Capacità di analizzare il diffusibili molecole di segnalazione per l'orientamento embrionali assoni spinali commissurali

Si isolano espianti di midollo spinale dorsale da embrioni di ratto e li si coltiva in un collagene tridimensionale. Il gel viene posto in opposizione a cellule che esprimono una molecola segnale candidata. La capacità della molecola segnale di riorientare gli assoni in crescita all'interno dell'espianto di midollo spinale dorsale viene valutata mediante immunoistochimica.

Ciao, sono Virginia Hazen del laboratorio di Samantha Butler del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università della California Meridionale. Sono Keith Fun, anch'io del laboratorio Butler. E sono Ken Ya Mai del laboratorio Butler.

Oggi vi mostreremo un procedimento per coltivare innesti spinali dorsali e aggregati di cellule del costo trasfettate in una matrice di collagene. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per saggare la capacità di molecole segnale candidate di orientare i neuroni commissurali spinali. In questo esperimento esamineremo la capacità della proteina morfogenetica delle ossa, o BMP-7, di agire come chemorepellente.

Iniziamo. Preparare aggregati di cellule co utilizzati per mettere alla prova la traiettoria degli assoni commissurali provenienti dalle cellule co. Transfettati con il plasmide di espressione per la molecola di interesse qui, la proteina morfogenetica ossea o BMP7.

Aspirare il mezzo dal piatto e risciacquare le cellule con un millilitro di XPBS 1x. Rimuovere il PBS e trattare le cellule con mezzo millilitro di mezzo di dissociazione cellulare senza enzimi per 15 minuti. Arrestare la reazione aggiungendo un millilitro di mezzo contenente siero bovino fetale.

Utilizzando una punta da pipetta da 1000 microlitri, ripetere l'operazione fino a quando nessuna cellula rimane sulla superficie della piastra di coltura. Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare per due minuti. A 2000 giri al minuto, rimuovere il soprannatante e pipettare su e giù per risospendere le cellule.

In 100 microlitri di mezzo, depositare diverse gocce da 20 microlitri della soluzione cellulare sull'interno del coperchio di una piastra di coltura da 35 millimetri. Chiudere il coperchio sulla piastra e collocare nell'incubatore per diverse ore, in modo da permettere l'aggregazione delle cellule. Per preparare innesti del midollo spinale dorsale, mantenere appena raccolti.

E 11 embrioni di ratto su ghiaccio. In mezzo L 15, con un ago di tungsteno affilato, rimuovere una sezione di quattro-sei segmenti di somiti dalla regione del tronco immediatamente al di sotto dell'abbozzo dell'arto anteriore di ciascun embrione. Utilizzando una pipetta di plastica, raccogliere il tessuto in una pozzetta di una piastra a quattro.

Piastra senza piatto su ghiaccio. Una volta dissecati tutti i segmenti, utilizzare la pipetta per trasferire i pezzi in un secondo pozzetto della piastra senza piatto contenente mezzo L-15 più disco di pasta. Incubare il tessuto a temperatura ambiente per non più di cinque minuti.

Per evitare la morte cellulare, non digerire eccessivamente il tessuto. Aggiungere un millilitro di mezzo L 15 fresco con siero di capra inattivato termicamente al 5% al terzo pozzetto della piastra e trasferire i pezzi di tessuto in questo pozzetto.

Al termine dell'incubazione in spazio dis, lasciare il tessuto in ghiaccio per un'ora. Per facilitare la successiva dissezione in una provetta da microcentrifuga, aggiungere 40 microlitri di mezzo minimo essenziale 10 x a 360 microlitri di collagene. E agitare brevemente al vortex per mescolare, quindi centrifugare in un pico fuge.

La soluzione sarà gialla e dovrebbe essere mantenuta sul ghiaccio il più possibile per evitare che il collagene si solidifichi; per ogni lotto di collagene, titolare con una quantità di bicarbonato di sodio 0,8 M che rende la soluzione di collagene leggermente arancione. Mescolare la soluzione dopo ogni aggiunta. Quando la soluzione di collagene raggiunge questo colore, rimarrà liquida se mantenuta sul ghiaccio, ma sarà pronta a solidificarsi quando portata a temperatura ambiente; se dopo il mescolamento la soluzione diventa rosa, ricominciare con un nuovo tubo di collagene. Aggiungere 20 microlitri di collagene in ciascun pozzetto di una piastra pulita a quattro pozzetti senza mezzo.

Utilizzando la punta della pipetta, distribuire il collagene per formare un piccolo cuscinetto. Lasciare solidificare il collagene a temperatura ambiente per circa 10 minuti. Sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare un ago di tungsteno appena affilato e una pinzetta fine per rimuovere il mesoderma che circonda il midollo spinale da un singolo embrione con l'ago di tungsteno, quindi rimuovere la porzione ventrale del midollo spinale, riconoscibile dalla presenza della lamina del pavimento.

All'estremità più ventrale, la lamina basale è leggermente più spessa della lamina alare all'estremità dorsale. In questo esempio, il midollo spinale è posizionato con il lato ventrale rivolto verso il basso. Tagliare con attenzione il tessuto lavorando parallelamente alla lamina basale e scartare il quinto ventrale del midollo spinale.

Usare l'ago per sezionare verticalmente il midollo spinale dorsale in due parti uguali. Assicurarsi che i bordi siano tagliati nel modo più netto possibile e ritagliarli nuovamente se necessario. Utilizzare una pipetta a bocca dotata di un capillare di vetro con diametro di 0,5 millimetri per trasferire ciascun espian su un cuscinetto di collagene separato.

Con l'ago di tungsteno, tagliare l'aggregato di cellule co trasfettate in quadrati di larghezza approssimativamente uguale a quella del margine laterale del midollo spinale dorsale. Spieg. Utilizzare una pipetta a bocca per trasferire uno dei quadrati sulla piastrina di collagene insieme all'x spieg. Usare la pipetta a bocca per aspirare il liquido in eccesso.

Non aspirare eccessivamente poiché una piccola quantità di liquido sarà utile per l'applicazione successiva del collagene; applicare quattro microlitri di collagene attivato sulla piastrina. Utilizzare l'ago di tungsteno per spostare il collagene sugli impianti senza toccare direttamente il tessuto. Muovendo l'ago all'interno del collagene, orientare ciascun x explan in modo che l'aggregato di cellule co sia adiacente al suo margine laterale.

Lasciare solidificare il collagene per 15-20 minuti. Ripetere il processo di applicazione con altri quattro microlitri di collagene per assicurarsi che l'espianto x sia completamente racchiuso nel collagene prima di passare all'embrione successivo in una cappa a flusso laminare con 0,5 millilitri di mezzo e coltivare per 30-40 ore. In un incubatore in cappa chimica, fissare gli espianti con 0,5 millilitri di soluzione al 4% di paraformaldeide in PBS per 45 minuti. Mantenendo il tessuto sul ghiaccio, lavare due volte con 0,5 millilitri della soluzione di bloccaggio e permeabilizzazione PBTN.

Incubare le espianti di x nella soluzione di blocco a quattro gradi Celsius, preferibilmente durante la notte. Utilizzare pinzette per rimuovere l'espiante X dalla piastra a quattro pozzetti e posizionarne ciascuno in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.

Aggiungere 200 microlitri di anticorpo primario in ogni pozzetto. Per visualizzare gli assoni commissurali, utilizzare l'anticorpo anti-ttag di topo e, per determinare se la trasfezione incrociata tra cellule è avvenuta con successo, includere un anticorpo contro la molecola in esame. Incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Lavare ogni campione con la soluzione di blocco PBTN cinque volte, per un'ora per ogni lavaggio, a quattro gradi Celsius. Rimuovere il PBTN e aggiungere 200 microlitri di anticorpo secondario a ciascun campione. Coprire la piastra con pellicola trasparente per prevenire lo sbiancamento e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Lavare i campioni cinque volte in PBTN come in precedenza. Trasferire ciascun esplantato su una lamella con tre pozzetti. Rimuovere il liquido in eccesso, montare nel mezzo di montaggio Invecta Shield e coprire con un vetrino coprioggetto.

Conservare i vetrini in una cartella o scatola al riparo dalla luce a quattro o meno 20 gradi Celsius fino al momento della visualizzazione al microscopio. Ora mostreremo alcune immagini rappresentative di espianti di X dopo che sono stati coltivati, fissati, colorati e analizzati mediante microscopia confocale. Il pannello A mostra che un espianto di X della lamina tetto, delimitata in bianco, può riorientare gli assoni tag1-positivi della corda lontano da essa, dimostrando che la lamina tetto è la fonte di un chemorepellente assonale. Il pannello B mostra che cellule co che secernono la molecola di segnalazione M tact, la proteina morfogenetica dell'osso o BMP7, possono respingere gli assoni carcerali in modo simile alla lamina tetto.

Gli assoni di cellule che secernono solo il plasmide di espressione non hanno alcun effetto sull'orientamento degli assoni. Vi abbiamo appena mostrato come dissezionare, orientare e coltivare un espianato di midollo spinale e indurre l'aggregazione cellulare, permettendovi di determinare se una molecola segnalatrice candidata possiede attività di riorientamento degli assoni. Quando si esegue questa procedura, è importante mantenere il collagene il più possibile sul ghiaccio e racchiudere completamente l'espianato nel collagene in modo che non venga a contatto diretto con il mezzo di coltura.

E infine, coltivare solo per il tempo necessario affinché gli assoni si estendano fino al margine ventrale dell'esplanato x. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.I.