Name: Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Impara l'assay con perline di fibrina per studiare l'angiogenesi in vitro usando cellule endoteliali umane. Questo metodo permette di visualizzare la formazione di nuovi vasi sanguigni con imaging time-lapse.

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CELLE DI PREPARAZIONE <ol><li> Portare HUVEC e fibroblasti in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 giorni prima della bordatura. </li><li> Passa medio EGM-2 (Clonetics) il giorno prima per bordare HUVEC e il giorno prima di embedding per fibroblasti. </li><li> Una concentrazione di ~ 400 HUVEC al tallone è necessario. </li><li> 20.000 fibroblasti per pozzetto è necessario. </li></ol> RIVESTIMENTO CON LE PERLE HUVEC - GIORNO -1 <ol><li> Trypsinize HUVEC. </li><li> Lasciare perle di stabilirsi (NON CENTRIFUGA!). Aspirare il surnatante e lavare le perline brevemente in 1 ml di caldo EGM-2 di media. </li><li> 2500 perline mix w / 1x10 6 HUVEC in 1,5 mL di caldo EGM-2 di media in un tubo di FACS. Posto verticalmente all&#39;interno dell&#39;incubatore. (Questo sarà sufficiente per circa 10 pozzi. Scala fino, se necessario) </li><li> Incubare per 4 ore a 37 ° C, agitando la provetta ogni 20 min. (Rivestimento Buona è fondamentale per la germinazione.) </li><li> Dopo 4 ore, trasferire le perle rivestite per un pallone T25 in 5 ml di EGM-2 e lasciare O / N. </li></ol> INCASSO PERLE RIVESTITO IN FIBRINA GEL - GIORNO 0 <ol><li> Preparare il mg / ml soluzione di fibrinogeno 2,0 (vedi sezione ricette). </li><li> Aggiungi 0,15 Unità / ml di aprotinina alla soluzione fibrinogeno. </li><li> Trasferimento perle rivestite per un tubo 15 ml conica e lasciate perline stabilirsi. Perline risospendere in 1 ml di EGM-2 e trasferimento in un tubo da centrifuga 1,5 ml. </li><li> Lavare le perle 3 volte con 1 ml di EGM-2 da pipeting su e giù lentamente. </li><li> Contare perle su un vetrino e risospendere in soluzione fibrinogeno ad una concentrazione di circa 500 perline / mL. </li><li> Aggiungi 0,625 Unità / ml di trombina in ciascun pozzetto. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di sospensione fibrinogeno / perla a ciascun pozzetto di una 24-pozzetti. Cambia la punta della pipetta per ogni bene! </li><li> Mescolare la trombina e il fibrinogeno andando su e giù delicatamente con la punta della pipetta ~ 4 a 5 volte. Fare attenzione a non fare bolle di grandi dimensioni. </li><li> Lascia la piastra per 5 minuti nel cofano, poi metterlo nel 37 ° C-incubatore per 10-15 minuti per generare un coagulo. </li><li> In attesa del coagulo, trypsinize fibroblasti. </li><li> Aggiungere 1 ml di EGM-2 per pozzetto goccia a goccia. </li><li> Fibroblasti seme sulla cima di fibrina gel ad una concentrazione di 20.000 cellule per pozzetto. </li></ol> NOTE: Di solito, quando il gel di fibrina si forma, si vedrà bollicine nel gel. Non preoccupatevi, spariranno in 3-4 giorni. Cambiare il supporto a giorni alterni, cioè, Giorno 2, 4, 6, ecc .. Di giorno 3 o 4 si dovrebbe iniziare a vedere germogliare.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

C&#39;è un consenso crescente che tridimensionali (3D) saggi in vitro angiogenesi offrire un modello che è molto più vicino all&#39;ambiente reale in vivo che può essere raggiunto utilizzando culture 2D. È evidente che sistemi 3D superiore dovrebbe essere riproducibile, ed essere in grado di mimare alcuni dei passaggi principali di angiogenesi. Mentre diversi saggi precedenti 3D sono stati sviluppati, molti di questi utilizzare difficili da ottenere cellule microvascolari, o solo ricapitolare alcune delle tappe. In questo video, si descrive...

<table><tbody><tr><td>Perle Cytodex-3</td><td>Reagente</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/flacone. Idratare e gonfiare da 1,0 a 5 g di perle secche in 50 mL di PBS (pH = 7,4) per almeno 3 ore a temperatura ambiente. Utilizzare un tubo da 50 mL e posizionarlo sul rocker. 2. Lasciare sedimentare le perle (~15 min). Rimuovere il soprannatante e lavare le perle per alcuni minuti in PBS fresco (50 mL). 3. Rimuovere il PBS e sostituirlo con PBS fresco: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60.000 perle/mL oppure 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30.000 perle/mL. 4. Collocare la sospensione di perle in un flacone di vetro silanizzato (Windshield Wiper o Sigmacote). 5. Sterilizzare le perle mediante autoclave per 15 min a 115&amp;#x00B0;C. 6. Conservare a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/flacone. Ricostruire l'aprotinina liofilizzata a 4 U/mL in acqua deionizzata. Filtrare in condizioni sterili. Preparare aliquote da 1 mL ciascuna. Conservare a -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogeno Tipo I</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. Sciogliere il fibrinogeno in DPBS a una concentrazione di 2 mg/mL. Nota: verificare la percentuale di proteina coagulabile e regolare di conseguenza. Riscaldare in bagnomaria a 37 &amp;#x00B0;C per sciogliere il fibrinogeno. Mescolare capovolgendo il tubo. Non vortexare. Filtrare in condizioni sterili attraverso un filtro da 0,22 µm.</td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1.000 unità. Ricostruire in acqua sterile a 50 U/mL. Preparare aliquote da 0,5 mL ciascuna. Conservare a -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

ottimizzato fibrina gel bead assay per lo studio della angiogenesi

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

L&#39;angiogenesi è un complesso processo multi-step, dove, in risposta a stimoli angiogenici, vengono creati nuovi vasi da vasi esistenti. Questi passaggi sono: la degradazione della membrana basale, la proliferazione e la migrazione (germogliamento) delle cellule endoteliali (CE) nella matrice extracellulare, l&#39;allineamento della CE in corde, rami, la formazione di lume, anastomosi, e la formazione di una nuova membrana basale. Molti test in vitro sono stati sviluppati per studiare questo processo, ma la maggior parte solo mimare alcune fasi dell&#39;angiogenesi, e morfologicamente i vasi all&#39;interno del test spesso non assomigliano vasi in vivo. Sulla base di un precedente lavoro di Nehls e Drenckhahn, abbiamo ottimizzato un test in vitro che utilizza angiogenesi umano vena ombelicale CE e fibroblasti. Questo modello racchiude in sintesi tutte le fasi fondamentali all&#39;inizio di angiogenesi e, soprattutto, i vasi di visualizzazione brevetto lumen intercellulare circondato da polarizzata CE. CE sono rivestiti su microcarriers cytodex e incorporato in un gel di fibrina. I fibroblasti sono stratificate sulla parte superiore del gel in cui prevedono necessario fattori solubili che favoriscono CE spuntano dalla superficie delle perline. Dopo alcuni giorni, sono presenti numerosi vasi che possono essere facilmente osservati in contrasto di fase e microscopia time-lapse. Questo video illustra i passaggi chiave nella creazione di queste culture.

Questo video dimostra il protocollo di un test in vitro angiogenesi che ricapitola diverse fasi di angiogenesi. Time-lapse immagini di germinazione, formazione lumen, ramificazione e anastomosi - caratteristiche fondamentali di angiogenesi - sono mostrati.

Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

L'angiogenesi è un complesso processo multi-step in cui, in risposta a stimoli angiogenici, nuovi vasi vengono creati a partire dalla vascolarizzazione esistente. Questi ...

Ciao, mi chiamo Mar Katsu. Provengo dal laboratorio Hughes del Dipartimento di Biologia Molecolare e Biochimica della uc Irvine. Eseguirò il saggio del fibrina-bead.L'intero processo richiede due giorni per essere completato. Il primo giorno prevede il rivestimento delle perle con cellule endoteliali venose umbilicali umane o pubiche. Il secondo giorno prevede l'inclusione di queste perle rivestite in gel di fibrina e successivamente il sovrapposizione di fibroblasti su tali gel.Utilizziamo questo saggio per studiare i numerosi passaggi dell'angiogenesi in un contesto in vitro. Il primo giorno, nella parte uno, utilizziamo le microsfere CY X three Beads. Il secondo giorno, invece, impieghiamo questi tre reagenti: fibrinogeno, trombina e aprotinina cytx.I tre tipi di perline provengono da Amazon Biosciences e sono specificamente codificate per il collagene in modo che le cellule endoteliali aderiscano alle perline. Il reagente successivo è il fibrinogeno, che otteniamo da Sigma. Questo costituisce il gel o coagulo effettivo nel saggio con le perline.La trombina è un fattore della coagulazione. Questa proteina converte il fibrinogeno in fibrina, ed è per questo motivo che la aggiungi

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La cascata l'adesione delle piastrine avviene in presenza di flusso di taglio, non un fattore contabilizzati nel convenzionali (statici) ben piastra saggi. Questo articolo riporta una aggregazione delle piastrine-test utilizzando un microfluidica ben piastra formato di emulare fisiologiche condizioni di flusso di taglio.

L&#39;adesione e aggregazione piastrinica in condizioni di flusso utilizzando celle di flusso Microfluidic

Questo video mostra un saggio modificato basato su microsfere di vettore che incorpora periciti per studiare la germinazione endoteliale durante le prime fasi dell'angiogenesi. Il test fornisce un modello sperimentale in vitro per comprendere i meccanismi molecolari dell'angiogenesi e l'effetto delle terapie anti-angiogenetiche.

Saggio di germinazione di perline per la valutazione dell'angiogenesi in fase iniziale: un modello in vitro basato su perline per studiare la germinazione endoteliale in presenza di periciti

La microscopia time-lapse e le tecniche di elaborazione delle immagini sono state utilizzate per osservare e analizzare la compattazione del gel mediata da fibroblasti e il riallineamento della fibra di fibrina in un bioreattore controllato dall'ambiente per un periodo di 48 ore.

Osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti

La ricapitolazione del microambiente organo-specifico, che stimola l'angiogenesi locale, è indispensabile per il successo della rigenerazione dei tessuti danneggiati. Questo rapporto dimostra un nuovo metodo per impiantare gel di fibrina sulla superficie polmonare di topo vivente al fine di esplorare come il microambiente polmonare specifico modula l'angiogenesi e la rigenerazione alveolare nel topo adulto.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Le cellule tumorali vengono incorporate in un gel di collagene e poi inserite in un gel di fibrina acellulare per generare un sistema di coltura 3D in cui l'invasività e la formazione di tumori satelliti possono essere monitorate.

Three-Dimensional Cultura Assay per esplorare Cancer Cell invasività e formazione di tumori Satellite

Questa presenta protocollo una perlina di romanzo in vitro test che più modelli in modo appropriato il processo di in vivo l'angiogenesi di germogliatura incorporando i periciti. Questa modifica consente il dosaggio di perlina di ricapitolare più fedelmente le interazioni cellulari eterotipiche tra cellule endoteliali e cellule murale che sono critiche per l'angiogenesi.

Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa utilizzando tessuti paziente-derivato, chirurgicamente asportato, fibrovascolare per coltura di tessuto nativo tridimensionale caratterizzazione ed ex vivo. Questo ex vivo modello di cultura è inoltre favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa

Questo metodo descrive la coltura delle cellule endoteliali derivate da iPSC come 40 micronavi 3D perfuse in una piattaforma microfluidica standardizzata. Questa piattaforma consente lo studio della germogliazione angiogenica basata su gradienti in 3D, tra cui l'anastomosis e la stabilizzazione dei germogli angiogenici in modo scalabile e ad alta produttività.

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.

Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi

La frazione vascolare stromale (SVF) isolata meccanicamente in combinazione con un idrogel di fibrina offre un vettore facile ed efficiente per cellule stromali vitali di derivazione adiposa per varie indicazioni, tra cui l'ingegneria tissutale e/o la guarigione delle ferite. Qui, presentiamo la preparazione di un costrutto meccanico di SVF (mSVF)-fibrina idrogel per la ricerca traslazionale e l'applicazione clinica.

La combinazione di frazione vascolare stromale isolata meccanicamente e idrogel di fibrina: un protocollo di elaborazione

Qui, presentiamo un protocollo di elettroforesi su gel di fibrinogeno-poliacrilammide (PAGE) per separare e visualizzare rapidamente gli agenti fibrinogenolitici di Sipunculus nudus.

Rapida separazione e visualizzazione di agenti fibrinogenolitici attivi in Sipunculus nudus attraverso l'elettroforesi su gel di fibrinogeno-poliacrilammide

Impara l'assay con perline di fibrina per studiare l'angiogenesi in vitro usando cellule endoteliali umane. Questo metodo permette di visualizzare la formazione di nuovi vasi sanguigni con imaging time-lapse.

Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

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