa e la necessità di congelare rapidamente i campioni per prevenire la degradazione dell'RNA.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
0:23
Tissue Harvest
0:45
Collection of Phloem
1:07
Collection of Secondary Xylem
1:26
Collection of Reaction Wood: Compression and Opposite Secondary Xylem
2:21
Liquid Nitrogen Storage
3:20
RNA Isolation Day 1
2:46
RNA Isolation: Tissue Preparation
4:41
RNA Isolation Day 2
6:35
RNA Precipitation
7:16
Final Resuspension and Quantification
8:02
Credits
