Completa l'analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte II: Carboidrati

La determinazione della composizione polisaccaridica della matrice e del contenuto di cellulosa cristallina delle pareti cellulari delle piante inizia con materiale vegetale essiccato, che viene sottoposto a varie estrazioni. Il materiale risultante è costituito solo da pareti cellulari e poi viene diviso per determinare la composizione polisaccaridica della matrice. Il materiale della parete viene trattato con un acido debole per idrolizzare, polisaccaridi non cristallini, che sono principalmente le emocellulosa nei loro monosaccaridi.

I monosaccaridi vengono poi derivati nei corrispondenti acetati aldolici volatili, che vengono poi analizzati e quantificati mediante gascromatografia accoppiata ad uno spettrometro di massa per la determinazione della cellulosa cristallina. Le pareti di contenuto vengono trattate con il reagente grafico, una miscela di acidi che rimuove i componenti non cristallini della parete. La cellulosa cristallina rimanente viene degradata nel suo monomero glucosio, che può essere dosato, chole metricamente.

La determinazione del contenuto e della composizione della lignina è dimostrata in un'altra pubblicazione video di J intitolata Analisi composizionale completa delle pareti cellulari delle piante, parte prima Lignina. Ciao, sono Marcus Pauley, capo della struttura analitica Wall presso il Great Lakes Bioenergy Research Center qui alla Michigan State University. Sono Cliff Foster, manager della struttura Cell Wall Analytics.

Oggi ti mostreremo come determinare la composizione dei polisaccaridi presenti nel materiale della parete cellulare vegetale che è la cellulosa in varie Homo cellulose. Qui al Great Lakes Bioenergy Research Center, sviluppiamo la tecnologia per convertire questi zuccheri in biocarburanti. Al fine di identificare una materia prima ottimale per le piante, dobbiamo prima valutare il tipo e l'abbondanza di zuccheri presenti in questa biomassa.

In un altro video intitolato Analisi composizionale completa delle pareti cellulari delle piante, prima parte Lignina, ci concentreremo sull'analisi dei polifenoli. Quindi iniziamo. Iniziare questa procedura isolando le pareti cellulari.

Macinare circa 60-70 milligrammi di materiale vegetale essiccato con sfere di acciaio inossidabile da 5,5 millimetri in un tubo con tappo a vite SAR TED da due mil. Utilizzando un mulino REM come alternativa ad alta produttività, utilizzare un robot di macinazione ed erogazione chiamato eyewall, come descritto nella prima parte. Al termine della macinazione, rimuovere le sfere d'acciaio.

Continuare a isolare le pareti cellulari e rimuovere l'amido residuo come mostrato nella prima parte e descritto nel protocollo scritto allegato. Pesare due milligrammi di materiale della parete cellulare dell'amido DS in un tubo sared a due mulini. Un modo ad alta produttività per svolgere questo compito è il robot eyewall.

Il robot prende un tubo contenente materiale vegetale macinato e fa un foro sul fondo del tubo. Il tubo forato viene quindi posizionato su un alimentatore VI. Un tubo vuoto viene posizionato su una bilancia e spostato sotto l'alimentatore VI attraverso la vibrazione, il materiale filtra attraverso il foro nel tubo superiore caricato nel tubo inferiore vuoto fino a quando non si accumula la quantità di materiale desiderata.

Aggiungere 100 microgrammi di acetolo come standard interno. Sciacquare le pareti del tubo con acetone per raccogliere il materiale della parete cellulare sul fondo del tubo ed evaporare l'acetone molto delicatamente sotto il flusso d'aria. Quindi, eseguire l'idrolisi acida debole.

Aggiungere con cautela 250 microlitri di acido tricloroacetico molare o TFA a ciascun campione, assicurandosi che non vengano spruzzati materiale sulle pareti del tubo. Tappare bene le provette e incubare a 121 gradi Celsius in un blocco riscaldante per 90 minuti. Quindi raffreddare i blocchi riscaldanti e i campioni sul ghiaccio e centrifugare le provette a 10.000 giri/min per 10 minuti.

Trasferire 100 microlitri di surnatante acido contenente gli zuccheri solubilizzati del polisaccaride della matrice in fiale con tappo a vite, facendo attenzione a non disturbare il materiale del pellet. Il pellet può essere utilizzato per il saggio della cellulosa cristallina. Far evaporare il TFA in un tubo di vetro sotto un leggero flusso d'aria in un dispositivo di evaporazione.

Aggiungere 300 microlitri di due propanolo per rimuovere il vortice acido in eccesso ed evaporare a 25 gradi Celsius. Ripetere per un totale di tre volte. Al fine di consentire l'identificazione dei monosaccaridi mediante gascromatografia, eseguire una derivatizzazione dell'acetato aldolico.

In primo luogo, ridurre i monosaccaridi ai corrispondenti aldoli dell'anello aperto, che vengono poi acetilati. Consultare il protocollo scritto allegato per istruzioni dettagliate. Ogni fase della procedura segue il protocollo precedentemente mostrato, l'aggiunta dell'evaporazione dell'incubazione del reagente sotto un flusso d'aria, seguita dalla rimozione del reagente in eccesso mediante varie fasi di lavaggio.

Nelle fasi finali, gli acetati aldolici vengono estratti. Per prima cosa, aggiungere 500 microlitri di acetato di etile e agitare leggermente. Quindi aggiungere due mil d'acqua, tappare le provette e vorticare, centrifugare le provette a 2000 giri/min per cinque minuti per ottenere strati trasparenti e separati con acetato di etile sulla parte superiore contenente gli acetati di Al Dettol e acqua sulla pipetta inferiore, 50 microlitri di strato di acetato di etile in fiale GCMS con inserti, diluire aggiungendo 100 microlitri di acetone alla fiala GC e la fiala GC può essere conservata a quattro gradi Celsius.

Se l'analisi GCMS non procede immediatamente, iniettare i campioni in un fotografo di crominanza gassosa dotato di uno spettrometro di massa quadruplo. Per la colonna e i dettagli della corsa, consultare il protocollo scritto allegato. Il materiale di partenza per determinare il contenuto di cellulosa cristallina può essere il materiale della parete cellulare isolata o il materiale della parete già trattato con l'acido debole TFA, immediatamente dopo il trattamento acido o in forma essiccata conservabile.

Dopo aver rimosso l'eccesso di TFA con iso propanolo come mostrato in precedenza, aggiungere al pellet TFA nei due M sar per provetta un M di reagente up degra composto da acido acetico, acido nitrico e acqua, aggiungere un rapporto volume/volume di otto a uno a due. Tappare bene il tubo a vortice e scaldare su un blocco riscaldante a 100 gradi Celsius per 30 minuti. Come risultato di questo trattamento, nel pellet rimane solo cellulosa cristallina.

Tutti gli altri polisaccaridi sono campioni freddi idrolizzati nel blocco su ghiaccio a temperatura ambiente o più fresco. Quindi centrifugare i campioni a 10.000 giri/min per 15 minuti dopo la centrifugazione, scartare il surnatante assicurandosi che il pellet non venga disturbato e che non venga rimosso alcun materiale dal pellet. A tale scopo, lasciare circa 150 microlitri di surnatante nel tubo, lavare più volte il pellet con acqua.

Successivamente, eseguire lo stesso e idrolisi con l'acido solforico concentrato per idrolizzare completamente il cristallo e il pellet di cellulosa in glucosio. Iniziare aggiungendo 175 microlitri di acido solforico al 72% alla provetta sarta e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione iniziale, agitare il campione e incubare per altri 15 minuti.

Quindi aggiungere 825 microlitri di acqua e agitare e centrifugare i campioni a 10.000 giri/min per cinque minuti. Potrebbe esserci del materiale marrone e solubile, per lo più lignina che rimane nel tubo mentre il glucosio è nel surnatante. Il contenuto di glucosio del surnatante viene dosato utilizzando il saggio colormetrico dell'antone.

Questo test viene eseguito in una piastra per microtitolazione in polistirene a 96 pozzetti. Riparare una curva standard del glucosio in duplicato seguendo le istruzioni nel protocollo scritto allegato. Preparare i campioni combinando 10 microlitri di ciascun campione, supernat e 90 microlitri di acqua in pozzetti separati della stessa piastra per microtitolazione come finitura standard, aggiungendo 200 microlitri di reagente appena preparato e gettato.

Successivamente, scaldare la piastra per 30 minuti a 80 gradi Celsius in un forno con un dissipatore di calore in alluminio. Osservare che i campioni contenenti glucosio passano dal giallo al verde blu quando il riscaldamento è completo. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente e agitare accuratamente.

Leggere l'assorbimento a 625 nanometri utilizzando un lettore di piastre per microtitolazione. Il contenuto di glucosio, l'elemento costitutivo della cellulosa, viene calcolato in base all'assorbanza rispetto alla curva standard stabilita sulla stessa piastra. Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi dell'analisi dei polisaccaridi di un pezzo di legno di pioppo.

I picchi del gascromatogramma sono identificati da profili di massa e/o tempi di ritenzione degli standard. I monosaccaridi sono quantificati sulla base di curve standard. L'analisi degli zuccheri dei polisaccaridi della matrice mostra un'elevata abbondanza di xilosio che rappresenta l'emicellulosa xam, ma sono presenti anche altri zuccheri.

Secondo l'analisi, il 40% del materiale di pioppo è costituito da cristallo e cellulosa. Si prega di notare che questi contenuti e composizioni possono variare da pianta a pianta o tra diverse anatomie vegetali. Vi abbiamo appena mostrato come determinare il contenuto di polisaccaridi e l'analisi composizionale della biomassa lignanocellulosica per l'analisi della lignina polifenolica.

Sintonizzati sulla prima parte. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.