Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

In questo articolo descriviamo un protocollo per la crescita e l'espansione di cellule epiteliali bronchiali umane da segmenti bronchiali umani appena isolati. Questo protocollo consiste in cinque sezioni, codifica e graffio, piastre di coltura di cento millimetri, riparazione del tessuto bronchiale, explan trapianti di tessuto bronchiale, passaggio di cellule epiteliali bronchiali umane che crescono ciliate, cellule epiteliali bronchiali umane su transwell. Prima di iniziare, tieni presente che tutti i passaggi vengono eseguiti nell'armadio di sicurezza biologica.

Salvo diversa indicazione, leggere la sezione relativa ai materiali, ai reagenti e alla preparazione e assicurarsi di essersi preparati in modo accurato. La seguente codifica, coltura di soluzioni stock, soluzioni di dissociazione del mezzo, rivestimento e graffio. Le piastre di coltura di cento millimetri dovrebbero essere fatte nel bst.

Mantieni tutto sterile. Posizionare piastre di coltura sterili da cento millimetri e soluzione di rivestimento. Nella pipetta BST, due mulini di soluzione di rivestimento e una piastra da cento millimetri ruotano intorno per rivestire la base della piastra.

Assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra uniformemente la base della piastra. Pipettare la soluzione avanzata e usarla per rivestire una seconda piastra da cento millimetri. Ripetere per tutti i piatti necessari.

Il numero di piastre necessarie varia in base al numero di espianti di tessuto. Assicurarsi che la soluzione di rivestimento copra uniformemente la base delle piastre. Come dimostrato.

Copri i piatti con i loro coperchi. Lasciare asciugare le piastre nell'incubatrice per una o due ore e aspirare la soluzione di accesso prima dell'uso Per spiegare il tessuto bronchiale. Le piastre di coltura rivestite non utilizzate possono essere collocate in una sacca sterile e conservate a quattro gradi Celsius per un secondo momento.

Utilizzare forbici, bisturi e pinze pulite a spruzzo, piccole e affilate con etanolo al 70% e portare nella BSC piastre rivestite di graffio premendo saldamente con il bisturi per formare un piccolo XS profondo almeno quattro per piastra. Se il graffio non è abbastanza profondo, i pezzi di tessuto non si depositeranno nelle siringhe e galleggeranno all'esterno Il BSC posiziona il tessuto in un piatto P tre. Sciacquare accuratamente il tessuto bronchiale umano isolato in Bss.

Aprire i pezzi bronchiali. Portare il tessuto nel BS e trasferirlo in una piastra sterile di coltura tissutale da cento millimetri con il cosiddetto DM EM ham F 12 più l'1% di antibiotico anti micotico. Usa le piccole forbici affilate per tagliare il fazzoletto in pezzi cubici da due a tre millimetri.

Posizionare un pezzo di tessuto tagliato al centro di ogni X con una pinza e premere. Lasciare delicatamente che i pezzi di tessuto o gli espianti X aderiscano alla piastra per alcuni secondi. E poi aggiungere delicatamente 10 mil di terreno completo Se il tessuto galleggia Dopo aver aggiunto il terreno, utilizzare una pinza per spingere il tessuto nelle creste della X o fare una nuova X.It potrebbe essere necessario per creare nuove X se le creste non sono abbastanza profonde.

Posizionare le piastre nell'incubatrice e cambiare il terreno ogni tre o quattro giorni, i tessuti sono pronti per il trapianto. Quando un numero sufficiente di cellule epiteliali è cresciuto intorno ai tessuti per coprire aree di uno o due centimetri, ciò richiede circa quattro settimane. Utilizzare un centinaio di millimetri rivestiti e piastre graffiate.

Dal momento che alcuni explan di tessuto potrebbero non avere successo. Il numero di piastre dipende dal numero di pezzi di tessuto che si stanno trapiantando. Se si utilizzano piastre precedentemente rivestite e conservate a quattro gradi Celsius, portarle a temperatura ambiente prima dell'uso Usando una pinza raccogliere con cura il tessuto dalla piastra originale e posizionarlo al centro dell'asse nella nuova piastra e premere delicatamente I tessuti senza escrescenze devono essere scartati.

Lasciare che il tessuto aderisca alla piastra. Per alcuni secondi, aggiungere il terreno e incubare. Aggiungere quanto descritto in precedenza per X explan.

Quindi due mil di viaggi e una soluzione madre EDTA per ogni piastra di coltura tissutale da cento millimetri. Diluire il brodo con sei mil di PBS steril-0,01 molare e due mil di soluzione madre a sei mil di PBS per una concentrazione finale di tripsina a due 50 microgrammi per mil e per EDTA a cento microgrammi per mil. Dopo aver spostato gli espianti su una nuova piastra, aspirare il terreno dalle piastre con anelli di cella da uno a due centimetri.

Aggiungere otto mil di gocce calde diluite e versare una soluzione in ciascuna piastra da cento millimetri. E posiziona un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre o 15 minuti. Controlla frequentemente.

Lasciare la tripsina in posa troppo a lungo danneggerà le cellule. Controllare le piastre al microscopio per essere sicuri che la maggior parte delle cellule sia stata sollevata, le cellule si arrotonderanno e si staccheranno come mostrato a otto Mils di calore. 10% di FBS in terreno per piastra per inattivare la soluzione EDT a.

Combinare i volumi di tutte le piastre in un'unica provetta o in provette separate di tessuti diversi. Contare le cellule utilizzando una centrifuga Hema Cytometer a cento G per cinque minuti. Alla base del tubo si formerà un pellet di cella che risospenderà il pellet di cella in un mezzo completo fino alla concentrazione di cella desiderata.

Posizionare da due a 3 milioni di celle per matraccio T 75 e aggiungere il terreno completo secondo necessità. Incubazione e modifica dei terreni. Ogni tre o quattro settimane, le cellule crescono fino alla subconfluenza in fiasche D 75.

In circa quattro settimane, le cellule dovrebbero essere sollevate ed espanse o utilizzate a subconfluenza per prevenire il sene. Iniziate con la preparazione delle membrane permeabili dei transwell. Utilizzare gli inserti da 6,5 millimetri che si inseriscono nelle piastre a pozzetti multipli a 24 pozzetti.

Aggiungere il terreno su entrambi i lati della membrana. Punto sei mil in basso e 0,1 mil in alto. Incubare un'ora in incubatore per colture cellulari.

Rimuovere con cautela il substrato da entrambi i lati della membrana. Iniziare prima con attenzione dal volume basale significa che la membrana può essere facilmente danneggiata. Quindi pipettare il terreno lungo il lato dell'inserto di coltura, utilizzare il volume consigliato.

In caso contrario, si verificherà una fuoriuscita di terreno in altri pozzetti per le cellule del seme. Dopo la pre-incubazione del supporto permeabile, pipettare accuratamente la sospensione cellulare nel lato epico della membrana per pozzetti di 6,5 millimetri a 0,1 mil di sospensione cellulare sul lato epico della membrana. Pipetta 0,6 M, media sul lato basale della membrana.

Nutrire le cellule dal lato epico e basale per 10 giorni. Per stabilire uno scambio culturale ben differenziato, medio due volte a settimana. Utilizzando il metodo dimostrato, rimuovere il volume basale.

Per prima cosa, sostituisci il volume epico, aggiungi 0,6 mil di terreno sul lato basale della membrana. Questo metodo favorisce l'adesione delle cellule alla membrana e impedisce che le cellule siano esposte all'aria per lunghi periodi di tempo. Sostituisci rapidamente i media e rimetti a posto un'incubatrice.

Creare un'interfaccia aria-liquido il giorno 10 rimuovendo il terreno AAL e sostituendo gli 0,6 mil di terreno sul lato basale della membrana. Mantenere le celle nell'interfaccia aria-liquido per sei settimane, cambiare i terreni due volte a settimana. Le cellule ciliate inizieranno a comparire quattro settimane dopo la creazione dell'orecchio.

Interfaccia liquida. Le cellule raggiungeranno una differenziazione uniforme in cellule ciliate. Sei settimane dopo la creazione dell'interfaccia del liquido auricolare.

Segmenti bronchiali umani con cellule epiteliali sane da explan e trapianti. Nel nostro studio, le colture di successo da explan del tessuto bronchiale si sono verificate in otto dei nove tessuti. Quando una delle colture explan è stata infettata, gli anelli di cellule epiteliali hanno raggiunto un raggio di uno o due centimetri in tre o quattro settimane.

Gli explan X di successo sono stati nuovamente coltivati fino a sei volte. Tutte le colture di successo mostrano evidenza di migrazione cellulare entro 48 ore dall'inizio dei trapianti, o X explan come mostrato in Le cellule B hanno un aspetto acciottolato che è distinto per queste cellule epiteliali come mostrato in B. E nelle figure successive, l'immunocolorazione di preparati di citosina di cellule da explan e cellule seminate su vetrini coprioggetti ha rivelato che tutte le cellule erano positive per la citocheratina specifica dell'epitelio, qui sono mostrate le cellule bronchiali di sottocoltura umana cresciute fino alla subconfluenza e le fiasche T 75. Notare l'aspetto del ciottolo.

Le cellule bronchiali di sottocoltura umana hanno mostrato un'immunocolorazione positiva uniforme per la cherina e l'immunocolorazione E.Can him con anticorpi specifici contro altri tipi di cellule non ha mostrato alcuna indicazione di contaminazione delle colture da parte di fibroblasti, cellule mesenchimali o endoteliali. Per maggiori dettagli, fare riferimento alla figura cinque e alla sua legenda nel testo Cellule coltivate su membrane permeabili in poliestere o pozzetti con o interfaccia liquida differenziata in epitelio ciliato come dimostrato qui, scartare le cellule e le loro o trapiantare se iniziano ad apparire cellule con una morfologia diversa come dimostrato qui. In questo protocollo, abbiamo presentato metodi dettagliati per la coltura e l'espansione di cellule epiteliali bronchiali umane primarie.

Gli studi basati su cellule umane sono necessari per determinare importanti vie di trasmissione dei meccanismi delle malattie polmonari umane e per la tossicità e lo screening farmacologico di nuovi farmaci. Ci auguriamo che i metodi qui descritti vi incoraggino a coltivare cellule epiteliali bronchiali umane da espianti e a utilizzare queste cellule nei vostri sistemi di studio. Grazie e buona fortuna.