Identificazione dei fenotipi inibizione della crescita indotta da Espressione di effettori batterica di tipo III nel lievito

Per iniziare questo protocollo, seleziona un vettore per l'espressione del tuo effettore batterico preferito. Nel lievito e nel ceppo di lievito, il vettore viene quindi trasformato in cellule di lievito. Viene indotta l'espressione successiva dell'effettore.

Le cellule indotte vengono lisate per la successiva analisi western blot per verificare l'espressione dell'effettore. Dopo aver confermato l'espressione delle cellule effettrici, le cellule vengono coltivate e decuplicate, le diluizioni seriali vengono individuate sui terreni di repressione e indottrice. Infine, dopo due o tre giorni, viene analizzata la crescita del lievito.

Ciao, sono Do Solomon del laboratorio del Dr.Guido Cesa presso il Dipartimento di Scienze Vegetali dell'Università di Tel Aviv. Oggi vi mostreremo una procedura per l'identificazione dei fenotipi di inibizione della crescita indotti dall'espressione di effettori batterici di tipo tre nel lievito. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la funzione degli effettori di tipo tre da batteri patogeni gram-negativi ed è uno strumento che ci aiuta nell'identificazione dei bersagli TIC effettori.

Quindi iniziamo. Diversi fattori importanti dovrebbero essere considerati e ottimizzati quando si progetta un sistema di lievito appropriato per l'espressione degli effettori di tipo tre di interesse. Il primo è il promotore che guida l'espressione degli effettori.

Poiché gli effettori batterici di tipo tre possono essere tossici per le cellule di lievito, dovrebbe essere utilizzato un promotore inducibile per controllarne l'espressione. In questo esperimento utilizzeremo il promotore GAL one. Il secondo fattore è il numero di copie del gene effettore.

Alti livelli di espressione si ottengono quando il gene effettore è trasportato da un plasmide di due micron. L'espressione intermedia si ottiene utilizzando un centromero contenente plasmide e si ottiene una bassa espressione quando il gene effettore viene integrato nel genoma del lievito mediante ricombinazione omologa. Un terzo fattore da considerare è l'epitopo tag utilizzato per verificare l'espressione proteica nei casi in cui gli anticorpi contro l'effettore di interesse non sono disponibili.

I tag comunemente usati sono M, emoagglutinina, HA o flag per i quali sono disponibili anticorpi commerciali affidabili. Si consiglia di utilizzare una sola copia del tag per ridurre al minimo gli effetti deleteri indesiderati sulla struttura e l'attività della proteina effettrice. Ultimo ma non meno importante, il ceppo di lievito da utilizzare per l'espressione deve essere tropicale rispetto al marcatore selezionabile del vettore di espressione.

Per far crescere le cellule di lievito per la trasformazione, prelevare una colonia di lievito da una piastra fresca e inoculare tre millilitri di YPD in un vortice di tubi di polipropilene da 15 millilitri. Posizionare brevemente la provetta di coltura in un rullo e incubare per una notte a 30 gradi Celsius con rotazione costante. La mattina successiva, togliere la coltura dal rullo e centrifugare a 800 G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, rimuovere completamente il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di tampone di sospensione Resus miscelato mediante vorticing alla massima velocità per circa 10 secondi. Per ogni plasmide da trasformare e per un'ulteriore trasformazione di controllo, trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in un tubo per microfuge. Aggiungere cinque microlitri di sperma di salmone a filamento singolo, DNA e da 250 a 500 nanogrammi di DNA plasmatico a ciascuna provetta, ad eccezione della provetta di controllo.

Quindi, aggiungere con cautela 650 microlitri di soluzione di trasformazione a ciascun tubo e vortice. Incubare le provette a 30 gradi Celsius per 30 minuti su un rullo. Al termine dell'incubazione, aggiungere 70 microlitri di DMSO a ciascuna provetta e mescolare capovolgendo le provette da 10 a 15 volte per evitare di rompere le cellule.

Non agitare i tubi. Mettere le provette in un bagno d'acqua preriscaldata a 42 gradi Celsius e incubare per 15 minuti. Dopo 15 minuti, togliere i tubi dal bagnomaria e metterli immediatamente sul ghiaccio per due minuti.

Una volta che le provette si sono raffreddate, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, quindi utilizzare un pipettatore per rimuovere con cura il surnatante viscoso. Risospendere ogni pellet in 150 microlitri di acqua sterile a doppia distillazione e stendere la sospensione cellulare su una piastra con l'apposito mezzo selettivo. Lasciare le piastre aperte per due minuti e lasciarle asciugare in una cappa a flusso laminare.

Successivamente, metti le piastre in un incubatore a 30 gradi Celsius per due o tre giorni per far crescere le cellule di lievito. Per preparare un estratto proteico, inoculare tre millilitri del terreno di repressione appropriato con colonia di lievito da un piatto fresco e vortice. Posizionare brevemente la provetta di coltura in un rullo a 30 gradi Celsius il giorno successivo.

Togliere la coltura dal rullo e centrifugare a 800 Gs per cinque minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare. In tre millilitri di DDW sterile miscelato con centrifuga vortexing, di nuovo, scartare il surnatante e risospendere le cellule in tre millilitri di DDW sterile. Trasferire ora 200 microlitri della sospensione cellulare in una nuova provetta da 15 millilitri contenente tre millilitri del mezzo induttore appropriato miscelato mediante vortex.

Posizionare la provetta in un rullo e incubare per una notte a 30 gradi Celsius la mattina seguente. Trasferire un millilitro o più della coltura per colture a bassa densità in una provetta per microcentrifuga. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 800 Gs per cinque minuti a temperatura ambiente, da qui in poi lavorare in una cappa aspirante per evitare di respirare i vapori tossici dell'etanolo Beamer capto.

Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando un pipettatore e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione di lisi ghiacciata. Mescolare energicamente vorticando e incubare con ghiaccio per 30 minuti. Durante l'incubazione di 30 minuti, determinare il volume di sei acido cloridrico normale necessario per titterare 100 microlitri di tampone di lisi a pH da nove a 10.

Per fare ciò, aggiungere vari volumi di acido cloridrico a 100 microlitri di tampone di lisi in 10 diverse provette, e controllare il pH della soluzione utilizzando una striscia indicatrice di pH alla fine dell'incubazione al volume appropriato di acido cloridrico al lisato e mescolare a vortici. Quindi aggiungere 50 microlitri di tre tamponi campione al lisato e mescolare a vortice, praticare un foro nel coperchio del tubo micro fuge con un ago e far bollire la soluzione di lisato sul blocco riscaldante per cinque minuti. Dopo l'ebollizione, lasciare raffreddare la soluzione per due minuti a temperatura ambiente.

Quindi agitare la soluzione di lisato e farla girare per 10 secondi. Il lisato è ora pronto per l'analisi immunologica del sangue per preparare le cellule per il test di spotting. Coltiva tre millilitri di colture di ogni ceppo come mostrato in precedenza il giorno successivo.

Preparare due piastre contenenti terreno completo sintetico senza leucina. Il terreno di una piastra deve essere integrato con il 2% di glucosio e quello dell'altra piastra con il 2% di actosio e l'1% di raffinosio. Asciugare le piastre in una cappa sterile a flusso laminare a temperatura ambiente per 20 minuti.

Raccogliere le cellule e risospendere ogni pellet cellulare in tre millilitri di DDW sterile. Ripetere la fase di centrifugazione e risospendere nuovamente le cellule in tre millilitri di DDW sterile. Determinare la densità ottica o OD di ciascuna coltura, quindi preparare sospensioni cellulari da un millilitro con un OD 600 di uno in provette sterili per microfiche.

Successivamente, preparare tre diluizioni seriali decuplicate da ciascuna delle sospensioni cellulari utilizzando tre microprovette sterili riempite con 900 microlitri di DDW sterile. Posizionare le piastre asciutte su una griglia e per ogni punto di coltura, 10 microlitri dalle quattro diluizioni di seguito. Dopo la smacchiatura, lasciare le piastre aperte nella cappa per alcuni minuti.

Quando le macchie sono asciutte, copri i piatti e mettili in un'incubatrice a 30 gradi Celsius per due o tre giorni. Ora mostreremo i risultati di un saggio di spotting del lievito per il rilevamento dell'inibizione della crescita. Fenotipi indotti dall'espressione di effettori di tipo tre qui, gli effettori di tipo tre, A-V-R-P-T-O hop, AA uno e AAV RE uno del batterio.

Il percorso di Pseudomona Riner del nostro pomodoro è stato espresso da un centromero contenente plasmide in un ceppo di lievito su ceppi di lievito medi reprimenti che trasportano plasmidi per l'espressione di A-V-R-P-T-O e HOP AA, uno dei quali ha mostrato una crescita simile a quella del ceppo di controllo contenente un vettore vuoto. Mentre il lievito che trasporta AAV RE one ha mostrato una crescita leggermente ridotta, probabilmente a causa della perdita del promotore GAL one e dell'elevata citotossicità di AV RE one, in condizioni induttive l'espressione di AV E one o HOP AA one ha causato un drastico fenotipo di inibizione della crescita riflesso dalla mancanza di colonie in qualsiasi diluizione. Al contrario, l'espressione di A-V-R-P-T-O non ha esercitato alcun effetto inibitorio della crescita.

Abbiamo appena mostrato come identificare i fenotipi di inibizione della crescita causati dall'espressione di effettori batterici di tipo tre nel lievito. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di scegliere con cura il vettore di espressione e questo ceppo, poiché entrambi possono influenzare notevolmente i risultati. Inoltre, ricordati di utilizzare queste colonie appena trasformate in tutte le fasi della procedura.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.