Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

Ciao, mi chiamo Mar Katsu. Vengo dallo Hughes Lab del Dipartimento di Biologia Molecolare e Biochimica dell'UC Irvine. Eseguirò il test delle perle di fibrina.

L'intero processo richiede due giorni per essere completato. Il primo giorno prevede il rivestimento di perle con cellule endoteliali della vena ombelicale pubica o umana. Il secondo giorno prevede l'incorporazione di queste perle rivestite in gel di fibrina e quindi la stratificazione di fibroblasti sopra questi gel.

Utilizziamo questo test per studiare le numerose fasi dell'angiogenesi in vitro. Il primo giorno della prima parte utilizziamo CY X three Beads. E poi il secondo giorno usiamo questi tre reagenti, fibrinogeno trombina e aprotinina cytx.

Le tre perle sono di Amazon Biosciences e sono particolarmente codificate con il collagene in modo che le cellule endoteliali si attacchino alle perline. Quindi il reagente successivo è il fibrinogeno, e lo otteniamo da sigma. Questo forma il gel o il coagulo vero e proprio nel saggio del battito.

La trombina è un fattore della coagulazione. Questa proteina converte il fibrinogeno in fibrina, quindi è per questo che la aggiungiamo al test. L'aprotinina è un inibitore della proteasi sierica.

Lo usiamo per evitare che le proteasi degradino il gel di fibrina. Quindi quello che vedi qui è vuoto. Queste sono le cellule che utilizziamo per il saggio del battito.

Queste cellule particolari, queste cellule sono a patch tre. Normalmente li usiamo dalla seconda alla tre. Si può vedere che questi heve assumono questa distinta morfologia di ciottoli.

Proprio a questo punto credo che queste cellule siano al cento per cento di cofluenza e vorrai usare queste cellule a questa fluidità. Quindi questo è il primo giorno del nostro test del secondo battito e questo è il modo in cui lo facciamo. Fondamentalmente, voglio solo capovolgere il tubo più volte solo per ottenere i ritmi e le sospensioni in questo modo, e lo farai ogni 20 minuti per quattro ore.

E questo è praticamente tutto. Ok, quindi questo è il secondo giorno del nostro test A b e queste perle sono state appena rivestite con cellule endoteliali. Quello che vedete qui è fondamentalmente un evidenzia la differenza tra una perlina non rivestita e una perlina rivestita da una.

La sinistra è ovviamente una perlina non rivestita. Lo si capisce dalle protuberanze sulla superficie del tallone. La perlina rivestita dovrebbe assomigliare a palline da minigolf.

Si può vedere che è la distribuzione. Le api sono abbastanza uniformi. Non dovresti davvero vedere api che non rivestono.

Potreste, potreste vederne uno o due come quello proprio lì, ma per la maggior parte, la maggioranza, direi che il 99% di essi dovrebbe essere rivestito. Quindi queste sono le api che considerano in un'incubatrice durante la notte. Quello che farò è trasferire il supporto, che contiene alcuni atti, su un tubo conico da 50 mil.

Quindi laverò il FLA per rimuovere le alimentazioni in eccesso che si sono attaccate al fondo del PLA e trasferirò anche loro sul tubo conico. Le perline tendono ad attaccarsi al flaz. Quindi quello che farò è prendere altri cinque mil di EGM two o media e lavare via queste perline bloccate.

Quindi ora trasferirò queste perline di lavaggio nel tubo conico. Quindi, dopo aver trasferito il supporto con le perline nel tubo conale, le perline si sono depositate sul fondo del tubo in circa un paio di minuti. Quindi è difficile da vedere, ma c'è anche un piccolo strato di perline sul fondo di questo.

Quindi ora aspirerò i vecchi media. Ok, quindi ora laverò le perline con un macina da e GM two e poi le trasferirò in un tubo fendor. Quindi quello che sto facendo in questo momento è lavare le perline e tu vuoi stare molto, molto attento perché le perline sono molto fragili.

Quindi vuoi dargli un po' di pepe a una velocità molto bassa. Quindi fallo in questo modo. Lo strato di perline è davvero difficile da vedere però.

Basta dargli un paio di minuti e tutte le perline, ti sistemerai sul fondo. Quindi ora aspirerò il vecchio supporto e lo laverò con un altro mulino di EGM due. E lo farai tre volte.

Non vuoi aspirare tutti i media a questo livello è buono. Quindi, ancora una volta, vuoi convogliarlo su e giù molto lentamente. Quindi questo processo è Devi lavorare velocemente perché quello che farò è prendere un L quad al microfono, 10 litri di microfono della nostra soluzione di perline e trasferirlo sulla copertura di, per contare il numero B per ottenere una concentrazione di perline per mil.

Le perline si depositano rapidamente sul fondo dei due. Quindi devi lavorare velocemente. Ho intenzione di farlo fuori dai media d'oro.

E ancora una volta, dovrai lavorare molto velocemente. Ho anche le mie pipette pronte per l'uso, solo per tutto snello. Ora laverò di nuovo le perline, tubo su e giù molto lentamente. Ok?

E poi, subito dopo, prendi l'altra tua pipa, B 20, aggiungi due microlitri da 10. Quas su un vetrino coprioggetti, quindi ne prendiamo due perché mi piace ottenere una media di gocce sfuse. Abbiamo appena trasferito due dosi di 10 microlitri della nostra soluzione alimentare in questo vetrino coprioggetti.

E questo è un processo nel modo in cui quantifichiamo il numero di perline nel nostro milione di EGM due. Fondamentalmente, conti solo il numero di perline che vedi, e di solito ne faccio due, prendo due quad di alce e calcolo la media dal tubo per ottenere la concentrazione di perline per microlitro. Quindi ho contato un certo numero di perline nel nostro tubo e ho circa un migliaio di perline.

Ho già preparato la mia soluzione friedgen. Contiene anche una proteina in e una concentrazione finale di 0,15 unità per mil. E ho 2,5 mil di friedgen.

Quindi questo ci darà un totale di cinque pozzetti poiché ogni volume di pozzetti è di 500 microlitri. Quindi, per inserire le perle nella soluzione di fibrinogeno, chiederò prima ai media di tasso. Prendo un qu di circa cinque, 600 microlitri del nostro fibrinogeno e lo uso per mescolare e trasferire i battiti nel tubo di fibrinogeno.

Quindi ora quello che vuoi fare è prendere circa 500, 600 microlitri di fibrinogeno e usarlo per mescolare le perle e trasferirle di nuovo nel tubo. Quindi, prima di aggiungere il FibroGen al, beh, si vuole aggiungere prima la trombina. Aggiungi una concentrazione di 0,625 unità per mil e la aggiungerai direttamente al centro di ogni pozzetto.

Quindi ora vedete che ho aggiunto trombina a ciascun pozzetto, e sono direttamente al centro. E ora il prossimo passo sarà l'aggiunta del motore in fibra. Quindi le api, ancora una volta, ricordano di essersi posate sul fondo del tubo piuttosto rapidamente.

Quindi prenderò il mio quad L in fibra, ma prima mescolerò le bestie in questo modo, solo per metterle in soluzioni in modo che si stacchino dal fondo. Sai quando vuoi convogliarlo su e giù lentamente. Quindi questo è il passaggio più importante del protocollo.

Prima di tutto, assicurati di convogliarlo su e giù lentamente mentre aggiungi la fibra al centro e la trombina. Quindi posiziona la punta della pipetta direttamente al centro e pipetta su e giù mentre lo fai. Non si vuole spostare il piatto a tutti perché qualsiasi leggero movimento può effettivamente creare un effetto in cui le perline si raggruppano effettivamente al centro del pozzo.

Vuoi che sia distribuito uniformemente. Pipa su e giù più volte in questo modo, molto lentamente in modo da non creare bolle. Le bolle possono effettivamente ostacolare la visibilità del tuo gel.

Quindi vuoi essere il più lento possibile e non muovere la piastra e cambiare i puntali delle pipette ogni volta che aggiungi fibre ai pozzetti. Lasceremo che questi coaguli si solidifichino per cinque minuti. Trasferiremo quindi questo display dopo cinque minuti all'incubatrice a 37 gradi, altri 10-15 minuti.

Sono passati cinque minuti. La fibra ha formato il coagulo. E quello che faccio di solito è dare una rapida occhiata per vedere se le perline sono distribuite uniformemente e passare da bene a, beh, hai un bell'aspetto.

Ci sono circa, direi 200 perline per pozzo, in media si vuole averne tra le 200 e le 250. Quello che farò ora è inserirlo nell'incubatrice a 37 gradi e incubarlo per circa 10-15 minuti. Quindi queste sono le esplosioni lunghe e lontane che stiamo usando per la co-coltura con il nostro test IC in the beat.

Questo è un pallone confluente. Si nota che i blass hanno una morfologia molto diversa rispetto al beck. Sono più sottili e sembrano quasi delle stringhe.

Quello che facciamo è fondamentalmente ipizzare questo pallone, raccogliere le esplosioni di fuoco polmonare e stratificare 20.000 esplosioni di fuoco per pozzo. Ho appena izzato le esplosioni di fuoco e le ho sospese a una concentrazione di milioni di cellule per mil o mille cellule per microlitro. Ora lo aggiungerò al piatto.

Ho appena tirato fuori il nostro piatto dall'incubatrice. Sono passati dai 10 ai 15 minuti e la fibrina si è formata in un coagulo completo. Ma quello che ora sto per fare è aggiungere un macinatore di EGM due a ciascun pozzetto, e lo farò goccia a goccia perché se si aggiungono i due e GM a ciascuno, beh, troppo velocemente, si potrebbe effettivamente strappare il gel.

Quindi questo fondamentalmente fa un bel passo lento da un pozzo all'altro. Quindi ho appena trinia per sparare esplosioni e le ho contate e ho sospeso le esplosioni di fuoco di solito a una concentrazione di milioni di cellule per mil o mille cellule per microlitro. E quello che farò è prendere 20 microlitri e aggiungerli a ciascun pozzetto.

E mentre lo fai, vuoi cambiare i puntali delle pipette ogni volta. Prendi un'altra qua delle esplosioni di fuoco e aggiungi le esplosioni di fuoco direttamente al centro del pozzo. E ancora, cambio la punta ogni volta che aggiungo esplosioni di fuoco.

Quindi ho appena aggiunto le esplosioni di fuoco sopra il gel di fibrina. E le esplosioni di fibra sono in un mulino di e GM due. Il gel contiene le perline rivestite e puoi effettivamente vedere un paio di perline mentre ci concentriamo sull'aereo.

Dopo un paio di giorni, i blasti di fibre alla fine prolifereranno e migreranno formando un monostrato sopra il gel di fibrina. Un paio di giorni dopo, intorno al terzo o quarto giorno, si inizia a vedere dei bei germogli che escono dalle perline. Quindi ho appena finito di eseguire il saggio delle perle di fibrina e, per ricapitolare, quello che abbiamo fatto è stato codificare le cellule endosaal su perline e incorporare queste perle e nei gel di fibrina e poi stratificarle sopra questi gel.

Così, nei tre o quattro giorni successivi, abbiamo iniziato a vedere dei bei germogli che uscivano da queste perline. E quello che mi piace davvero di questi protocolli video è che gli spettatori possono effettivamente visualizzare questi passaggi che non si possono davvero trasmettere attraverso il protocollo scritto. Quindi quello che spero che gli spettatori vedano in questi, in questi video è che saranno in grado di eseguire con successo questi fi BTA SC nel proprio laboratorio.