Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale
25 maggio 2010
Questo video illustra un metodo per analizzare e cultura neuroni commissurali dalla E13 del midollo spinale dorsale di ratto. Dissociato neuroni commissurali sono utili per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e di orientamento.
Questo video illustra un metodo per dissezionare e coltivare neuroni commissurali della corteccia da midollo spinale embrionale. La procedura inizia con il prelievo di embrioni di ratto E13 e successivamente con la dissezione dei midolli spinali. Durante la dissezione, i midolli spinali vengono aperti lungo la lamina dorsale e preparati nella configurazione a libro aperto.
Strisce di tessuto dorsale vengono dissezionate e raccolte in un tubo. Il tessuto dorsale viene dissociato in una sospensione di singole cellule mediante tripsina e rottura meccanica. I neuroni comissurali vengono quindi coltivati su coprivetri o piatti per colture cellulari rivestiti con polilisina.
Possono quindi essere utilizzati per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della crescita e del guidaggio degli assoni. Ciao, sono Sebastian del Laboratorio di Biologia Molecolare dello Sviluppo Neurale presso l'Istituto di Ricerca Clinica di Montreal. Ciao, sono Steve Moen, anch'io del Laboratorio di Biologia Molecolare dello Sviluppo Neurale.
Oggi vi mostreremo un procedimento per dissezionare e coltivare neuroni comissurali dal midollo spinale embrionale. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della guida degli assoni. Cominciamo dunque.
Oggi, i midolli spinali verranno dissecati da embrioni di ratto E 13 appena prelevati, posizionati in una piastra contenente mezzo L 15 durante tutta la dissezione. È importante mantenere gli embrioni e le soluzioni sul ghiaccio. Ricordare che, in tutti i passaggi di dissezione, è fondamentale evitare di stirare il midollo spinale con le pinzette di nichel, poiché ciò potrebbe ostacolare l'isolamento di un midollo spinale completamente integro.
Sotto un microscopio stereoscopico, separare l'embrione da tutti i tessuti extraembrionali e dalle membrane embrionali. Quindi posizionare un embrione nella piastra per dissezioni. Utilizzare forbici microchirurgiche per rimuovere la testa e le parti posteriori degli angoli mostrati qui.
Questo creerà una superficie piatta che faciliterà il posizionamento dell'embrione per un facile accesso al midollo spinale. Posizionare l'embrione con il lato ventrale rivolto verso il basso e l'estremità anteriore orientata in senso opposto. Utilizzare una pinzetta per fissare saldamente l'embrione da un lato.
Non stringere né rilasciare la pinzetta, altrimenti il tessuto si strapperà con la seconda coppia di pinzette. Afferrare la pelle lateralmente rispetto al midollo spinale. Muovere leggermente le punte delle pinzette di sostegno.
Sfilare la pelle che ricopre il dorso dell'embrione per esporre il midollo spinale avvolto nelle sue meningi, in modo da staccare parzialmente il tessuto situato alla destra del midollo spinale. Utilizzare pinzette chiuse per forare il tessuto a partire dal livello delle pinzette di fissazione. Avvicinarsi il più possibile al midollo spinale senza toccarlo.
Ripetere diverse volte lungo il midollo spinale. Questo attaccherà alcuni gangli delle radici dorsali e disturberà gli organi ventrali. Lasciare alcuni tessuti attaccati alle estremità anteriore e posteriore, partendo dall'estremità anteriore.
Utilizzare un ago di tungsteno a forma di uncino per tagliare le meningi e aprire il midollo spinale lungo la piastra del tetto. Ruotare l'embrione di 180 gradi e dissezionare il tessuto dal lato rimanente, utilizzando lo stesso metodo.
Quindi staccare completamente il tessuto sul lato sinistro del midollo spinale, il lato che in origine era stato lesionato a destra; posizionare il midollo spinale di lato e utilizzare la pinzetta per rimuovere la maggior parte del tessuto mesenchimale residuo e i gangli delle radici dorsali. Utilizzare la pinzetta per sollevare una breve falda delle meningi. A questo punto, le meningi e il midollo spinale formano due strati di tessuto simili a una fetta di pane in un sandwich.
Utilizzare la pinzetta per fissare la porzione più grande del midollo spinale all'estremità anteriore. Afferrare i due segmenti separati con la pinzetta ed eliminare delicatamente le meningi. Eseguire un movimento costante e uniforme; un'eliminazione irregolare potrebbe rompere lo strato delle meningi e/o il midollo spinale.
Se lo strato delle meningi si rompe durante il prelievo, la porzione del midollo spinale che rimane attaccata alle meningi è solitamente irrecuperabile. Anche se talvolta è possibile. Utilizzare una pipetta di plastica per trasferire delicatamente il midollo spinale isolato in una piastra contenente mezzo L 15 con 10% di siero di cavallo inattivato termicamente, posta sul ghiaccio, prima di procedere con ulteriori embrioni.
Ricordarsi di cambiare il mezzo nella piastra per dissezione con L 15 freddo per mantenere l'embrione fresco e aiutare a preservare l'integrità del tessuto. Raccogliere i midolli spinali da tutti gli embrioni prima di procedere alle dissezioni del midollo spinale dorsale. Per iniziare la dissezione del cordone dorsale, posizionare un midollo spinale appena isolato in una piastra di Petri contenente L 15 con siero di cavallo al 10% attivato dal calore.
Tagliare la porzione anteriore più ampia, che include parte del rombencefalo. Poi appiattire il midollo spinale e distenderlo come un libro aperto. Il tessuto dorsale si trova nelle parti più laterali del midollo spinale disteso, mentre si fissa il midollo con un ago di tungsteno dritto utilizzando un ago di tungsteno a forma di L per tagliare una striscia di circa un quinto della larghezza di una metà del midollo spinale; tagliare strisce più larghe aumenterà il rendimento, ma ridurrà la purezza della coltura.
Trasferire più strisce dorsali in un tubo conico da 15 millilitri contenente mezzo L 15 con siero equino al 10% e porre il tubo sul ghiaccio. Il resto della procedura verrà eseguito vicino o all'interno della cappa a flusso laminare. Per queste colture, è importante preparare in anticipo soluzioni e attrezzature, di solito prima della dissezione.
Il passaggio di trapianto utilizza pipette di vetro levigate a fiamma di due dimensioni diverse: una con un diametro pari alla metà della dimensione originale e l'altra leggermente più piccola. Prima di iniziare, ricoprire le due pipette levigate a fiamma con un mezzo contenente siero, aspirando il mezzo nelle pipette e lasciandolo in posa per 30 secondi. Questo ridurrà il numero di cellule che aderiscono al vetro durante il trapianto.
Iniziare verificando che le strisce dorsali si siano depositate sul fondo del tubo. Sotto cappa a flusso laminare, rimuovere la maggior parte del sopranatante SUP con una pipetta semplice. Lavare rapidamente con tre millilitri di HBSS freddo privo di magnesio e calcio.
Lasciare riposare la striscia del tubo neurale dorsale per due minuti. Quindi rimuovere l'HBSS con la pasta. Portare il volume a 4,7 millilitri.
Con HBSS caldo, aggiungere 0,3 millilitri di tripsina al 2,5% per ottenere una concentrazione finale di 0,15% di Tryin e mescolare delicatamente; incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per sette minuti, mescolando una volta delicatamente a metà dell'incubazione. Al termine dell'incubazione, aggiungere DNAse per una concentrazione finale di 150 unità per millilitro e solfato di magnesio per una concentrazione finale di 0,15%, quindi mescolare brevemente.
Le sezioni del tubo neurale dorsale dovrebbero ora essere frammentate. Centrifugare i frammenti di tessuto a 200 G per quattro minuti. Rimuovere il sopranatante SUP con una pipetta Pasteur, lasciando circa da 50 a 100 microlitri di liquido sul fondo del tubo.
Battere leggermente sul tubo per allentare il pellet. Quindi lavare le cellule aggiungendo cinque millilitri di HBSS caldo. Lasciare sedimentare le cellule a temperatura ambiente per due minuti.
Centrifugare e lavare nuovamente le cellule. Questa volta, risospendere in due millilitri di HBSS caldo. Utilizzare una pipetta a fuoco lucido dal diametro ridotto per triturare le cellule, aspirando e dispensando lentamente quattro-sei volte; indirizzare il liquido contro la parete del tubo per rompere gli aggregati più grandi e ridurre la morte cellulare.
Evitare la formazione di bolle e non esagerare. Utilizzare la pipetta di vetro con estremità smussata più piccola per dissociare ulteriormente le cellule, aspirando e dispensando lentamente da tre a quattro volte nello stesso modo. Non è necessario dissociare tutti gli aggregati cellulari, poiché tendono a formarsi aggregati di cellule morte tra i detriti.
Lasciare sedimentare eventuali frammenti di tessuto per un minuto. Quindi rimuovere 20 microlitri del sopranatante, che dovrebbe contenere cellule sospese da contare in un emo citometro; i neuroni dovrebbero presentare una vitalità di almeno il 95% mediante colorazione con blu di trian. I neuroni nel mezzo di semina neurobasale devono essere a una concentrazione adatta alla vostra applicazione.
16-18 ore dopo, sostituire il mezzo con mezzo di crescita basale neurale per evitare il distacco. I neuroni vanno manipolati delicatamente rimuovendo il mezzo con una pipetta, piuttosto che aspirandolo con una pompa a vuoto. Di seguito alcuni risultati rappresentativi di neuroni comissurali isolati seminati su coprivetri rivestiti con PLL: quattro ore dopo la semina, i neuroni si sono attaccati alla superficie; 30 ore dopo la semina.
La maggior parte dei neuroni possiede assoni estesi con un cono di crescita visibile. Questi neuroni possono essere facilmente utilizzati in esperimenti di immunofluorescenza. In questo esempio, i microtubuli sono marcati in verde, l'actina in rosso e il NA in blu.
Abbiamo appena mostrato come dissezionare e coltivare neuroni commissurali da midolli spinali embrionali. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che la purezza dei neuroni commissurali dipende dallo spessore della striscia dorsale che viene dissezionata. Questo è tutto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo video viene illustrato un metodo per dissezionare e coltivare neuroni comissurali dal midollo spinale dorsale di ratto a E13. I neuroni comissurali dissociati sono utili per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della crescita e del guidaggio degli assoni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- I neuroni commissurali svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo del sistema nervoso.
- Comprendere i meccanismi della loro crescita e guida è essenziale per ottenere informazioni sullo sviluppo neurale.
- La dissezione e la coltura di questi neuroni permettono studi cellulari dettagliati.
- Questo metodo può contribuire all'individuazione di potenziali strategie terapeutiche per lesioni del midollo spinale.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per isolare i neuroni comissurali dagli embrioni di ratto.
- Facilitare lo studio della crescita e del guidaggio degli assoni in un ambiente controllato.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi cellulari coinvolti nello sviluppo neuronale.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di embrioni di ratto E13.
- Dissezione dei midolli spinali e preparazione in configurazione a libro aperto.
- Dissociazione del tessuto dorsale in una sospensione di singole cellule mediante tripsina e rottura meccanica.
- Coltura di neuroni comissurali su superfici rivestite con polilisina.
Risultati principali
- Isolamento e coltura con successo di neuroni commissurali da midollo spinale di ratto E13.
- Dimostrata la vitalità dei neuroni coltivati per ulteriori studi sperimentali.
- Fornito un metodo riproducibile per lo studio della crescita e del guidaggio degli assoni.
- Consentito l'esplorazione dei meccanismi cellulari e molecolari in un contesto di laboratorio.
Conclusioni
- Il metodo descritto è efficace per la dissezione e la coltura di neuroni comissurali.
- Questo approccio può contribuire in modo significativo alla ricerca nello sviluppo neuronale.
- Studi futuri potranno sfruttare questi neuroni coltivati per indagare interventi terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente l'isolamento di colture di neuroni comissurali fortemente arricchite dal midollo spinale embrionale, fornendo un sistema riduzionista per lo studio dei meccanismi di guida assonica. Tali preparazioni supportano la validazione degli bersagli nella ricerca sullo sviluppo neurologico permettendo un'analisi meccanicistica delle risposte ai segnali guida in un contesto controllato e riproducibile. L'approccio contribuisce alla riduzione del rischio preclinico generando letture quantitative basate su fenotipi per studi sulla modulazione delle vie di segnalazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai percorsi di guida degli assoni mediante saggi funzionali su neuroni commissurali purificati.
- Valore operativo: Fornisce un sistema standardizzato di coltura neuronale ad alta purezza (>90% di purezza) per studi coerenti sull'interazione con bersagli specifici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera un sistema rilevante per la malattia per lo screening di composti che modulano la crescita assonale, la dinamica del cono di crescita o la sensibilità ai segnali guida.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi attraverso tempistiche definite per la dissociazione, la semina e la maturazione, facilitando la valutazione riproducibile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre una piattaforma meccanicistica per la riduzione del rischio, in grado di valutare l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso in un contesto di sviluppo rilevante per l'uomo.
- Valore operativo: Permette una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, fornendo saggi quantificabili di crescita assonale e di cambiamento di direzione come biomarcatori traslazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta, sostenendo la verifica delle ipotesi in fase iniziale e lo sviluppo di saggi per bersagli legati allo sviluppo neurologico, fornendo risultati che orientano le decisioni relative all'identificazione di composti promettenti e al progresso preclinico.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio biologico consentendo l'osservazione diretta delle risposte assonali a segnali guida come netrine, slit e morfogeni.
- Screening: Fornisce letture quantitative pronte per l'analisi mediante imaging (lunghezza dell'assone, morfologia del cono di crescita, angoli di deviazione) adatte a formati di screening automatizzati o ad alto contenuto informativo.
- Analisi: Genera variabili dipendenti misurabili, tra cui velocità di estensione dell'assone, fedeltà della traiettoria ed espressione di marcatori (DCC, LH2, TAG1), per il confronto statistico tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici attraverso meccanismi conservati di guida assonale, consentendo l'estrapolazione interspecie degli effetti della modulazione del bersaglio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di preparazione neuronale applicabile a diversi studi su segnali guida e campagne di screening di composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo il rumore biologico mediante colture neuronali altamente arricchite.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a protocolli standardizzati di dissezione, dissociazione e semina.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo precoci informazioni meccanicistiche sugli effetti della modulazione dell'obiettivo nella guida dell'assone.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio degli obiettivi di neurosviluppo basandosi sulla validazione funzionale in un modello neuronale fisiologicamente rilevante.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche nella dissezione di tessuti embrionali e nelle tecniche di coltura neuronale sterile.
- Presuppone l'accesso a embrioni da gestanti sincronizzate, microscopi per dissezione e attrezzature per la dissociazione basate sul tripsina.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro nella selezione della larghezza della striscia dorsale per bilanciare resa e purezza.
- Richiede l'adattamento della densità di semina e del tempo di maturazione in base al formato dell'analisi (ad esempio, immunofluorescenza rispetto all'analisi biochimica).
- È limitata dall'origine embrionale del tessuto, che restringe gli studi longitudinali a stadi precoci dello sviluppo.
