Name: Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine di fusione per limaging cellulare dal vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Impara l'etichettatura fluorescente di proteine SNAP-tag in cellule COS-7 vive per l'imaging cellulare. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale della localizzazione proteica senza clonaggi ripetuti.

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Kai Johnsson Ivan Correa Andreas Brecht Katrin Müentener Chris Noren Luo Dom Ming Xu Theodore Davis Salvatore Russello Aihua Zhang Inca Ghosh Elissa Maunus Nicholas Labarthe James MacFarland John Buswell Brenda Desmond James Ellard Don Pettine

Placcatura cellule CHO-K1: <ol><li> Aggiungi 50-100μl di cellule CHO-K1 che sono stati trypsinized secondo protocolli standard a 6 ml di completo F-12K. </li><li> Mescolare sospensione cellulare pipettando su e giù parecchie volte, poi aliquota 300 ml di sospensione cellulare trypsinized a ciascun pozzetto di una camera sterile 8-Lab-Tek II Chambered vetrino con # 1.5 borosilicato coprioggetti camere (Nalgene Int. Nunc;. Prodotto # 155409; Lotto: 100808-8-0). </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO 2 durante la notte. </li></ol> Trasfezione transiente di cellule CHO-K1 con pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B: <ol><li> Controllare le camere di coltura cellulare seminato il giorno precedente a cercare la densità delle cellule e la salute. </li><li> Etichettare il numero adeguato di appositi tubi microcentrifuga. </li><li> In una cappa a flusso laminare, istituito miscele complesse di trasfezione in base alla tabella di esempio, utilizzando 0,3 mcg pSNAP-ADBR2 DNA plasmidi di controllo o di 0,3 mcg di pSNAP-H2B DNA di controllo plasmidi, 1 l di D2 TransPass e 1 ml di TransPass V per reazione. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plasmide </td><td> numero di reazioni </td><td> ml di mezzo privo di siero </td><td> l di D2 TransPass </td><td> l di TransPass V </td><td> l di DNA plasmidico </td><td> l di D2/reaction TransPass </td><td> l di TransPass V / reazione </td><td> ng di DNA / reazione </td><td> DNA conc. (Ng / mL) </td><td> l di DNA plasmidico / reazione </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Finto </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> In primo luogo, mescolare il siero libero F-12K con il DNA plasmidico appropriata, quindi aggiungere il D2 Transfection Reagent TransPass, quindi aggiungere il Transfection TransPass V reagente. Miscelare i componenti ben pipettando su e giù delicatamente più volte dopo l'aggiunta di ogni reagente. </li><li> Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Durante l'incubazione, lavare le cellule una volta con 600 ml di DMEM completo ed aggiungere 450 ml di DMEM completo di ogni campione. </li><li> Aggiungere 50 ml di miscela di trasfezione complesso per ogni campione, lentamente e in una goccia a goccia moda. </li><li> Incubare i campioni durante la notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> SNAP-Cell Stella Etichettatura TMR di CHO-K1 cellule trasfettate transitoriamente con pSNAP-ADRB2 e pSNAP-H2B: <ol><li> Rimuovere con attenzione i media trasfezione complesso da ciascun campione di aspirazione. Lavare le cellule due volte con 600 ml di completo F-12K e sostituire il supporto in ogni pozzetto con 600 ml di completo F-12K. </li><li> Media mix etichettatura tintura con l'aggiunta di 995 ml di completo F-12K e 51 microlitri 0,6 mm SNAP-Cell TMR-Star substrato. La concentrazione finale di SNAP-Cell TMR-Star dovrebbe essere 3 mm. Pipetta su e giù parecchie volte per mescolare dopo l'aggiunta del substrato. </li><li> Rimuovere con attenzione la crescita dei media da campioni e aggiungere 200 ml di etichettatura dei media colorante in ciascun pozzetto. Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO 2 per 30 minuti. </li><li> Mentre i campioni sono incubazione preparare Hoechst 33342 soluzione per la colorazione nucleare dei campioni mescolando 1 ml di Hoechst 33342, trihydrochloride, triidrato (10 mg / ml di soluzione in acqua, soluzione 16,2 mM; Probes Invitrogen Molecolare) in 10 ml di completo F-12K . </li><li> Rimuovere il supporto da tutti i campioni e aggiungere 600 microlitri della soluzione diluita Hoechst per ogni campione. Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO 2 per 5 minuti. </li><li> Lavare i campioni per tre volte con 600 ml di completo F-12K. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C, 5% di CO 2 per ulteriori 30 minuti per permettere fluoroforo prive di personalità giuridica di diffondere fuori delle cellule. </li><li> Dopo 30 minuti, cambiare i mezzi di comunicazione sul SNAP-Cell campioni un'ultima volta e procedere con l'imaging. </li><li> Immagine le cellule utilizzando un Apotome Zeiss Axiovert 200M microscopio a fluorescenza. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Qui ci sonoalcuni risultati rappresentativi di imaging a fluorescenza con un microscopio a fluorescenza di vivere cellule COS-7 che esprimono SNAP-tag fusioni. Questa prima immagine mostra dal vivo COS-7 cellule che esprimono pSNAP-H2B (nucleare istoni) marcato con SNAP-Cell TMR-Star. Il pSNAP-H2B costruzione è stata generata utilizzando le pSNAP-tag (m) vettoriale. Le cellule sono state etichettate con SNAP-Cell TMR-Star per 30 minuti e di contrasto con Hoechst 33342 (blu) per i nuclei. La fluorescenza rosa dimostra la sovrapposizione di fluorescenza rossa dove proteina istone è presente oltre alla fluorescenza blu che indica il nucleo. L'espressione della proteina H2B è chiaramente e facilmente identificabile. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figure 2 e 3. Le prossime due immagini mostrano dal vivo cellule COS-7 transfettate con transitoriamente pSNAP-ADRβ2. Le cellule sono state etichettate con SNAP-Cell TMR-Star (rosso) e di contrasto con Hoechst 33342 (blu). Il pSNAP-ADRβ2 costruzione è stata generata utilizzando le pSNAP-tag (m) vettoriale. Le cellule sono state etichettate con SNAP-Cell TMR-Star per 30 minuti e di contrasto con Hoechst 33342 (blu) per i nuclei. La fluorescenza rossa indica la presenza di ADRB2 recettore sulla superficie cellulare di proteine, mentre la fluorescenza blu identifica il nucleo.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

Gli autori sono impiegati da New England Biolabs che produce i reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Ci sono diverse variabili influenzano i risultati osservati, come messa a fuoco, l&#39;intensità del laser, capacità delle apparecchiature, obiettivo utilizzato, ecc fotostabilità del fluoroforo determina la velocità di fluorescenza deve essere catturato prima di svanire. Questo metodo di etichettatura delle proteine ​​è versatile e adatto per molte applicazioni. Tecnologie SNAP-tag e CLIP-tag per l&#39;etichettatura specifica di proteine ​​di fusione con sonde sintetiche consentono vari aspetti della funzione della proteina, tra cui una varietà di processi dinamici in cellule vive e in lisati cellulari. SNAP-,-CLIP, MCP-e ACP-tag tecnologie offrono versatilità e semplicità straordinaria per l&#39;imaging di proteine ​​in cellule vive e fissi e allo studio delle proteine ​​in vitro. La creazione di un costrutto singolo gene produce una proteina di fusione con tag in grado di formare un legame covalente a una varietà di gruppi funzionali, tra cui fluorofori, biotina, o perline. La proteina di interesse deve essere clonato ed espresso una sola volta e poi la fusione può essere utilizzata con una varietà di substrati fluorescenti per numerose applicazioni a valle come l&#39;etichettatura proteina simultanea all&#39;interno delle cellule vive, la localizzazione delle proteine ​​e la traslocazione, pulse-chase esperimenti, studi di internalizzazione del recettore , selettivo etichettatura superficie cellulare, la proteina abbattere analisi, la rilevazione delle proteine ​​in SDS-PAGE, citometria a flusso, analisi di legame high-throughput in micropiastre, esperimenti di interazione biosensore, e saggi di binding FRET-based.

<table><tbody><tr><td>Cellule CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>F-12K senza siero</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Chambered Coverglass con camere in vetro borosilicato #1.5</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lotto: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, triidrocloruro, triidrato (soluzione 10 mg/ml in acqua, soluzione 16,2 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente Zeiss Apotome Axiovert 200M</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plasmide di controllo pSNAP-ADBR2</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>Plasmide di controllo pSNAP-H2B</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

etichettatura fluorescente di cos-7 esprimendo snap-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Questi sistemi offrono una vasta gamma di substrati fluorescenti ottimizzato per una vasta gamma di strumenti di imaging. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo. Ci sono due passi a utilizzare questo sistema: la clonazione e l&#39;espressione della proteina di interesse come SNAP-tag di fusione, e l&#39;etichettatura della fusione con la SNAP-tag substrato di scelta. Lo SNAP-tag è una piccola proteina umana sulla base di O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), una proteina di riparazione del DNA. SNAP-tag le etichette sono coloranti coniugati con guanina o chloropyrimidine gruppi lasciando tramite un linker benzilico. Nella reazione di etichettatura, il gruppo sostituito benzilico del substrato è covalentemente attaccato al SNAP-tag. CLIP-tag è una versione modificata di SNAP-tag, progettato per reagire con benzylcytosine piuttosto che derivati ​​benzylguanine. Quando utilizzato in combinazione con SNAP-tag, CLIP-tag permette l&#39;etichettatura ortogonale e complementare di due proteine ​​contemporaneamente nelle stesse cellule.

SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

I sistemi di marcatura proteica SNAP-tag e CLIP-tag consentono il legame covalente e specifico di molecole, inclusi i coloranti fluorescenti, a una proteina di interesse...

Etichetta SNAP e etichetta clip. I sistemi di marcatura proteica consentono l'attacco covalente specifico di praticamente qualsiasi molecola a una proteina di interesse. Il gene di interesse può essere clonato nel vettore su entrambi i lati dell'etichetta; l'espressione del gene clonato produce una proteina di fusione con l'etichetta SNAP.Il substrato del SNAP-tag è composto da due parti: il benzo guanina, che viene riconosciuto dal SNAP-tag, e il gruppo funzionale. Il gruppo funzionale può essere biotina, una microsfera o un gruppo fluorescente, disponibili in una varietà di colori. Durante la reazione di marcatura, il gruppo benzo sostituito si lega covalentemente al SNAP-tag, liberando guanina. Se un fluorocromo quattro è accoppiato alla proteina desiderata, il marcatore emette fluorescenza, permettendo la visualizzazione della proteina in cellule vive o fissate.Ciao, sono Chris Provost di New England Bile Labs. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'immagine fluorescente di cellule COS sette vive che esprimono proteine di fusione con il marcatore Snap. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la localizzazione delle proteine all'interno delle cellule.Cominciamo. Per preparare le cellule COS-7 per la trasfezione, trattarle con tripsina e raffreddarle secondo protocolli standard, quindi aggiungere da 50 a 100 microlitri di cellule a sei millilitri di mezzo DMEM completo. Mescolare la sospensione cellulare aspirando e dispensando più volte con una pipetta. Successivamente, aliquotare 300 microlitri di sospensione cellulare trattata con tripsina in ogni pozzetto di una piastra sterile con otto camere, dotata di coprivetrino a doppia camera, e incubare i campioni a 37 gradi Celsius, con 5% di anidride carbonica, durante la notte. Il giorno seguente,Verificare la densità cellulare e lo stato di salute delle camere di coltura cellulare. Etichettare il numero appropriato di provette microcentrifuga per le miscele dei complessi di trasfezione. In una cappa a flusso laminare.Preparare le miscele di complessi di trasfezione per ogni reazione. Utilizzare 0,3 microgrammi di DNA plasmidico di fusione snap diluiti in mezzo privo di siero e un microlitro. Ciascuno dei plasmidi di controllo dei reagenti di trasfezione TPA D due e TPA v è disponibile per saggiare l'efficacia dei reagenti di trasfezione.Si consiglia inoltre di includere un campione transfettato con finto trattamento e/o un campione non resecato come controlli negativi per ogni miscela complessa. Per prima cosa, mescolare il DMEM privo di siero con il DNA plasmatico appropriato. Quindi aggiungere il reagente di trasfezione TPAs D due, seguito dal reagente di trasfezione TPAs v.Mescolare bene i componenti aspirando e dispensando delicatamente più volte dopo l'aggiunta di ogni reagente e incubare le reazioni a temperatura ambiente per 30 minuti. Durante l'incubazione, lavare le cellule una volta con 600 microlitri di DMEM completo e aggiungere 450 microlitri di DMEM completo a ogni campione. Al termine dell'incubazione, aggiungere lentamente, goccia a goccia, 50 microlitri della miscela del complesso di trasfezione a ciascun campione. Incubare i campioni tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica.Il giorno successivo. Le cellule cost trasfettate possono essere marcate con il substrato SNAP-cell TMR Star per iniziare questa procedura: aggiungere 50 microlitri di DMSO al substrato SNAP-cell TMR Star e mescolare pipettando su e giù, quindi vortexare per un minuto. Successivamente, rimuovere con attenzione il mezzo contenente i complessi di trasfezione da ogni campione mediante aspirazione a vuoto e lavare le cellule due volte con 600 microlitri di DMEM completo.Quindi sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 600 microlitri di DMEM completo. Rimettere i campioni nell'incubatore. Preparare il mezzo di marcatura D aggiungendo 995 microlitri di DMEM completo e cinque microlitri di 0,6 millimolare.Pipettare su e gi&ugrave; ripetutamente il substrato Snap Cell TMR STAR per miscelare dopo l'aggiunta del substrato. La concentrazione finale di Snap Cell TMR STAR dovrebbe essere di tre micromoli. Rimuovere con attenzione il mezzo di crescita dai campioni e aggiungere 200 microlitri di mezzo di marcatura DIA in ogni pozzetto; incubare i campioni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 30 minuti. &Egrave; in questo passaggio che il gruppo benzilico sul substrato TMR si legher&agrave; covalentemente al SNAP-tag e rilascer&agrave; il quencher mentre i campioni sono in incubazione.Preparare la soluzione di HX per la colorazione nucleare dei campioni. Mescolare un microlitro di TRI Cloridrato Triidrato 3 33 42 HSED in 10 millilitri di DMEM completo. Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo di marcatura da tutti i campioni e aggiungere 600 microlitri della soluzione di HX diluita a ciascun campione.Incubare i campioni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per cinque minuti. Dopo cinque minuti, rimuovere la soluzione diluita con gancio da ogni campione e lavare i campioni tre volte con 600 microlitri di DMEM completo. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 600 microlitri di DMEM completo a ogni campione.Incubare i campioni a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per ulteriori 30 minuti per consentire al fluoruro non incorporato di diffondere fuori dalle cellule, come richiesto per l'etichettatura intracellulare. Dopo 30 minuti, sostituire il mezzo sui campioni di cellule snap per l'ultima volta con 600 microlitri di DMEM completo. Le cellule sono ora pronte per l'analisi mediante microscopio fluorescente Zeis AOME Vert 200 M.Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi di imaging fluorescente ottenuti mediante microscopia fluorescente standard su cellule CO sette vive che esprimono fusioni con marcatori. Questa prima immagine mostra cellule COS sette vive che esprimono PNAP H two B marcate con SNAP-Cell TMR Star. La costruzione di PNAP H two B è stata ottenuta utilizzando il vettore PNAP TAG M.Le cellule sono state marcate con Snap Cell TMR Star per 30 minuti e controcolorate con Hoechst 33342 per i nuclei. La fluorescenza rosa indica la sovrapposizione della fluorescenza rossa dove è presente la proteina istonica. Oltre alla fluorescenza blu che indica il nucleo, l'espressione della proteina H2B è chiaramente ed facilmente identificabile.Queste due immagini successive mostrano cellule cost seven vive transfectate in modo transitorio con pnap. Alcune cellule A DR beta due sono state marcate con snap cell, tmr, star e controcolorate con HUX 3 33 42. Il costrutto pnap A DR beta due &egrave; stato generato utilizzando il vettore PNAP TAG M.Le cellule sono state marcate con Snap Cell TMR Star per 30 minuti e controstainate con Hoechst 33342 per i nuclei. La fluorescenza rossa indica la presenza della proteina del recettore di superficie cellulare A DR beta due, mentre la fluorescenza blu identifica il nucleo. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'immagine fluorescente di cellule vive di tipo cough seven che esprimono proteine di fusione con il tag snap.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di aggiungere il complesso di trasfezione lentamente e in modo goccia a goccia e di conservare il substrato del snap tag a meno 20 gradi Celsius al buio quando non è in uso. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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