Name: Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Impara la purificazione della proteina MamAΔ41 associata ai magnetosomi in Magnetospirillum magneticum AMB-1. Questo protocollo dettagliato utilizza cromatografia di affinità, scambio ionico ed esclusione molecolare per ottenere proteine pure.

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Noi riconosciamo il dottor Amir Aharoni per il suo sostegno e Gheula Davidov, Noam Grimberg e Chen Guttman per i loro consigli e commenti.

1. Clonazione ed espressione di Mama Gene in E. coli Il gene mutante mamAΔ41 è stato amplificato utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR) dal DNA genomico di Magnetospirillum magneticum AMB-1, con primer: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'e 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. Nei frammenti di DNA amplificato, un sito che NcoI è stato introdotto al codone di inizio ATG e il codone di terminazione è stata sostituita con un sito ScoI. I frammenti sono stati digeriti con NcoI e Saci e clonato nei rispettivi siti di pET52b (+), dando luogo a pET52bMamAΔ41-AMB1. In questo costrutto, il gene è stato fuso mamAΔ41 in-frame con il suo tag-10 al C-terminale. Il plasmide è stato elettroporate in ceppo di E. coli BL21. E. coli ceppo BL21 ospitare pET52bMamAΔ41 è stato coltivato in auto-induzione (15) su terreno contenente ampicillina (50 mg / ml) 310 ° K per 3 ore. La temperatura di coltivazione è stato poi spostato da 310 ° a 300 ° K e mantenuti per ulteriori 48 ore a 300 ° K. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 5465g per 10 min a 277 ° K. 8 litri cultura prodotta 60 grammi di pellet umido. 2. Bioinformatica Calcoli I calcoli di peso molecolare (MW), secondo la sequenza aminoacidi acidi e l'assorbimento previsto di 1mg/1ml di proteine ​​a 280 nm, utilizzando il server ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Per 10His-Tag-MamAΔ41 il MW è 22.529 Da (240 aminoacidi) e per MamAΔ41 (con 9 aminoacidi sinistra dopo la sua rimozione dal tag-trombina) il Mw è 20596.5Da (187 aminoacidi). L'assorbimento del predetto 1mg/1ml di proteine ​​a 280 nm per 10His-Tag-MamAΔ41 è 0,595 e per MamAΔ41 è 0,579. Inoltre, la sequenza di amminoacidi non contiene residui di cisteina. Pertanto, agenti riducenti non sono richiesti durante il processo di purificazione. 3. Purificazione di MamAΔ41 <ol><li> Per la preparazione delle soluzioni madre, pesare e preparare (200 ml) nelle concentrazioni seguenti: imidazolo (MW 228,2 g / mol) 4M soluzione NaCl (Mw 58,44 g / mol) 5M soluzione, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol soluzione) 1M, aggiustare il pH = 8. Aggiungere acqua bidistillata (DDW) e miscelare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Soluzioni di filtraggio con filtro 0.22μm e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare e filtro 6 tamponi freschi soluzioni di riserva (Tabella 1). </li><li> Diluire e sospendere le cellule in un tampone di A in rapporto 1:2, grammi di cellule per tamponare volume (ml). </li><li> Aggiungere 10μl per ogni 10gr di batteri di DNasi I (1 mg / ml) al fine di rompere frammenti di DNA nel campione. Aggiungere 1ml per ogni 20gr di batteri di cocktail EDTA inibitore della proteasi libero. Incubare per 20 minuti sul ghiaccio. </li><li> Turbativa celle da due cicli di stampa francese a 25.000 psi. A differenza di sonicazione, la stampa francese si rivolge ad alto volume (10 ml&gt;) estrusione in cella forzando le cellule ad alta pressione attraverso un orifizio sottile. Il pistone deve essere raffreddato in ghiaccio per dieci minuti prima del suo utilizzo e il montaggio a causa di accumulo di temperatura. </li><li> Trasferire le cellule lisate in provette da 25 ml ultracentrifuga ed equilibrio con precisione (50mg) con tampone A fino a quando l'esemplare ha raggiunto la linea del collo del tubo s. </li><li> Detriti cellulari Ultra separata per centrifugazione a 270.000 g per 1 ora a 277 ° K. </li><li> Preparare una casa colonna gravità Ni NTA (2,5 cm di diametro) con l'aggiunta di 4 ml di Ni NTA resina, che si conserva in etanolo al 20%, sulla colonna. Lasciar cadere del tutto fluido, quindi lavare con 40 ml di DDW e lasciar cadere del tutto fluido. Pre-equilibrata la resina nella colonna con 40 ml di tampone A. </li><li> Applicare la frazione solubile da ultra-centrifugazione tubi sulla colonna gravità Ni NTA. Lasciar cadere liquido, raccogliere flow-through (non legato) e conservare a 277K. </li><li> Raccogliere campioni di pellet da ultra-centrifugazione tubi utilizzando una piccola mancia per la demolizione del pellet. Mescolare la punta in 50μl del 5% β-mercaptoetanolo in 2X SDS-PAGE tampone del campione. </li><li> Lavare la colonna con 100 ml di tampone B. Lasciate che la goccia fluida, raccogliere flow-through e preservare a 277K. </li><li> Preparare 15 segnato tubi eppendorf (1,5 ml). </li><li> Eluizione - valvola colonna stretta e quindi caricare 1 ml di tampone C nella colonna; incubare per 3 minuti seguito da apertura della valvola e di flusso attraverso la raccolta. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Resto eluire di sospensione a incrementi di 1 ml di tampone C e chiudere la valvola. </li><li> Misura OD a 280 nm delle frazioni e di valutare la localizzazione del picco proteine, se l'OD è ancora&gt; 0,3, campioni supplementari sono necessari. </li><li> SDS-PAGE analisi delle frazioni raccolte. Tale analisi deve essere eseguita anche con gli esempi seguenti, le proteine ​​non legato flow-through, lavare flow-through e uLTRA-pellet centrifugazione del campione. Mescolare 10μl di ciascun campione con 10μl del 5% β-mercaptoetanolo in 2X SDS-PAGE tampone del campione. Caricare i campioni, il 15% SDS-PAGE e correre per 45 minuti a 180 Volt. </li><li> Macchia il gel in 15 ml di soluzione InstantBlue, agitare per 1 ora. Assicurarsi che la scatola di plastica è coperto e protetto dalla luce. </li><li> Valutare gel, se espressione della proteina è alta e specifiche in base alle fasce indicative, unione selezionato frazioni eluite. </li><li> Al fine di rimuovere 10-His-tag, aggiungere trombina di origine bovina (10 unità / mL), 10μl trombina per 1 mg di proteina, secondo le indicazioni del produttore per il campione combinato. </li><li> La dialisi è utilizzato per eccesso di rimozione imidazolo e diminuire le concentrazioni di NaCl per i livelli necessari durante l'associazione a scambio ionico. Per dialisi, lunghezza desiderata di 7 kD peso molecolare tagliato fuori (MWCO) tubi di dialisi. Lavare con DDW e fare un nodo ad una estremità (o sigillo con clips). Trasferire la soluzione proteina fusa sulla borsa lasciando qualche spazio in alto e morsetto in su. </li><li> Immergere il tubo di dialisi in 4 buffer di dialisi litri refrigerato (Buffer D). Agitare la soluzione lentamente durante la notte a 277 ° K. </li><li> Estrarre il tubo di dialisi del bicchiere, fare un taglio piccolo e trasferire la proteina a tubo 50ml. </li><li> Cromatografia a scambio ionico: assemblare preconfezionati MonoQ 4.6/100 colonna PE sul veloce Performance Liquid Chromatography (FPLC). Lavare la colonna con 5 volumi di colonna (CV) di DDW acqua filtrata. Equilibrata la colonna con 5 CV di tampone D. </li><li> Lavare il ciclo di iniezione con DDW (due volumi loop) e ripetere con il tampone D. carico della proteina nel ciclo di iniezione. </li><li> Iniettare il campione (flusso di 1 ml / min) e iniziare a raccogliere frazioni per SDS-PAGE rilevazione di proteine ​​senza limiti. </li><li> Se il volume delle proteine ​​iniziale (passo 3.23) è più grande ansa di iniezione, ripetere i passaggi 3,25-3,26, senza lavare il ciclo, fino a quando l'intero campione è stato caricato su colonna. </li><li> Lavare la colonna con 3 CV di tampone C al fine di rimuovere le proteine ​​illimitato. </li><li> Eluire la proteina con un gradiente di 60 min lineare di 40 2000mm NaCl tra i respingenti D &amp; E (quando E tampone al 100% è la fine del gradiente), portata 1 ml / min (anche se portate superiori può essere utilizzato nel costo del volumi più grandi, ma meno concentrati, i picchi delle proteine). Raccogliere i picchi proteine ​​come appaiono nel cromatogramma 280nm. </li><li> Pulire preconfezionati colonna in base alla produzione di raccomandazione. </li><li> SDS-PAGE analisi delle frazioni raccolte. Tale analisi deve essere eseguita con i seguenti esempi, le proteine ​​illimitata flow-through e proteine ​​picchi di deflusso. Eseguire la SDS-PAGE e macchia menzione in passi 3,17-3,18. </li><li> Valutare gel per l'esistenza di proteine ​​bande al Mw previsto secondo il marcatore proteico pre-colorato. Unisci frazioni di eluizione selezionate che contengono la proteina in questione. </li><li> Dializzare i campioni fusa, in modo da abbassare le concentrazioni di NaCl necessaria per cromatografia dimensione esclusione. Eseguire la dialisi, come indicato nei passi 3,21-3,23 contro tampone F. </li><li> Concentrare il campione di proteine ​​con un Vivaspin-15 10000 MWCO a 8 mg / ml in una centrifuga da tavolo, 4000 rpm. Convalidare concentrazione desiderio da parte delle DO a 280 nm in cuvette al quarzo. Se la proteina è troppo concentrato diluirla con F tampone e misurare di nuovo. </li><li> Montare l'esclusione dimensioni preconfezionati colonna, HiLoad 26/60 Superdex 200, su FPLC; lavare la colonna con 3 CV di DDW acqua filtrata. Equilibrata la colonna con 3 CV di tampone F. </li><li> Lavare ciclo di iniezione con DDW 5ml (due volumi loop) seguito da stesso volume con il tampone di F. carico non più di 4 ml del campione di proteine ​​nel ciclo di iniezione. </li><li> Iniettare il campione (portata di 3,5 ml / min) e iniziare a raccogliere frazioni di picco proteine ​​come appaiono lo cromatogramma 280nm. Lasciate che il flusso del buffer fino a raggiungere il volume della colonna. </li><li> Se il volume delle proteine ​​iniziale (passo 3.23) è più grande ansa di iniezione, ripetere i passaggi 3,25-3,26, senza lavare il ciclo, fino a quando l'intero campione è stato caricato su colonna. </li><li> Pulire preconfezionati colonna secondo le raccomandazioni fabbricazione. </li><li> SDS-PAGE analisi delle frazioni raccolte. Tale analisi deve essere eseguita con i campioni di proteine ​​picchi. Eseguire la SDS-PAGE e macchia menzione in passi 3,17-3,18. </li><li> Valutare gel: se i picchi sono proteine ​​specifiche, nella corretta Mw previsto secondo il marcatore proteico pre-colorati e una sola banda è visibile unione selezionato frazioni eluizione della proteina in questione. </li><li> Concentrato campione di proteine ​​con un-15 Vivaspin 10.000 MWCO a&gt; 20 mg / ml in una centrifuga da tavolo, 4000 rpm. Convalidare concentrazione desiderio da parte delle DO a 280 nm. Il MamAΔ41 purificato è stato poi concentrato a 26,5 mg / ml per la cristallizzazione. </li> &lt;li&gt; Conferma la purezza del campione e l'identificazione delle proteine ​​con Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI-TOF). <li> Se la proteina è purificata secondo spettrometro di massa e SDS-PAGE, dividere il MamAΔ41 concentrato di pre-marcato tubi eppendorf; 25-50μl proteina in ciascuno. </li><li> Flash congelati in azoto liquido e conservare a 193 ° K. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Quando questo protocollo è fatto correttamente si dovrebbe ottenere altamente purificato, campioni di proteine ​​grandezza omogenea e concentrata. Questi campioni di proteine ​​sono pronti per le prove di cristallizzazione e studi biochimici, come la cinetica enzimatica, affinità di legame e di più. Qui descritte sono risultati rappresentativi delle fasi essenziali del protocollo di purificazione. SDS-PAGE L'analisi del profilo di eluizione di Ni-NTA colonna di affinità dovrebbe rivelare molto più di proteina espressa nella frazione solubile in MW appropriati di circa 22kDa (Figura 1). Questa SDS-PAGE analisi dovrebbe anche rivelare minimo eventuali proteine ​​nelle proteine ​​sconfinato flusso continuo, lavare flow-through e ultra-centrifugazione del campione di pellet. Se grandi fasce della proteina appropriati appaiono in questi campioni si dovrebbe considerare la preparazione sbagliata tampone, problemi di rottura delle cellule in coltura o problemi di auto-induzione condizioni e la crescita. Cromatografia a scambio ionico è preformato per separare tra la nostra proteina auspicabile altre proteine ​​E.coli che erano legati alla resina nichel (a causa di interazioni elettrostatiche o istidina / negativo amino acidi ricchi di proteine ​​loop) e non tagliato His-tag proteina desiderabile. Questa colonna separa le proteine ​​in base alla loro affinità di legame alla resina carica positiva con concentrazioni crescenti di NaCl. Proteina forte carica negativa si eluire in concentrazioni più elevate di NaCl appose a moderata quelli a carica negativa. I vantaggi di questa colonna sono elevata portata e capacità di legame. Il cromatogramma a scambio ionico (Figura 2) rivela una buona separazione tra i 3 popolazioni di proteine ​​per aumentare la concentrazione di NaCl. SDS-PAGE analisi è necessaria al fine di determinare MW di ciascuna popolazione, isolando quella desiderabile e valutare se le fasi di depurazione sono necessarie ulteriori. La popolazione prima è MamAΔ41 (~ 20 kDa) mentre la seconda popolazione è MamAΔ41 + Il suo Tag (~ 22kDa) che non è stata tagliata da trombina bovina e la popolazione terzo è rilevabile in SDS-PAGE a causa di bassa concentrazione. Se i picchi proteine ​​non sono separate in modo chiaro si dovrebbe considerare la preparazione sbagliata tampone o modificare la pendenza del gradiente di NaCl. Esclusione cromatografia dimensione è preformato per separare tra la nostra proteina auspicabile altre proteine ​​cellulari E.coli che erano legati al Ni-NTA resina e non sono stati separati durante la cromatografia a scambio ionico. Questa colonna separa le proteine ​​in base alle loro dimensioni. Proteine ​​di grandi dimensioni si eluire in volumi di eluizione più piccoli rispetto a quelli più piccoli che verranno eluiti in grandi volumi. Il cromatogramma colonna (figura 3) mostra una buona separazione della proteina desiderabile come una popolazione principale. La popolazione sembra eluire monomero di dimensioni adeguate con un MW di ~ 20 kDa. La presenza di banda ~ 80 kDa (proteina E.coli tipico che si lega al Ni-NTA resina) viene rilevato in SDS-PAGE prima del caricamento della colonna e scompare durante questa corsa. Poiché la concentrazione di questa proteina 80 kDa ~ è basso per cominciare, la sua popolazione non appare nel cromatogramma a causa della sua diluizione e SDS-PAGE analisi è necessaria per determinare l'efficienza di purificazione. Si consiglia di caricare un campione diluito e concentrato del picco principale al SDS-PAGE così si poteva sicuramente determinare la presenza di una proteina pura in MW appropriato. A questo punto la proteina è purificata e la sua omogeneità dovrebbe essere valutata con MALDI-TOF. Questa analisi ha rivelato una proteina in MW di 20347 Da e un altro in Mw di 10.176 Da (Figura 4). I 10 kDa ~ è la proteina 20 kDa ~ raddoppiato carica. La MW previsto di MamAΔ41 con i 9 aminoacidi sinistra dopo la sua rimozione è stata-Tag Da 20596,5. Confrontandolo con il ottenute MALDI-TOF MW abbiamo scoperto che sono 248 Da parte. Questa diversità può derivare da MALDI-TOF errori di misura e / o causa di degrado comune della metionina primo e il secondo glicina. Per concludere, la proteina è altamente purificato e può essere utilizzato per ulteriori esperimenti. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella 1. Formulazioni tampone. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentante SDS-PAGE analisi di Ni-NTA purificazione colonna Da destra a sinistra;. P-ultra-centrifuga a pellet (3.11 passo protocollo), W-wash (3.12 passo protocollo), U-illimitata proteine ​​(3.10 passo protocollo), E- cinque corsie di eluizione samples (3,14 passo protocollo), M - marker di proteine ​​(i numeri indicano MW). La freccia indica MamAΔ41. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analisi del passo cromatografia a scambio ionico (a) a scambio ionico (colonna MonoQ) cromatogramma; Blu - 280nm assorbimento, rappresenta la concentrazione di proteine, Green-NaCl concentrazione, Rosso - l'indicazione delle frazioni raccolte. (B) Rappresentante SDS-PAGE analisi della fase di purificazione a scambio ionico. Da sinistra a destra; M - marker di proteine ​​(i numeri indicano Mw), A6 - frazione primo picco, A8-secondo frazione di picco. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Esclusione analisi cromatografia dimensioni (a) esclusione Dimensioni (200 Superdex colonna) cromatogramma; Blu - 280nm assorbimento, rappresenta la concentrazione di proteine, indicazione Rosso delle frazioni raccolte. (B) Rappresentante SDS-PAGE analisi di fase di purificazione esclusione dimensioni. Da sinistra a destra; M-proteina marker (i numeri indicano MW), Prei-pre-iniezione del campione, A4-6 frazione combinato raccolti dal primo picco, A4-6D-diluiti frazione raccolta dalla vetta. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI-TOF) spettro di massa di purificato MamAΔ41. La matrice è l'acido Sinapic (SA). MamAΔ41 mostrato a 20347 Da, anche mostrato è la specie raddoppiato carica di MamAΔ41 a 10176 Da.

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Purificazione di proteine ​​è il passo principale in qualsiasi biochimica delle proteine ​​o studi strutturali. Dato che ogni proteina è unico, con il proprio comportamento, si ha la necessità di definire le sue proprietà e modificare di conseguenza la sua purificazione. Obiettivo di proteine ​​deve essere analizzato come un primo passo verso la purificazione mediante strumenti bioinformatici. Sono utilizzati per calcolare la iso-elettrico punto di destinazione, valutare la sua necessità di ridurre / ossidanti dell&#39;...

<table><tbody><tr><td>French Press</td><td>Attrezzatura</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>Cella a pressione</td><td>Attrezzatura</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Attrezzatura</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>Rotore</td><td>Attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga; provette con tappo da 26,3 ml</td><td>Attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>Colonne cromatografiche in vetro da 2,5 cm di diametro, Econo-Column</td><td>Attrezzatura</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA His Bind</td><td>Attrezzatura</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Attrezzatura</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette in quarzo</td><td>Attrezzatura</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia liquida ad alte prestazioni – AKTA purifier 10</td><td>Attrezzatura</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Colonna a scambio ionico &amp;#8211; MonoQ 4,6/100 PE</td><td>Attrezzatura</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>Colonna pre-impacchettata per esclusione dimensionale – HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>Attrezzatura</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon – Vivaspin15 &amp;#8211; 10.000 MWCO</td><td>Attrezzatura</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Attrezzatura</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Attrezzatura</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (idrossimetil) aminometano</td><td>Reagente</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Reagente</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Reagente</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori delle proteasi senza EDTA</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I (Deossiribonucleasi I)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Trombina bovina</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Reagente</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>Sodio dodecilsolfato (SDS)</td><td>Reagente</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Reagente</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Reagente</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione della m. magneticum strain amb-1 proteina magnetosome associated mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Batteri magnetotactic comprendono un gruppo eterogeneo di microrganismi acquatici che sono in grado di orientarsi lungo i campi geomagnetici. Questo comportamento è creduto per aiutare la loro ricerca di ambienti adatti<em&gt; (1)</em&gt;. Questa capacità è conferita dal magnetosome, un organello subcellulare che consiste in una catena di montaggio lineare di vescicole lipidiche ognuno in grado di biomineralize e allegare una 50-nm ~ cristallo di magnetite o greigite. Un componente principio della magnetosome che ha dimostrato di essere necessario per la formazione di vescicole funzionale è mamma. Mama è una grande abbondanza magnetosome proteina associata, che è uno dei più caratterizzato magnetosome proteine ​​associate<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. Questo articolo si concentra sulla purificazione della mamma, che nonostante in fase di studio<em&gt; In vivo</em&gt;, Nessun dettaglio chiara funzionale o strutturale sono stati identificati per questo. Bioinformatica analisi ha suggerito che la mamma è una tetra-tricopeptide ripetizione (TPR) contenente proteine. TPR è un motivo strutturale trovato come parte o formazione di una piega più grande in una vasta gamma di proteine, serve come modello per interazioni proteina-proteina e media multi-proteina complessi<em&gt; (7)</em&gt;. TPRs sono coinvolti in molte attività cruciali nei processi eucariotiche organello cellulare e molti percorsi batterica<em&gt; (8-14).</em&gt; Per capire la mamma, un TPR unico contenente proteine, proteine ​​altamente purificate è necessario, come primo passo. In questo articolo presentiamo il protocollo di purificazione di una stalla Mama cancellazione mutante (MamAΔ41) da<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Mama è un unico Magnetosome proteina associata che ha dimostrato di essere coinvolti nella attivazione magnetosome. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione di Mama cancellazione mutante (MamAΔ41) da<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

I batteri magnetotattici comprendono un gruppo diversificato di microrganismi acquatici in grado di orientarsi lungo i campi geomagnetici. Questo comportamento è...

Il processo di purificazione inizia con i pellet cellulari che esprimono la proteina ricombinante Mame. Delta 41. Dopo la rottura della membrana cellulare, segue la separazione della frazione solubile e di quella insolubile. Per estrarre la proteina ricombinante solubile, la cromatografia per affinità separa la proteina ricombinante marcata dalle altre proteine cellulari.La cromatografia a scambio ionico separa mamma Delta 41 dalle altre proteine cellulari che rimangono dopo la cromatografia per esclusione dimensionale e quella per affinità. La cromatografia separa ulteriormente mamma Delta 41 e rivela il suo stato oligomerico. Infine, viene analizzata la purezza e l'omogeneità della proteina ricombinante.Ciao, sono Raza, il responsabile del Laboratorio XVA del Dipartimento di Scienze della Vita presso la Benon University of the Negative. Sono Natalie, anch'io proveniente dal Laboratorio Z. Oggi vi mostreremo un procedimento per la purificazione di proteine ricombinanti.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le proteine associate al magnetismo. Cominciamo all'inizio di questo protocollo. La proteina MAME Delta 41 viene espressa come proteina fusa con 10 istidine.In coltura di cellule BL21 E. coli, far crescere le cellule in un mezzo di induzione automatica contenente Epi Brazilin a 310 K per tre ore. Successivamente, ridurre la temperatura di coltivazione a 300 K e lasciare che le cellule incubino per 48 ore. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, eliminare il soprannatante per decantazione e pesare il pellet cellulare ottenuto.Otto litri di coltura dovrebbero produrre circa 60 grammi di pellet cellulare umido. Prima della purificazione della proteina, preparare 200 millilitri di soluzioni tampone di quattro molarità di ile, cinque molarità di cloruro di sodio e una molarità di tris HCl a pH 8.Utilizzando acqua bidistillata o DDW, vortexare le soluzioni fino a quando diventano limpide e filtrarle con un filtro da 0,22 micrometri. Filtrare le soluzioni stock appena preparate e i tamponi A-F come descritto nel protocollo scritto accompagnatorio a questo video. Per iniziare la purificazione delle proteine, risospendere le cellule nel tampone A in un rapporto da uno a due tra massa cellulare e volume del tampone.Per ogni 10 grammi di batteri, aggiungere 10 microlitri di dna, uno per digerire eventuali frammenti di DNA nel campione. Quindi aggiungere un millilitro di E dt, un cocktail inibitore di proteasi privo di enzimi. Per ogni 20 grammi di batteri, incubare la soluzione per 20 minuti sul ghiaccio.Dopo l'incubazione, lisare le cellule con due cicli di pressa francese a 25.000 PSI. A causa dell'aumento di temperatura, il pistone deve essere raffreddato sul ghiaccio per 10 minuti prima dell'uso. Trasferire le cellule lisate in provette da ultracentrifuga da 25 millilitri.Riempire i tubi fino al livello del collo con il tampone A e bilanciarli con precisione. Successivamente, separare i detriti cellulari mediante ultracentrifugazione. Nel frattempo, assemblare una colonna a gravità al nichel NTA aggiungendo quattro millilitri di resina al nichel NTA a una colonna di vetro da 2,5 centimetri.Preparare la resina per la purificazione delle proteine seguendo le istruzioni del produttore e di S. Una volta centrifugati i campioni, versare la frazione solubile dai tubi di ultracentrifugazione sulla colonna di NTA al nichel. Raccogliere le proteine non legate nella frazione di flusso iniziale.Continuare a lavare la colonna con 100 millilitri di tampone B e raccogliere il flusso in uscita. Conservare le frazioni del flusso in uscita a 277 K. Eluire la proteina in 15 provette eppendorf numerate da 1,5 millilitri. Chiudere la valvola della colonna e caricare un millilitro di tampone C sulla colonna.Dopo un tempo di incubazione di tre minuti, aprire la valvola e raccogliere il flusso in uscita. Ripetere questo passaggio tre volte. Continuare a eluire la proteina a incrementi di un millilitro di tampone, senza l'incubazione di tre minuti.Utilizzando uno spettrofotometro UV, individuare il picco proteico nelle frazioni misurando la densità ottica a 280 nanometri. Infine, eseguire un'analisi SDS-PAGE delle frazioni raccolte. La proteina non legata passa attraverso il lavaggio, il flusso in uscita e un campione di pellet ottenuto per ultracentrifugazione, proveniente dal gel.Determinare quali frazioni eluite presentano livelli elevati di proteine ed unire le frazioni selezionate. Per rimuovere il tag 10 hiss, aggiungere 10 microlitri di trombina bovina per ogni milligrammo di proteina al campione combinato. Successivamente, dializzare il campione contro il buffer D per rimuovere l'eccesso di in midol e ridurre la concentrazione di cloruro di sodio.In previsione della cromatografia a scambio ionico, tagliare un pezzo di tubo dialitico con cutoff del peso molecolare di sette chilodalton della lunghezza desiderata. Lavare il tubo con acqua deionizzata e distillata (DDW) e formare una borsa annodando un'estremità. Trasferire la soluzione proteica digerita con trombina nella borsa, lasciando dello spazio nella parte superiore. Chiudere il tubo dialitico con una molletta.Immergere il tubo da dialisi in quattro litri di tampone D freddo. Mescolare lentamente la soluzione durante la notte a 277 K; dopo la dialisi notturna, rimuovere il tubo dal becher. Effettuare un piccolo taglio e trasferire la proteina in una provetta Falcon da 50 millilitri. La cromatografia a scambio ionico viene utilizzata per ulteriormente purificare la proteina memay Delta 41. Collegare una colonna pre-impacchettata mono Q4 0.6 100 PE a un sistema purificatore FPLC ACTA.Lavare la colonna con cinque volumi di colonna (CVS) di acqua deionizzata filtrata, quindi equilibrare la colonna con cinque volumi di colonna di tampone D. Lavare il loop di iniezione con due volumi del loop di acqua deionizzata seguiti da due volumi del loop di tampone D. Caricare la proteina nel loop di iniezione. Iniettare il campione proteico a una velocità di flusso di un millilitro al minuto e iniziare la raccolta delle frazioni, che verranno utilizzate per la rilevazione mediante elettroforesi SDS-PAGE delle proteine non legate.Continuare a caricare ed iniettare la proteina finché l'intero campione non è stato caricato sulla colonna. Lavare la colonna con tre volumi di colonna di tampone D. Per rimuovere le proteine non legate, eluire la proteina in 60 minuti a un flusso di un millilitro al minuto, utilizzando un gradiente lineare di cloruro di sodio che inizia a 40 millimoli e termina a due moli. Raccogliere i picchi proteici man mano che appaiono nel cromatogramma a 280 nanometri dopo aver raggiunto il 100% del tampone E.Pulire la colonna prepec seguendo le raccomandazioni del produttore. Eseguire l'analisi SDS-PAGE delle frazioni FPLC raccolte, inclusi la proteina non legata e il flusso della frazione proteica, utilizzando marcatori precolorati. Valutare le bande proteiche per identificare le frazioni contenenti la proteina al peso molecolare previsto di Mame.Delta 41 unire le frazioni selezionate in previsione della cromatografia di esclusione molecolare. La concentrazione di cloruro di sodio dei campioni uniti viene ridotta mediante dialisi, come descritto in precedenza, contro il tampone f. Dopo dialisi notturna.Utilizzare una centrifuga da banco per concentrare il campione proteico mediante un concentratore centrifugo con cutoff di peso molecolare di 10.000. Concentrare la proteina fino a otto milligrammi per millilitro a 4.000 giri al minuto. Verificare la concentrazione desiderata misurando l'OD a 280 nanometri in una cuvetta di quarzo.Assemblare la colonna pre-impacchettata per esclusione dimensionale di tipo high load 26 60 superdeck 200 su un sistema di purificazione FPLC ACTO. Lavare la colonna con tre volumi di colonna di acqua filtrata ed equilibrare la colonna con tre volumi di colonna del tampone F. Lavare il loop di iniezione con due volumi del loop di acqua deionizzata (DDW), seguiti dallo stesso volume del tampone F. Una volta che l'FPLC è stato lavato ed equilibrato, caricare il campione proteico nel loop di iniezione. Iniettare il campione proteico e iniziare a raccogliere le frazioni corrispondenti al picco proteico man mano che appaiono nel cromatogramma a 280 nanometri.Lasciare scorrere il tampone fino al raggiungimento del volume vuoto della colonna. Pulire la colonna pre-impacchettata seguendo le raccomandazioni del produttore. Eseguire l'analisi SDS-PAGE delle frazioni raccolte e valutare il gel.La proteina dovrebbe apparire al peso molecolare previsto corretto in base al marcatore di peso molecolare e dovrebbe essere visibile una sola banda. Unire le frazioni di proteina pure e concentrare il campione di proteina a una concentrazione superiore a 20 milligrammi per millilitro utilizzando un concentratore centrifugo con cutoff di peso molecolare di 10.000 e una centrifuga da banco. Verificare la concentrazione desiderata misurando l'OD a 280 nanometri.Confermare la purezza e l'identità del campione di MAME delta 41 mediante spettrometria di massa MALDI-TOF in modalità lineare. Infine, dividere la proteina MAME delta 41 concentrata e purificata in provette eppendorf pre-etichettate, con un volume compreso tra 25 e 50 microlitri ciascuna. Il campione può essere congelato rapidamente in azoto liquido e conservato a 193 K. Questo protocollo dovrebbe produrre un campione altamente puro e omogeneo per dimensione della proteina MAME Delta 41. L'analisi SDS-PAGE del profilo di eluizione dalla colonna al nichel-NTA rivela livelli elevati della proteina MAME delta 41 con tag 10xHis nelle frazioni di eluizione a circa 22 chilodalton.L'analisi tramite elettroforesi SDS-PAGE rivelerà anche la presenza della proteina MAME Delta 41 nel flusso di proteine non legate, nel lavato, nel flusso passante e nel pellet ottenuto mediante ultracentrifugazione. Se in questi campioni compaiono bande intense intorno ai 22 chilodalton, è necessario procedere alla risoluzione dei problemi. Viene eseguita una cromatografia a scambio ionico per separare la proteina MAME Delta 41 dalle altre proteine presenti nel campione mediante scambio ionico.Con concentrazioni crescenti di cloruro di sodio, il cromatogramma di scambio ionico rivela una buona separazione tra due popolazioni di proteine in presenza di cloruro di sodio crescente. L'analisi della concentrazione dei campioni mediante elettroforesi SDS-PAGE rivela il peso molecolare di ciascuna popolazione. Il primo picco corrisponde a MAME delta 41, mentre il secondo picco è la proteina MAME delta 41 10 hiss che non è stata scissa dalla trombina bovina.Se la cromatografia a scambio ionico non produce picchi proteici completamente risolti, verificare la preparazione dei tamponi e la pendenza del gradiente di cloruro di sodio. L'ultimo passaggio della purificazione di MAME delta 41 è la cromatografia a esclusione molecolare. Il cromatogramma rivela un singolo picco che eluisce a 20 kilodalton.Viene effettuata l'analisi della dimensione del monomero appropriato della proteina MAME Delta 41 mediante spettrometria di massa MALDI per verificare la proteina MAME delta 41 purificata. Questa analisi rivela due specie, una corrispondente alla proteina monoprotonata a 20.347 Dalton e l'altra alla proteina biprotonata a 10.176 Dalton. Il peso molecolare previsto per la proteina ricombinante MAME delta 41 dopo la rimozione del tag istidina è di 20.597 Dalton.La piccola differenza di 250 Dalton potrebbe essere dovuta alla comune degradazione della prima metionina nella seconda glicina. I risultati mostrano una proteina MAME delta 41 altamente purificata. Può essere utilizzata per ulteriori esperimenti.Abbiamo appena mostrato come purificare una proteina ricombinante di sillaba. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di aggiustare i tamponi in base alle caratteristiche specifiche della propria proteina e di effettuare questi esperimenti nel minor tempo possibile. Questo è tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Il video spiega un modo per purificare le cellule B mediante targeting immunomagnetico e separazione dalla sospensione di cellule mononucleate del sangue periferico. Il metodo prevede la marcatura di tipi di cellule indesiderate con anticorpi o ligandi specifici (legati a particelle magnetiche) che hanno come bersaglio specifiche proteine della superficie cellulare, da esaurire dalla sospensione cellulare eterogenea mediante separazione magnetica.

Selezione immunomagnetica negativa: un metodo per purificare le cellule B dalle cellule mononucleate del sangue periferico

In questo video, dimostriamo una procedura per isolare gli esosomi dai biofluidi bersaglio utilizzando microsfere magnetiche. La procedura consente la cattura rapida degli esosomi, che possono essere utilizzati per l'analisi a valle.

Estrazione di esosomi basata su biglie magnetiche: una tecnica per isolare esosomi specifici dai biofluidi

In questo video, descriviamo un protocollo per isolare le cellule CD11b, inclusa la microglia, da cervelli di cuccioli di topo utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente. I tessuti cerebrali vengono omogeneizzati per ottenere sospensioni a singola cellula, che vengono incubate con microsfere rivestite di anticorpi anti-CD11b, seguite da una separazione basata su colonna magnetica per purificare la popolazione cellulare CD11b+.

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Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.

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Questo manoscritto descrive l'erogazione efficiente, non virale miR alle cellule endoteliali da un vettore PEI / MNP e la loro magnetizzazione. Così, oltre alla modificazione genetica, questo approccio consente di orientamento delle cellule magnetica e risonanza magnetica rilevabilità. La tecnica può essere utilizzata per migliorare le caratteristiche dei prodotti cellulari terapeutici.

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione dei compartimenti cellulari dove antigeni esogeni vengono elaborati dal reticolo endoplasmatico-collegata di degradazione in cross-presentazione.

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Un metodo di omogeneizzazione ad alta velocità assistito da separazione magnetica per la produzione su larga scala di vescicole derivate da endosomi

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Impara la purificazione della proteina MamAΔ41 associata ai magnetosomi in Magnetospirillum magneticum AMB-1. Questo protocollo dettagliato utilizza cromatografia di affinità, scambio ionico ed esclusione molecolare per ottenere proteine pure.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

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